CN102392080B - 一种鉴定番茄黄化曲叶病毒抗性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种鉴定番茄黄化曲叶病毒抗性的方法，它是针对天津地区特有的番茄黄化曲叶病毒序列而构建了针对天津地区TYLCV的侵染性克隆，通过茎杆注射接种番茄黄化曲叶病毒，鉴定不同番茄材料对该病毒的抗性。此方法无需饲养烟粉虱、操作简单、效率高、重复性好、可控性好，能提供相对一致的接种压力，结果准确，是一种简便有效的接种鉴定方法。
Description
技术领域
本发明属于植物保护技术领域，涉及番茄黄化曲叶病毒接种鉴定的研究，更具体的说是一种快速、简捷、高效的鉴定天津地区番茄黄化曲叶病毒抗性接种的方法。
背景技术
番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV)主要危害番茄、辣椒、茄子、甘蓝和黄瓜等蔬菜以及烟草等经济作物，特别是在番茄上危害更重。针对于TYLCV病毒的发生和危害，如何准确、快速、高效地检测到该病毒的存在和发生，是蔬菜安全可持续生产的迫切需要。
目前，鉴定番茄黄化曲叶病抗性的方法有烟粉虱传毒、嫁接接种和机械传毒等等。其中，嫁接法以嫩病叶做接穗，采用腹接法接种到健康番茄上，它的优点是能够为待鉴定植株提供高含量的TYLCV病毒，但该方法耗时耗力，只适于少量鉴定。机械传播是在人工环境下把感染TYLCV的曼陀罗、心叶烟或潘那利番茄作为毒源，通过机械传播侵染健康番茄植株，成功率较低，且病毒从番茄传到番茄上成功的例子只有很少的报道，因此，在接种中一般不用该TYLCV病毒。在育种进程中最常用的接种方法是烟粉虱接种鉴定法，包括温室中烟粉虱接种、回型笼中烟粉虱接种、露地烟粉虱接种3种类型，但这个方法也有一些缺点：1. 虫口密度不均一对抗性鉴定的影响。若虫口密度过大，一些抗病品种也会表现出感病来；若虫口密度太小，又区分不出抗感品种。目前对虫口密度的要求还没有一个标准。2.虫子逃逸引起病害的大面积发生。烟粉虱的体长一般为1-2mm，它可随着调查人员的进出而逃逸出来，从而给周围番茄产区带来灾害。3.受季节限制。烟粉虱的最佳活动温度是26-28℃，低于15℃虫子基本不活动，也就不能传毒，这就会延缓接种鉴定的进程。
农杆菌接种法是近年来发展起来的一种病毒抗性鉴定方法。利用TYLCV-DNA侵染性克隆，通过根癌农杆菌侵染待鉴定植株，病毒DNA可在植物体内形成、复制、运输并诱发症状。侵染性克隆技术首先在噬菌体病毒Qβ、脊髓灰质炎病毒（poliovirus）中获得成功，植物病毒侵染性克隆由Ahlquist 等（1984）在雀麦花叶病毒（Brome mosaic virus，BMV）首次报道，至今国外已有大量的植物病毒被成功地构建了全长cDNA 侵染性克隆（2008）。Zhang 等（2010,2009）分别构建了番木瓜黄曲病毒的侵染性克隆和上海分离物YLCV-[CN:SH2]的侵染性克隆，证明通过农杆菌注射能诱导出病毒侵染症状。
本发明的研究表明（2011）天津地区的分离物与上海和山东等省的分离物基因序列不同，编码转录激活蛋白的序列有2处突变，导致天津地区分离物与其它地区分离物氨基酸的不同，分别是90位E 到 G和104位H 到 Y，推测这两个突变可能增强了其致病力。
目前，国内还未见天津地区TYLCV的侵染性克隆工作的报道，因此，针对以天津为代表的华北地区抗番茄曲叶病毒栽培专用品种缺乏的现状，开展侵染性克隆构建工作，建立一套方便、可靠、安全的接种新方法，为抗病育种提供一种客观的评价体系，从而筛选培育出具有自主知识产权的专用品种，对于提高番茄市场竞争力，推进蔬菜产业可持续发展具有重要意义。
发明内容
