CN105936936A - 一种猕猴桃花粉中Psa的检测方法 - Google Patents

一种猕猴桃花粉中Psa的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种猕猴桃花粉中Psa的检测方法，提取花粉混合菌悬液DNA，用根据猴桃Psa的hrpW基因设计两对引特异性引物，进行巢式PCR，从花粉样品中扩增获得大小为590bp左右的外引物扩增和240bp左右的内引物扩增条带，经测序验证为Psa，本发明检测灵敏度为103cfu/mL，本发明建立了特异性更强、稳定性更高、灵敏度较高的Psa快速检测方法，不仅能够区分Pseudomonas syringae pv.Theae、Pseudomonas avellanae等与Psa亲缘关系较近的病原菌，也能区分致病能力弱的Psa，减少了假阳性的出现。

Description

一种猕猴桃花粉中Psa的检测方法
技术领域
本发明涉及果蔬病害检测技术领域，具体涉及一种猕猴桃花粉中Psa的检测方法。
背景技术
近年来猕猴桃溃疡病(kiwifruit bacterial canker)的大面积爆发导致猕猴桃产量下降，严重影响产业发展。猕猴桃溃疡病是由丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syingae pv.actinidiae，Psa)引起的细菌性病害。病原菌借助昆虫、风雨等自然条件，自主侵染猕猴桃植株的嫩芽、枝条的落叶痕、新生的分叉、叶片的皮孔、气孔等或营养较差的以上组织，随后扩散入果树各枝蔓造成整棵植株染病；或通过修剪伤口、冻裂伤口进行传播。
Gallelli.A等(2011)通过分子检测技术发现意大利的猕猴桃花粉中存在溃疡病病原菌；Stefani.E等(2011)也从花粉中检测到Psa的存在，认为花粉是导致猕猴桃溃疡病传播的主要原因之一，新西兰学者认为新西兰目前大规模流行的PSA-V(强致病力菌株)病原菌是由于进口国外带菌花粉而引进的。Psa的检测主要是采用传统的检测技术，但传统方法费时费力，而且特异性不高。近几年一些基于PCR的分子检测方法已经建立起来，这些分子检测方法更加快速，而且特异性更高。但由于Psa与其同属的(Pseudomonas syringae pv.Theae)及(Pseudomonas avellanae)亲缘关系非常近，常规的分子标记技术很难将它们区分开，而且Psa本身的遗传多样性也非常丰富。世界Psa主要分为三大类群，我国流行的猕猴桃溃疡病的Psa与最近在意大利、新西兰、西班牙、法国、葡萄牙等主要猕猴桃园流行的Psa为同一类群。通过一些学者的研究发现使用普通PCR检测Psa易出现假阳性或假阴性。由Psa引起的猕猴桃溃疡病是一种毁灭性的细菌性病害，一旦果树发病没有有效的药剂可以医治。因此研究出花粉中Psa的检测方法，对控制猕猴桃花粉中Psa的传播具有重要意义。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种猕猴桃花粉中Psa的检测方法，降低检测成本，提高检测效率。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种猕猴桃花粉中Psa的检测方法，包括以下处理步骤：
a)根据猕猴桃优势Psa靶基因设计巢氏PCR引物；
b)进行猕猴桃花粉Psa的培养富集；
c)提取花粉菌悬液中Psa的DNA；
d)进行巢氏PCR扩增；
e)对PCR产物进行电泳检测。
进一步，所述步骤a)巢氏PCR引物是根据猕猴桃溃疡病优势病原菌Psa的hrpw基因的保守序列设计的，外引物、内引物的扩增长度分别为590、240bp。
进一步，所述步骤b)猕猴桃花粉Psa的培养富集方法为：称取猕猴桃花粉0.01g，加入装有15mL已高压灭菌并冷却的金氏B液体培养基的玻璃试管中，棉塞封口，于恒温震荡培养箱中24℃、180r/min培养12h后，4℃保存待用。
进一步，所述的步骤c)提取花粉菌悬液中Psa的DNA方法为：取1mL过夜培养的菌悬液于1.5mL离心管中，室温，11,000rpm离心1min，弃上清液，收集菌体；将收集的菌体加入1mL灭菌ddH2O反复吸打，洗涤菌体，11,000rpm离心1min，弃上清液，重复洗涤一次，取100μL灭菌ddH2O，反复吸打，溶解沉淀，于100℃水浴15min，水浴后立即置于冰上冷却3min，8,000rpm离心1min，取上清液，-20℃保存备用。
