CN108841916A - 一种番茄茎腐根腐病苗期快速接种鉴定方法 - Google Patents

一种番茄茎腐根腐病苗期快速接种鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于植物保护技术领域，尤其涉及一种番茄茎腐根腐病苗期快速接种鉴定方法，所述鉴定方法将番茄幼苗培养至接种苗龄‑三片真叶时期，用注射器吸取0.1mL待鉴定病菌的接种菌液，由番茄幼苗的茎基部刺入并将接种菌液注射到番茄幼苗茎基部木质部，一定温度下继续培养番茄幼苗，15天后调查发病情况。本发明提供的番茄茎腐根腐病苗期快速接种鉴定方法操作方便，只需在番茄幼苗茎基部进行注射，易于观察控制；注射接菌在番茄幼苗茎部处理相对较清洁不易受其它土传病菌的影响；比传统浸根、棉球处理发病更严重快速，这是由于注射能将病原菌准确直接送到植株内部，发病较快，适合苗期快速接种鉴定。

Description

一种番茄茎腐根腐病苗期快速接种鉴定方法
技术领域
本发明属于植物保护技术领域，尤其涉及一种番茄茎腐根腐病苗期快速接种鉴定方法。
背景技术
番茄颈腐根腐病，俗称“死棵病”，近年来在我国尤其在山东番茄连作大棚中泛滥成灾，采集大棚中病株作分离鉴定，发现番茄颈腐病致病菌为尖孢镰刀菌番茄茎腐根腐病专化型。国外对番茄颈腐病相关研究比较多，最早发现于日本，随后其他国家也相继发现该病。番茄这一病害已经发展成为世界范围内对番茄破坏性最大土传病害之一，一旦侵染这一病害番茄会减产70％～83％。幼苗感病初期首先出现老叶变黄和小叶萎缩，病原菌会攻击根部和茎基部，使其褐变和腐烂，晚期症状表现为茎基部萎缩倒塌，根腐烂，甚至导致死亡，成熟植株感染表现为果成熟前期老叶边缘开始黄化，茎基部有明显深褐色病斑，把染病植株纵向截面后，可以在根茎皮层看到广泛褐变斑点和腐烂现象，并且褐变不会超过土壤线25～30cm。
对于番茄土传病害研究者普遍采用的接种方式为浸根接种法，灌根接种法、土壤接种法，但这些方法操作复杂，发病较慢，病症不明显，不适用于番茄苗期病害的快速鉴定。
发明内容
为解决上述现有技术的不足，本发明提供了一种番茄茎腐根腐病苗期快速接种鉴定方法。
本发明的技术方案：
一种番茄茎腐根腐病苗期快速接种鉴定方法，所述鉴定方法将番茄幼苗培养至接种苗龄，用注射器吸取待鉴定病菌的接种菌液，由番茄幼苗的茎基部刺入并将接种菌液注射到番茄幼苗茎基部，一定温度下继续培养番茄幼苗，15天后调查发病情况。
进一步的，所述接种苗龄为番茄种子经杀菌处理后播种育苗盘，常规管理，待长到三片真叶、四片真叶或六片真叶时开始接种。
进一步的，所述接种菌液的量为0.1mL。
进一步的，所述待鉴定病菌的接种菌液的配制方法为：用无菌打孔器在待鉴定病菌平板培养菌落的边缘打取直径为6mm的菌饼4片，放入装有150mlPD液体培养基三角瓶中，150rpm·min-1，28℃振荡培养4d，用无菌水将培养液稀释为浓度为1×105孢子/ml、1×106孢子/ml或1×107孢子/ml的孢子悬浮液即为接种菌液。
进一步的，所述将待鉴定病菌的接种菌液注射到番茄幼苗茎基部采用多点注射，注射点3～5处，注射时将注射器刺入番茄幼苗的木质部。
进一步的，所述将待鉴定病菌的接种菌液注射到番茄幼苗茎基部还包括将接种菌液注射到番茄幼苗的茎基部外表皮。
进一步的，所述培养番茄幼苗的温度为20～30℃。
进一步的，所述番茄茎腐根腐病的发病等级划分为：0级-没有症状；1级-番茄下部叶片发黄，茎基部有腐烂；2级-次生根腐烂，茎基部明显凹陷；3级-植株发育缓慢，茎基部凹陷，维管束褐变，主根腐烂；4级-全株萎蔫、折倒、死亡。
本发明的有益效果：
1、本发明提供的番茄茎腐根腐病苗期快速接种鉴定方法操作方便，传统的番茄土传病害接菌法-浸根接种法、土壤接种法，接菌时需要将幼苗挖起，接菌处理后再重新分栽，操作复杂，而注射接菌只需在茎基部进行注射，操作简便，易于观察控制。