针对传统技术不能准确地对TYLCV抗性进行鉴定的问题，本发明人进行了大量的研究工作，构建了针对天津地区TYLCV的侵染性克隆(代号为TYLCV--TJ)，通过茎杆注射接种番茄黄化曲叶病毒，鉴定不同番茄材料对该病毒的抗性。此方法无需饲养烟粉虱、操作简单、效率高、重复性好、可控性好，能提供相对一致的接种压力，结果准确，是一种简便有效的接种鉴定方法。本发明所公开的技术内容如下：
一种鉴定番茄黄化曲叶病毒抗性的方法，其特征在于按如下的步骤进行：
1）DNA 提取：从收集的发病植株的叶片中提取基因组总DNA；
2）引物的设计：以植物总DNA为模板，设计简并引物-对病毒DNA-A进行PCR扩增，其中扩增所用PCR引物为：
BamHI上a g tgggatccac ttctaaatg
BamHI下 a ggatcc catattgcaagacagactac
2356Fb ggatggaaatgtgctgacct
BamR b gtggatcccacatattgcaa
a:扩增全长的DNA-A序列；
b: 扩增0.4A的DNA-A序列；
3）扩增产物克隆到pMD-19T载体上，分别命名为1.0A-pMD和0.4A-pMD并转化到DH5a菌液中；
4）串联重复的克隆：用BamHI酶切切下1.0A-pMD的病毒全长DNA；用BamHI切开含有0.4A病毒基因组片段的0.4A-pMD载体；利用试剂盒回收相应大小的片段，利用T4连接酶将二者相连得到1.4A-pMD重组载体，转化至DH5a菌液中；
5）正向串联重复序列的获得：
1.0A和0.4A两个片段，利用引物C扩增阳性克隆菌液，比较大小后选出正向串联的菌落形成1.4A串联的克隆；所用引物为：
PMD19F c cgcc aag ctt gca tgccg
BamR c gtggatcccacatattgcaa ；
6）表达载体的构建和转化：
利用KnpI和SalI对含有1.4A TYLCV的1.4A-pMD质粒和植物表达载体pRI 101-An进行双酶切，然后利用T4连接酶将目的片段与表达载体进行连接得到1.4A- pRI，将连接产物转化至大肠杆菌DH5α中；用冻融法将1.4A- pRI直接转化农杆菌LBA4404的感受态细胞，转化后的菌液涂布于含利福平和卡那霉素平板，28℃温箱培养2～3d；挑取单菌落接种于2mI 含利福平50ug／mL 和卡那霉素50ug／mL 的YEB培养基中培养过夜后，取1mI菌液置于1.5mI 离心管，离心收集菌体，加50 L无菌水煮沸10min，取上清作模板进行PCR扩增，扩增产物用1．0% 琼脂凝胶电泳验证；
7）重组质粒的提取与鉴定：
用TAKARAMiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0（50次量）试剂盒进行质粒DNA的微量提取，利用SalI和KnpI双酶切1.4A -pRI，37℃酶切消化1h后琼脂糖凝胶电泳检查结果；
8）序列测定与分析：
数据处理借助DNAMAN Version 6.0（Lynnon Biosoft,QuebeCanada）进行，利用BLAST程序在GeneBank数据库中寻找与DNA-A序列最相近的基因组序列；
9）农杆菌接种及病毒DNA的检测和田间调查
将含有病毒DNA-A侵染性克隆的农杆菌LBA4404分别接种在含卡那霉素（50 ug/mL）和利福平（50 ug/mL）的YEB液体培养基中，28℃，200 rpm振荡培养48 h，接种时，取一支1 mL的一次性注射器，吸取培养好的农杆菌菌液，在距离供试植株根部1-2 cm处取三点进行韧皮部注射，接种植株置于防虫温室中培养，在注射接种后30天，采集叶片约0.5克，抽DNA-A后进行PCR检测，对植株高度和叶片进行症状的观察。
本发明通过该方法能科学高效准确地鉴定出番茄对TYLCV的抗性，其特点在于：