进一步，所述的步骤d)巢氏PCR扩增体系为：总体积25μL，其中2×PCR Master12.5μL，10μmol/L的上游引物1μL，10μmol/L的下游引物1μL；DNA模板1μL；ddH2O 9.5μL；其中外引物扩增所用DNA模板为花粉菌悬液中Psa DNA，内引物扩增所用DNA模板为外引物扩增的PCR产物稀释50倍。
进一步，所述的步骤d)巢氏PCR扩增程序为：首先94℃变性5min；其次进行35个循环反应，包括94℃变性10sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min；最后72℃延伸10min，4℃保温。
进一步，所述的步骤e)PCR产物电泳检测方法为：PCR反应结束后，取5μLPCR产物点样于1％的琼脂糖凝胶中，选用2000bp DNA Marker；电泳选用1×TAE缓冲液，条件为：电压100V，电流60mA，电泳25min，电泳结束后在凝胶成像系统上检测并拍照。。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
根据猕猴桃优势Psa的hrpw基因设计巢氏PCR引物，进行检测能区分与Psa亲缘关系非常近的Pseudomonas syringae pv.Theae及Pseudomonas avellanae，减少假阳性的出现；巢氏PCR扩增既能增强检测的特异性，也能增强检测的灵敏度；猕猴桃花粉Psa的培养富集仅需4-12h，加上巢氏PCR扩增，检测时间只需要18h，而常规的Psa培养鉴定检测需要3-7天；花粉菌悬液中Psa DNA的提取采用热裂解法，不仅可以降低检测成本，而且可以实现大量样本同时操作，大大提高检测效率。
附图说明
图1是陕西猕猴桃Psa及相近病原菌hrpW基因巢式PCR扩增电泳图；
图2是猕猴桃Psa检测灵敏度电泳图；
图3是猕猴桃花粉Psa巢式PCR外引物扩增检测电泳图；
图4是猕猴桃花粉Psa巢式PCR内引物扩增检测电泳图
具体实施方式
下面通过实施例，对本发明作进一步的说明，但本发明并不限于以下实施例。
本发明猕猴桃花粉中Psa快速检测的方法，具体包括以下处理步骤：
一种猕猴桃花粉中Psa的检测方法，猕猴桃花粉Psa的富集培养，提取花粉混合菌悬液的DNA，用巢氏PCR扩增，PCR产物电泳，外引物扩增出现590bp条带、内引物扩增出现240bp条带为阳性。
进一步，具体包括以下处理步骤：
a)根据陕西猕猴桃优势Psa靶基因设计巢氏PCR引物；
b)猕猴桃花粉Psa的培养富集；
c)花粉菌悬液中Psa DNA的提取；
d)巢氏PCR扩增；
e)PCR产物电泳检测。
以下通过具体实施例和对比例对本发明内容和效果进行说明。
实施例一
猕猴桃Psa巢氏PCR检测方法建立
(1)猕猴桃Psa及Pseudomonas syringae pv.tomato、Pseudomonas syringaepv.Theae、Pseudomonas avellanae培养：猕猴桃Psa用King’B液体培养基培养，
(2)病原菌DNA提取：采用Ezup柱式基因组DNA抽提试剂盒(细菌)提取目的DNA。
(3)引物设计：根据陕西猕猴桃溃疡病优势病原菌Psa的hrpw基因设计两对引物，外、内引物扩增参考序列分别为590bp、240bp。
猕猴桃花粉Psa的培养富集方法为：称取猕猴桃花粉0.01g，加入装有15mL已高压灭菌并冷却的金氏B液体培养基的玻璃试管中，棉塞封口，于恒温震荡培养箱中24℃、180r/min培养12h后，4℃保存待用。
提取花粉菌悬液中Psa的DNA方法为：取1mL过夜培养的菌悬液于1.5mL离心管中，室温，11,000rpm离心1min，弃上清液，收集菌体；将收集的菌体加入1mL灭菌ddH2O反复吸打，洗涤菌体，11,000rpm离心1min，弃上清液，重复洗涤一次，取100μL灭菌ddH2O，反复吸打，溶解沉淀，于100℃水浴15min，水浴后立即置于冰上冷却3min，8,000rpm离心1min，取上清液，-20℃保存备用。