（1）本发明公开的接种鉴定方法与其它的侵染性克隆不同的是本发明是利用双子叶植物表达载体pRI-101-AN。该载体能特异地在番茄体内高效表达有利于病毒症状的诱导且具有自主知识产权。
（2）本发明将含有双向起动子的IR区序列串联在了全长基因组编码序列之后，而其它的如TYLCV的Y10分离物是将IR区串联在了全长基因组之前，实验证明这种策略同样能有效起动病毒的编码，为侵染性克隆的构建提供了更多的途径。
（3）本发明是针对天津地区特有的番茄黄化曲叶病毒序列而构建的表达载体，其所编码的氨基酸与其它地区是不同的，见文献《华北农学报》2011年 第1期 “天津地区番茄黄化曲叶病毒DNA-A的克隆和序列分析”。
本发明更加详细的方法如下:
1 材料和方法
1.1材料
毒源：TYLCV侵染植株所引起的典型症状为:黄脉、曲叶、曲茎、叶片皱缩、叶脉增厚、叶色褪绿、植株矮化等症状。采集表现这些症状的栽培番茄，-70℃保存待用。
菌株与载体：大肠杆菌和农杆菌L．BA4404DH5α购均自北京博美科生物技术有限公司；分子量标准Taq酶和克隆载体pMD-19T植物表达载体pRI 101-An均购自宝生物工程有限公司。限制性内切酶，T4 DNA 连接酶及DNA购自宝信购自New England Biolabs。
1. 2 方法：
（1）取材料，加液氮研磨成粉末状，迅速移入1.5 ml Eppendorf管中；
（2）加入800 μl的CTAB提取缓冲液，混匀（CTAB在65℃水浴预热），每5min轻轻震荡几次，20min后12000 r/min，离心15 min；
（3）小心吸取上清液，加入等体积的酚：氯仿（各400μl）溶液，混匀，4℃，12000 r/min，离心10 min；
（4）小心吸取上清液，加入等体积的氯仿，混匀，4℃，12000 r/min，离心10 min。
（5）重复步骤（4）1-2次，以蛋白层不出现为止；
（6）取上清，-20℃沉淀1h，4℃，12000 r/min，离心10 min；
（7）弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀2次；
（8）室温下干燥后（一般干燥5-15 min），溶于30-50 μl DEPC去离子水中，于-20℃或者-70℃下保存备用。
引物的设计
根据于力等人设计的1对简并引物，用于扩增该保守区的575bp的片段。引物序列分别为：
CoPR，5’>GA(AGCT)G(GC)ATG(ACT)GT(AG)CA(AGT)GCCATATA<3’，
AV494，5’>GCC（CT）AT（AG）TA（CT）AG（AG）AAGCC（AC）AG<3’。
对该部分区域进行克隆及序列测序，BLAST 比较确定其是否为TYLCV分离物。根据已知片段的序列扩增未知的全长序列。在设计引物时加入载体的酶切位点：
表1 克隆所用PCR引物
Table 1 PCR primers used for cloning
引物 引物序列(5’-3’) 引物位置
Primers Sequence(5’-3’) Position in DNA-A
BamHI下 a ggatcccatattgcaagacagactac 131-150
2356Fb ggatggaaatgtgctgacct 2356-2376
BamR b gtggatcccacatattgcaa 128-148
PMD19F c cgccaagcttgcatgccg PMD19上的一段序列
BamR c gtggatcccacatattgcaa 141-160
F：上游引物；R：下游引物。
a:扩增全长的DNA-A序列，下划线为BamHI酶切位点。
b: 扩增0.4A的DNA-A序列，下划线为BamHI酶切位点，含IR区（2446bp-148bp）。
c:用于检测正向插入位点大小为2.3KB.
1.2.3 1.0ADNA和0.4A片段的克隆
将两端带有BamHI酶切位点的1.0A TYLCV的PCR片段和一端带BamHI酶切位点的PCR片段按试剂盒度明书克隆到pMD-19T载体上，分别命名为1.0A-pMD和0.4A-pMD并转化到DH5a菌液中。
1.2.4 1.4A串联重复的克隆
用BamHI酶切切下1.0A-pMD的病毒全长DNA；用BamHI切开含有0.4A病毒基因组片段的0.4A-pMD载体；利用试剂盒回收相应大小的片段。利用T4连接酶将二者相连得到1.4A-pMD重组载体，转化至DH5a菌液中。
正向串联重复序列的获得
1.0A和0.4A两个片段有正向和反向两种连接方式且机率相同，在构建侵染性克隆时需要正向克隆以使病毒能正确翻译和表达，所以我们设计了表1中的引物C，用以区分正向与反向相连的克隆。利用引物C扩增阳性克隆菌液，比较大小后选出正向串联的菌落形成1.4A串联的克隆。
表达载体的构建和转化
利用KnpI和SalI对含有1.4A TYLCV的1.4A-pMD质粒和植物表达载体pRI 101-An进行双酶切，回收目的片段。然后利用T4连接酶将目的片段与表达载体进行连接得到1.4A- pRI。将连接产物转化至大肠杆菌DH5α中。
用冻融法将1.4A- pRI直接转化农杆菌LBA4404的感受态细胞，转化后的菌液涂布于含利福平和卡那霉素平板，28℃温箱培养2～3d。挑取单菌落接种于2mI 含利福平50ug／mL 和卡那霉素50ug／mL 的YEB培养基中培养过夜后，取1mI菌液置于1．5mI 离心管，离心收集菌体，加50 L无菌水煮沸10min，取上清作模板进行PCR扩增，扩增产物用1．0% 琼脂凝胶电泳验证。
重组质粒的提取与鉴定
用TAKARAMiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0（50次量）试剂盒进行质粒DNA的微量提取。利用SalI和KnpI双酶切1.4A -pRI，37℃酶切消化1h后琼脂糖凝胶电泳检查结果。
序列测定与分析
序列测定由宝生物工程(大连)有限公司完成。数据处理借助DNAMAN Version 6.0（Lynnon Biosoft,QuebeCanada）进行。利用BLAST程序（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）在GeneBank数据库中寻找与DNA-A序列最相近的基因组序列。
农杆菌接种及病毒DNA的检测和田间调查
将含有病毒DNA-A侵染性克隆的农杆菌LBA4404分别接种在含卡那霉素（50 ug/mL）和利福平（50 ug/mL）的YEB液体培养基中，28℃，200 rpm振荡培养48 h。接种时，取一支1 mL的一次性注射器，吸取培养好的农杆菌菌液，在距离供试植株根部1-2 cm处取三点进行韧皮部注射，接种植株置于防虫温室中培养。在注射接种后30天，采集叶片约0.5克，抽DNA-A后进行PCR检测，并对植株高度和叶片进行症状的观察。
2.1TYLCV DNA-A全基因和0.4 A TYLCV的扩增及克隆
2.2 1.4A串联重复序列的克隆
利用BamHI从1.0A-pMD载体上将1.0ADNA切下，同样利用BamHI将0.4A-pMD酶切成线性载体。利用相同的粘性末端在T4连接酶的作用下进行连接。因为连接的几率相同，利用引物3筛选出正向编码的阳性克隆，得到1.4A串联重复序列的克隆。在设计验证引物时正向插入可扩增出2.3KB大小的片段，而反向插入不能扩增。
2.3 酶切及测序验证
从1.4A-PMD上用SalI和KnpI双酶切，切下串联重复序列如图4中3.3KB所示，酶切产物大小与预期一致（2.8+0.5=3.3KB）。将酶切产物送到测序公司测序，证明克隆成功。
3.4表达载体1.4A -pRI的构建和酶切验证
回收克隆载体上的3.3KB的片段，酶切pRI101-AN并进行回收（图5）。进行连接转化后提取质粒。用SalI和KnpI双酶切1.4A -pRI，切出两条带分别为10KB和3.3KB的条带与预期大小相符（图6）。
在注射接种30天后进行PCR检测结果均呈阳性（图7）。证明病毒已在注射植株的体内进行了繁殖和扩增。
在接种30天后被注射的感病植株表现出明显的感病症状叶片黄化卷曲植株矮化如图8，而抗病植株未显症（图8）,证明这种方法能用于抗病育种的鉴定。
本发明公开的鉴定番茄黄化曲叶病毒抗性方法与现有技术相比所具有的优点在于：
（1）方便快捷，因此方法无需饲养烟粉虱。
（2）准确高效，因此方法能提供相对一致的接种压力。
附图说明：