(4)扩增体系：总体积25μL，其中2×PCR Master 12.5μL，上游引物(10μmol/L)1μL，下游引物(10μmol/L)1μL；DNA模板1μL；Sterilized ddH2O 9.5μL；其中外引物扩增所用DNA模板为花粉菌悬液中Psa DNA，内引物扩增所用DNA模板为外引物扩增的PCR产物稀释50倍。
(5)巢氏PCR扩增程序为：94℃、5min，(94℃、10sec，55℃、30sec，72℃、1min)35个循环。72℃、0min，4℃保温。
(6)电泳检测：PCR反应结束后，取5μL PCR产物点样于1％琼脂糖凝胶中Du-Red核酸染料染色。电泳选用1×TAE缓冲液，条件为：电压100V，电流60mA，电泳25min。电泳结束后在凝胶成像系统上检测并拍照。
(7)PCR产物测序：PCR阳性扩增产物，送至上海生物工程有限公司进行测序，样品均采用双向测序以减少误差。将测序结果用DNAMAN生物软件对序列进行校正，并在NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中通过BLAST工具检索同源性。
结果见图1、表1。图1中：泳道1、2、3、4为外引物扩增Psa、Pseudomonassyringae pv.tomato、Pseudomonas syringae pv.Theae、Pseudomonas avellanae hrpW结果，Psa外引物扩增为阳性；泳道6、7、8、9为内引物扩增Psa、Pseudomonassyringae pv.tomato、Pseudomonas syringae pv.Theae、Pseudomonas avellanae hrpW结果，Psa外引物扩增为阳性。由图1可知，猕猴桃Psa DNA巢氏PCR扩增，可以扩增出590bp、240bp条带，与预期条带大小一致，而Pseudomonas syringaepv.tomato、Pseudomonas syringae pv.theae、Pseudomonas avellanae DNA进行巢氏PCR，不能扩增条带。进一步将猕猴桃Psa DNA外引物扩增PCR产物测序结果在NCBI中通过BLAST工具检索同源性，结果如表1，表明陕西猕猴桃Psa hrpW与数据库中猕猴桃Psa hrpW同源性为99％，而与Pseudomonas syringae pv.tomato、Pseudomonas syringae pv.theae、Pseudomonas avellanae同源性在90％以下，因此所建立的方法可检测陕西猕猴桃Psa，并可以区分Pseudomonas syringaepv.tomato、Pseudomonas syringae pv.theae、Pseudomonas avellanae。
表1扩增产物序列与目标序列同源性
注：CP011972.1、HE793307.1、FR734164.1、AF232004.3、FR734165.1、AJ842305.1为GenBank中PsaICMP18884株、PsaOMP-BO 4252.A,1株、Psa ISF 8.57株、Pseudomonas syringaepv.tomatoDC3000株及Pseudomonas syringae pv.theaeCFBP 4097株、Pseudomonas avellanaehrpW基因序列号。
实施例二
猕猴桃Psa PCR检测的灵敏度
挑取Psa单菌落于100mL无菌King’s B液体培养基中，牛皮纸封口，24℃，200r/min培养16h，获得菌悬液。用血细胞计数板测定菌悬液浓度，用无菌生理盐水调整菌悬液浓度梯度分别为107cfu/mL、106cfu/mL、105cfu/mL、104cfu/mL、103cfu/mL、102cfu/mL、10cfu/mL，分别提取DNA，进行PCR扩增，研究菌悬液中Psa的检测限，确定该方法检测灵敏度。
由图2可知：泳道1-7：检测菌悬液浓度依次为107cfu/mL、106cfu/mL、105cfu/mL、104cfu/mL、103cfu/mL、102cfu/mL、10cfu/mL，目的条带随着Psa菌悬液浓度的降低，依次变暗，当浓度降低为103cfu/mL时，条带微弱，依然能检测到Psa，但当浓度为102cfu/mL、101cfu/mL时没有条带，说明浓度低于103cfu/mL的菌悬液检测不到目的条带。因此，本试验中Psa的检出限为103cfu/mL，灵敏度较高。
实施例三
猕猴桃花粉Psa PCR检测