图1为 BamHI上和BamHI上引物扩增全长片段；其中1-3为：BamHI上和BamHI上引物扩增；4：2000D Marker；
图2 为2356F 和BamR引物扩增0.4A片段；其中1为：5000D Marker； 2-7:2356F 和BamR引物扩增；
图3为引物3筛选出正向编码的阳性克隆；其中1-8：PMD19F 和BamR引物扩增； 9：2000D Marker；
图4为 利用SalI和KnpI双酶切1.4A- pMD质粒；其中1为 5000D Marker ；2-6 1.4A- pMD质粒；
图5 SalI和KnpI双酶切pRI101-AN载体；其中1为 5000D Marker ；2-3 pRI101-AN载体；
图6为SalI和KnpI双酶切1.4A- pRI；其中1为 5000D Marker；2 质粒；3-4 SalI和KnpI双酶切产物；
图7为注射植物的PCR检测；其中1为. 5000D Marker； 2、4-8.注射植株 3.抗病品种；
图8为在接种30天后被注射的感病植株表现出明显的感病症状叶片黄化卷曲植株矮化，而抗病植株未显症；其中A注射的感病品种；B注射的抗病品种；C注射的感病品种叶片；D注射的抗病品种叶片。
具体实施方式
下面结合实施例说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定。
其中毒源：TYLCV侵染植株所引起的典型症状为:黄脉、曲叶、曲茎、叶片皱缩、叶脉增厚、叶色褪绿、植株矮化等症状。采集表现这些症状的栽培番茄，-70℃保存待用。菌株与载体：大肠杆菌和农杆菌L．BA4404 DH5α均购自北京博美科生物技术有限公司，分子量标准Taq酶和克隆载体pMD-19T，植物表达载体pRI 101-An均购自宝生物工程有限公司。限制性内切酶，T4 DNA 连接酶及DNA购自宝信购自New England Biolabs。另外所述的各种试剂除另有说明外，其它均有市售。
实施例1
1.植物总DNAD的抽提
（1）取接种30天后的叶片，加液氮研磨成粉末状，迅速移入1.5 ml Eppendorf管中；
（2）加入800 μl的CTAB提取缓冲液，混匀（CTAB在65℃水浴预热），每5min轻轻震荡几次，20min后12000 r/min，离心15 min；
（3）小心吸取上清液，加入等体积的酚：氯仿（各400μl）溶液，混匀，4℃，12000 r/min，离心10 min；
（4）小心吸取上清液，加入等体积的氯仿，混匀，4℃，12000 r/min，离心10 min。
（5）重复步骤（4）1-2次，以蛋白层不出现为止；
（6）取上清，-20℃沉淀1h，4℃，12000 r/min，离心10 min；
（7）弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀2次；
（8）室温下干燥后（一般干燥5-15 min），溶于30-50 μl DEPC去离子水中，于-20℃或者-70℃下保存备用。
2.PCR扩增，克隆及全基因序列测定和分析
2.1 引物的设计
根据于力等人设计的1对简并引物，用于扩增该保守区的575bp的片段。引物序列分别为：
CoPR，5’>GA(AGCT)G(GC)ATG(ACT)GT(AG)CA(AGT)GCCATATA<3’，
AV494，5’>GCC（CT）AT（AG）TA（CT）AG（AG）AAGCC（AC）AG<3’。
对该部分区域进行克隆及序列测序，BLAST 比较确定其是否为TYLCV分离物。根据已知片段的序列扩增未知的全长序列。在设计引物时加入载体的酶切位点：
表1 克隆所用PCR引物
Table 1 PCR primers used for cloning
引物 引物序列(5’-3’) 引物位置
Primers Sequence(5’-3’) Position in DNA-A
BamHI下 a ggatcc catattgcaagacagactac 131-150
2356Fb ggatggaaatgtgctgacct 2356-2376
BamR b gtggatcccacatattgcaa 128-148
PMD19F c cgcc aag ctt gca tgccg PMD19上的一段序列
BamR c gtggatcccacatattgcaa 141-160
F：上游引物；R：下游引物。
a:扩增全长的DNA-A序列，下划线为BamHI酶切位点。
b: 扩增0.4A的DNA-A序列，下划线为BamHI酶切位点，含IR区（2446bp-148bp）。
c:用于检测正向插入位点大小为2.3KB.
2.2 1.0ADNA和0.4A片段的克隆
将两端带有BamHI酶切位点的1.0A TYLCV的PCR片段和一端带BamHI酶切位点的PCR片段按试剂盒度明书克隆到pMD-19T载体上，分别命名为1.0A-pMD和0.4A-pMD并转化到DH5a菌液中。
2.3 1.4A串联重复的克隆
用BamHI酶切切下1.0A-pMD的病毒全长DNA；用BamHI切开含有0.4A病毒基因组片段的0.4A-pMD载体；利用试剂盒回收相应大小的片段。利用T4连接酶将二者相连得到1.4A-pMD重组载体，转化至DH5a菌液中。
酶切：
取一0.5 mL eppendorf管，依次加入以下试剂
DNA 200 ng
限制性内切酶0.5μL
10×酶反应缓冲液2μL
加dd H2O至20μL
37℃酶切消化1h后琼脂糖凝胶电泳检查结果。
连接：
外源DNA片段5μL（50-250 ng）
线性化载体DNA 1μL（50 ng）
10×连接缓冲液1μL
T4 DNA连接酶(3U/μL)1μL
加dd H2O至终体积为10μL
置16℃，反应2hr。
转化：
1)取一管保存的感受态细胞100μl，冰上融化；
2)加入5μl连接物，轻搅混匀，冰浴30min；
3)42℃热击90秒后迅速置冰浴5min；
4)加入400μl液体LB，37℃150rpm振荡培养1～2h；
5)取150μl培养液涂布于固体LB培养基（含100μg/ml氨苄青霉素），37℃培养至出现
单菌落（需16-20h）。
2.4正向串联重复序列的获得
1.0A和0.4A两个片段有正向和反向两种连接方式且机率相同，在构建侵染性克隆时需要正向克隆以使病毒能正确翻译和表达，所以我们设计了表1中的引物C，用以区分正向与反向相连的克隆。利用引物C扩增阳性克隆菌液，比较大小后选出正向串联的菌落形成1.4A串联的克隆。
实施例2
天津地区分离物TYLCV-TJ侵染性载体的构建
利用KnpI和SalI对含有1.4A TYLCV的1.4A-pMD质粒和植物表达载体pRI 101-An进行双酶切，回收目的片段。然后利用T4连接酶将目的片段与表达载体进行连接得到1.4A- pRI。将连接产物转化至大肠杆菌DH5α中。
酶切：
取一0.5 mL eppendorf管，依次加入以下试剂
DNA 200 ng
限制性内切酶0.5μL
10×酶反应缓冲液2μL
加dd H2O至20μL
37℃酶切消化1h后琼脂糖凝胶电泳检查结果。
连接和转化详见2.3
实施例3
重组载体对农杆菌的转化：
农杆菌LBA4404感受态细胞的制备
1)农杆菌活化：将-70℃保存的农杆菌LBA4404在含卡那霉素（50 ug/mL）和利福平（50 ug/mL）YEB固体培养基上画线，于28℃培养箱中倒置培养48h左右至菌落长出；
2)挑取单菌落接种于3mL含卡那霉素（50 ug/mL）和利福平（50 ug/mL）YEB液体培养基中，28℃下220rpm/min振荡培养至OD600≈0.5；
3)取1.0 mL菌液于1.5 mL无菌离心管中，置于冰上冰浴10 min；
4)从冰上取出离心管，于台式离心机中5,000 rpm/min离心30 s，弃去上清液；
5)沉淀用1.5 mL 0.5 mol/L NaCl充分悬浮，勿剧烈震荡，然后置于冰上冰浴20 min；
6)5,000 rpm/min离心30 s，弃去上清液；
7)每管用100μL 20 mmol/L CaCl2悬浮，即制备获得农杆菌感受态细胞。
重组质粒DNA转化农杆菌LBA4404
采用液氮冻融法将重组质粒DNA直接转化农杆菌LBA4404，具体操作如下：
1)取50~100μL农杆菌LBA4404感受态细胞与上述构建好的重组质粒DNA 5~10μL，
于1.5 mL无菌离心管中吹吸混匀，然后后置于冰上冰浴30 min；
2)从冰上取出离心管，迅速放入液氮中，放置5 min；
3)从液氮中取出离心管，然后立即放入37℃水浴锅中水浴5 min；
4)取出离心管，加入0.5 mL YEB液体培养基，28℃下220 rpm/min振荡培养3~5 h；
5)取200μL转化产物涂布含卡那霉素（50 ug/mL）和利福平（50 ug/mL））YEB固体培养基，于28℃培养箱中倒置培养。48 h左右菌落可见。
实施例4
农杆菌注射接种：