(1)猕猴桃花粉Psa的培养：分别取已制备好的猕猴桃花粉0.01g，对应加入编号1-23含有15mL已高压灭菌并冷却的King’B液体培养基的玻璃试管中，棉塞封口。于恒温震荡培养箱中24℃，180r/min培养12h后，获得混合菌悬液。4℃保存待用(只可短时保存)。
(2)菌悬液中Psa DNA的提取：取1mL过夜培养的菌悬液于1.5mL离心管中，室温11,000rpm离心1min，弃上清液，收集菌体。加入1mLddH2O反复吸打，洗涤菌体，11,000rpm离心1min，弃上清液。重复洗涤一次。取100μLddH2O，反复吸打，溶解沉淀，于100℃水浴15min，水浴后立即置于冰上冷却3min，8,000rpm离心1min，取上清液，-20℃保存备用。
引物设计、PCR扩增体系、扩增条件、电泳检测同实施例一(4)、(5)、(6)。扩增结果如图3、图4，图3中泳道1、12：阳性对照；泳道2、11：阴性对照；泳道3-6为花粉样品8、9、20、22外引物扩增结果；泳道7-10为花粉样品8、9、20、22内引物扩增结果。图4中泳道1为阳性对照组，泳道2-24为猕猴桃花粉样品(对应花粉编号为1-23)，其中泳道9、10、21、23的Psa检测为阳性(对应花粉编号8、9、20、22)，其余均为阴性。
图3和图4，23个花粉样品中有4个样品扩增得到550bp左右的外引物扩增条带和240bp左右的内引物扩增条带，分别与预期扩增片段及阳性对照组扩增片段大小一致，可确定8、9、20、22号花粉样品中均含有Psa。

Claims (7)

1.一种猕猴桃花粉中Psa的检测方法，其特征在于包括以下处理步骤：
a)根据猕猴桃优势Psa靶基因设计巢氏PCR引物；
b)进行猕猴桃花粉Psa的培养富集；
c)提取花粉菌悬液中Psa的DNA；
d)进行巢氏PCR扩增；
e)对PCR产物进行电泳检测。
2.如权利要求1所述的猕猴桃花粉中Psa的检测方法，其特征在于：所述步骤a)巢氏PCR引物是根据猕猴桃溃疡病优势病原菌Psa的hrpw基因的保守序列设计的，外引物、内引物的扩增长度分别为590、240bp。
3.如权利要求1所述的猕猴桃花粉中Psa的检测方法，其特征在于：所述步骤b)猕猴桃花粉Psa的培养富集方法为：称取猕猴桃花粉0.01g，加入装有15mL已高压灭菌并冷却的金氏B液体培养基的玻璃试管中，棉塞封口，于恒温震荡培养箱中24℃、180r/min培养12h后，4℃保存待用。
4.如权利要求1所述的猕猴桃花粉中Psa的检测方法，其特征在于：所述的步骤c)提取花粉菌悬液中Psa的DNA方法为：取1mL过夜培养的菌悬液于1.5mL离心管中，室温，11,000rpm离心1min，弃上清液，收集菌体；将收集的菌体加入1mL灭菌ddH2O反复吸打，洗涤菌体，11,000rpm离心1min，弃上清液，重复洗涤一次，取100μL灭菌ddH2O，反复吸打，溶解沉淀，于100℃水浴15min，水浴后立即置于冰上冷却3min，8,000rpm离心1min，取上清液，-20℃保存备用。
5.如权利要求1所述的猕猴桃花粉中Psa的检测方法，其特征在于：所述的步骤d)巢氏PCR扩增体系为：总体积25μL，其中2×PCR Master 12.5μL，10μmol/L的上游引物1μL，10μmol/L的下游引物1μL；DNA模板1μL；ddH2O 9.5μL；其中外引物扩增所用DNA模板为花粉菌悬液中Psa DNA，内引物扩增所用DNA模板为外引物扩增的PCR产物稀释50倍。
6.如权利要求1所述的猕猴桃花粉中Psa的检测方法，其特征在于：所述的步骤d)巢氏PCR扩增程序为：首先94℃变性5min；其次进行35个循环反应，包括94℃变性10sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min；最后72℃延伸10min，4℃保温。
7.如权利要求1所述的猕猴桃花粉中Psa的检测方法，其特征在于：所述的步骤e)PCR产物电泳检测方法为：PCR反应结束后，取5μL PCR产物点样于1％的琼脂糖凝胶中，选用2000bp DNA Marker；电泳选用1×TAE缓冲液，条件为：电压100V，电流60mA，电泳25min，电泳结束后在凝胶成像系统上检测并拍照。
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