将含有病毒DNA-A侵染性克隆的农杆菌LBA4404分别接种在含卡那霉素（50 ug/mL）和利福平（50 ug/mL）的YEB液体培养基中，28℃，200 rpm振荡培养48 h。接种时，取一支1 mL的一次性注射器，吸取培养好的农杆菌菌液，在距离供试植株根部1-2 cm处取三点进行韧皮部注射，接种植株置于防虫温室中培养。
实施例5
病毒侵染性克隆的侵染性测定
接种植物进行症状观察对出症状或未出症状的植物都进行PCR检测，对植株高度和叶片进行症状的观察，
结果在接种30天后被注射的感病植株表现出明显的感病症状叶片黄化卷曲植株矮化而抗病植株未显症。对供试植株进行PCR检测，结果在感病品种中扩出了目的条带而在抗病品种中未扩出条带。
实施例6
实际应用：
1材料： 2009年春以CLN2545A（来自亚蔬中心）为父本，浙粉202（市售）自交5代后的品系为母本进行杂交得F1代，2010年春进行自交得F2代。
2.方法
2育苗：将F2代番茄种子播于育苗盘中每穴2粒，常规管理，待到5片叶时进行接种。
3菌体培养：取含有侵染性克隆的农杆菌LBA4404，用接种针含有含卡那霉素（50 ug/mL）和利福平（50 ug/mL）YEB固体培养基上培养，2天后挑取单菌落于将含有卡那霉素（50 ug/mL）和利福平（50 ug/mL）的YEB液体培养基中，28℃，200 rpm振荡培养48 h。
4 接种：取一支1 mL的一次性注射器，吸取培养好的农杆菌菌液，在距离供试植株根部1-2 cm处取三点进行韧皮部注射，接种植株置于防虫温室中培养。
5 提取植物总DNA
（1）在接种30天后取叶片材料，加液氮研磨成粉末状，迅速移入1.5 ml Eppendorf管中；
（2）加入800 μl的CTAB提取缓冲液，混匀（CTAB在65℃水浴预热），每5min轻轻震荡几次，20min后12000 r/min，离心15 min；
（3）小心吸取上清液，加入等体积的酚：氯仿（各400μl）溶液，混匀，4℃，12000 r/min，离心10 min；
（4）小心吸取上清液，加入等体积的氯仿，混匀，4℃，12000 r/min，离心10 min。
（5）重复步骤（4）1-2次，以蛋白层不出现为止；
（6）取上清，-20℃沉淀1h，4℃，12000 r/min，离心10 min；
（7）弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀2次；
（8）室温下干燥后（一般干燥5-15 min），溶于30-50μl DEPC去离子水中，于-20℃或者-70℃下保存备用。
6 PCR检测
利用引物
CoPR，5’>GA(AGCT)G(GC)ATG(ACT)GT(AG)CA(AGT)GCCATATA<3’，
AV494，5’>GCC（CT）AT（AG）TA（CT）AG（AG）AAGCC（AC）AG<3’
PCR检测，反应体系：反应总体积为25μL，包括模板DNA 20~60 ng，Taq DNA聚合酶 0.5 U，dNTPs(each 10mmol/L) 0.5μL，10×PCR缓冲液2.5μL，5，端引物（10 pmol/L）2.5μL，3，端引物（10 pmol/L）2.5μL。PCR反应条件为： 95℃热启动之后，进行PCR扩增。循环条件为：95℃变性5 min，95℃ 30s，50℃退火30s，72℃延伸30 s，循环35次，72℃延伸10 min。
将所有反应物混匀后，于PCR仪上扩增（MJ PTC-200）。PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳。电泳结束后，凝胶置于0.5μg/L溴化乙锭中染色20 min，将已染色凝胶置于成像系统中观察。结果在所注射的植株中均具有扩增条带，证明病毒在番茄体内进行了繁殖和扩增。
7 症状观察：在注射接种后30天，对植株高度和叶片进行症状的观察，植株表现出典型的黄化曲叶症状，植株矮化，叶片黄化卷曲。
8发病统计：利用该侵染性克隆对我们配制的组合的F2代进行注射鉴定，共注射50株，其中有35株表现出典型的黄化曲叶症状，15株未表现症状，符合单基因的遗传规律，证明这种方法能用于抗病育种的鉴定。
主要参考文献：
1.Ahlquist P, et al. MulticomponentRNA plant virus infection derived from cloned viral cDNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Statesof Amercia, 1984, 81: 7066-7070.
2.Hui ZHANG et al. Molecular characterization and pathogenicity of tomato yellow leaf curl virus in China. Virus Genes ,2009, 39:249–255
3.Hui ZHANG et al. Molecular characterization and infectivity of Papaya leaf curl China virus infecting tomato in China. Zhejiang Univ-Sci B (Biomed & Biotechnol) 2010, 11(2):109-114
4.金凤媚，薛俊，郏艳红等。天津地区番茄黄化曲叶病毒DNA-A的克隆和序列分析。华北农学报，2011（20）：223-226。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津市农业生物技术研究中心
<120> 一种鉴定番茄黄化曲叶病毒抗性的方法
<130> 1
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gtgggatcca cttctaaatg 20
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggatcccata ttgcaagaca gactac 26
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggatggaaat gtgctgacct 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gtggatccca catattgcaa 20
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cgccaagctt gcatgccg 18
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gtggatccca catattgcaa 20
Claims (1)
1.一种鉴定天津地区番茄黄化曲叶病毒抗性的方法，其特征在于按如下的步骤进行：
1）DNA 提取：从天津地区收集的发病植株的叶片中提取基因组总DNA；
2）引物的设计：根据设计的简并引物，用于扩增该保守区的575bp的片段，引物序列分别为：
CoPR，5’>GA(AGCT)G(GC)ATG(ACT)GT(AG)CA(AGT)GCCATATA<3’，
AV494，5’>GCC（CT）AT（AG）TA（CT）AG（AG）AAGCC（AC）AG<3’，
对该部分区域进行克隆及序列测序，BLAST 比较确定其是否为番茄黄化曲叶病毒分离物；根据已知片段的序列扩增未知的全长序列；设计构建含串联重复序列载体的引物，在设计引物时加入载体的酶切位点：
克隆所用PCR引物：
引物 引物序列(5’-3’)
BamHI上a gtgggatccacttctaaatg
BamHI下 a ggatcccatattgcaagacagactac
2356Fb ggatggaaatgtgctgacct
BamR b gtggatcccacatattgcaa
F：上游引物；R：下游引物；a:扩增全长的DNA-A序列，下划线为BamHI酶切位点；b: 扩增0.4A的DNA-A序列，下划线为BamHI酶切位点；
3）扩增产物克隆到pMD-19T载体上，分别命名为1.0A-pMD和0.4A-pMD并转化到DH5a菌液中；
4）串联重复的克隆：用BamHI酶切切下1.0A-pMD的病毒全长DNA；用BamHI切开含有0.4A病毒基因组片段的0.4A-pMD载体；利用试剂盒回收相应大小的片段，利用T4连接酶将二者相连得到1.4A-pMD重组载体，转化至DH5a菌液中；
5）正向串联重复序列的获得：
1.0A和0.4A两个片段，利用引物C扩增阳性克隆菌液，比较大小后选出正向串联的菌落形成1.4A串联的克隆；所用引物为：
PMD19F c cgcc aag ctt gca tgccg
BamR c gtggatcccacatattgcaa ；
6）表达载体的构建和转化：
利用KnpI和SalI对含有1.4A番茄黄化曲叶病毒的1.4A-pMD质粒和植物表达载体pRI 101-An进行双酶切，然后利用T4连接酶将目的片段与表达载体进行连接得到1.4A- pRI，将连接产物转化至大肠杆菌DH5α中；用冻融法将1.4A- pRI直接转化农杆菌LBA4404的感受态细胞，转化后的菌液涂布于含利福平和卡那霉素平板，28℃温箱培养2～3d；挑取单菌落接种于2mL含50μg／mL利福平和100μg／mL卡那霉素的YEB培养基中培养过夜后，取1mL菌液置于1.5mL 离心管，离心收集菌体，加50μL无菌水煮沸10min，取上清作模板进行PCR扩增，扩增产物用1.0% 琼脂凝胶电泳验证；
7）重组质粒的提取与鉴定：
用50次量的TAKARAMiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0 试剂盒进行质粒DNA的微量提取，利用SalI和KnpI双酶切1.4A -pRI，37℃酶切消化1h后琼脂糖凝胶电泳检查结果；
8）序列测定与分析：
数据处理借助Lynnon Biosoft,QuebeCanada，DNAMAN Version 6.0进行，利用BLAST程序在GeneBank数据库中寻找与DNA-A序列最相近的基因组序列；
9）农杆菌接种及病毒DNA的检测和田间调查：
将含有病毒DNA-A侵染性克隆的农杆菌LBA4404分别接种在含50μg /mL卡那霉素和50μg /mL利福平的YEB液体培养基中，28℃，200 rpm振荡培养48 h，接种时，取一支1 mL的一次性注射器，吸取培养好的农杆菌菌液，在距离供试植株根部1-2 cm处取三点进行韧皮部注射，接种植株置于防虫温室中培养，在注射接种后30天，采集叶片约0.5克，抽DNA-A后进行PCR检测，对植株高度和叶片进行症状的观察。
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