2、本发明提供的番茄茎腐根腐病苗期快速接种鉴定方法受土壤中其他微生物影响较小，土传病害接菌在根部处理易受其它土壤微生物的混合影响，导致发病症状和原因不好辨别，而注射接菌在茎部处理相对较清洁不易受其它土传病菌的影响。
3、本发明提供的番茄茎腐根腐病苗期快速接种鉴定方法发病迅速，症状明显，茎基部注射接菌明显比其它处理发病严重快速，这是由于注射能将病原菌准确直接送到植株内部，发病较快，适合苗期快速接种鉴定。
附图说明
图1为本发明提供的注射接种鉴定方法所得感染茎腐根腐病的番茄植株的照片；
图2为本发明提供的注射接种鉴定方法所得感染茎腐根腐病发病严重的植株的照片；
图3为浸根接种法与本发明提供的注射接种鉴定方法所得感染茎腐根腐病的番茄植株的对比照片，其中左侧植株为浸根接种法，右侧植株为注射接种法。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
实施例1
一种番茄茎腐根腐病苗期快速接种鉴定方法，所述鉴定方法将番茄幼苗培养至接种苗龄，用注射器吸取待鉴定病菌的接种菌液，由番茄幼苗的茎基部刺入并将接种菌液注射到番茄幼苗茎基部，一定温度下继续培养番茄幼苗，15天后调查发病情况。
实施例2
一种番茄茎腐根腐病苗期快速接种鉴定方法，所述鉴定方法步骤如下：
(一)将番茄种子经杀菌处理后播种育苗盘，常规管理，待长到三片真叶、四片真叶或六片真叶时准备接种；本发明采用的番茄品种为Moneymaker品种，来源于东北农业大学番茄研究所。
(二)挑取待鉴定病菌进行纯培养，28℃培养10d后，用无菌打孔器在待鉴定病菌平板培养菌落的边缘打取直径为6mm的菌饼4片，放入装有150mlPD液体培养基三角瓶中，150rpm·min-1，28℃振荡培养4d，用无菌水将培养液稀释为浓度为1×105孢子/ml、1×106孢子/ml或1×107孢子/ml的孢子悬浮液即为接种菌液。
(三)用1mL注射器吸取0.1mL步骤(二)制得的接种菌液，在步骤(一)培养好的番茄幼苗的茎基部刺入木质部，将接种菌液少量多点注射到番茄幼苗茎基部内，注射点3～5处，剩余接种菌液注射到茎基部外表皮，20～30℃继续培养番茄幼苗，15天后调查发病情况。
实施例3
一种番茄茎腐根腐病苗期快速接种鉴定方法，所述鉴定方法步骤如下：
(一)将番茄种子经杀菌处理后播种育苗盘，常规管理，待长到四片真叶时准备接种；
(二)挑取待鉴定病菌进行纯培养，28℃培养10d后，用无菌打孔器在待鉴定病菌平板培养菌落的边缘打取直径为6mm的菌饼4片，放入装有150mlPD液体培养基三角瓶中，150rpm·min-1，28℃振荡培养4d，用无菌水将培养液稀释为浓度为1×105孢子/ml的孢子悬浮液即为接种菌液。
(三)用1mL注射器吸取0.1mL步骤(二)制得的接种菌液，在步骤(一)培养好的番茄幼苗的茎基部刺入木质部，将接种菌液少量多点注射到番茄幼苗茎基部内，注射点3-5处，剩余接种菌液注射到茎基部外表皮，20-30℃继续培养番茄幼苗，15天后调查发病情况。
实施例4
一种番茄茎腐根腐病苗期快速接种鉴定方法，所述鉴定方法步骤如下：
(一)将番茄种子经杀菌处理后播种育苗盘，常规管理，待长到六片真叶时准备接种；
(二)挑取待鉴定病菌进行纯培养，28℃培养10d后，用无菌打孔器在待鉴定病菌平板培养菌落的边缘打取直径为6mm的菌饼4片，放入装有150mlPD液体培养基三角瓶中，150rpm·min-1，28℃振荡培养4d，用无菌水将培养液稀释为浓度为1×106孢子/ml的孢子悬浮液即为接种菌液。
(三)用1mL注射器吸取0.1mL步骤(二)制得的接种菌液，在步骤(一)培养好的番茄幼苗的茎基部刺入木质部，将接种菌液少量多点注射到番茄幼苗茎基部内，注射点3-5处，剩余接种菌液注射到茎基部外表皮，20-30℃继续培养番茄幼苗，15天后调查发病情况。
实施例5
一种番茄茎腐根腐病苗期快速接种鉴定方法，所述鉴定方法步骤如下：
(一)将番茄种子经杀菌处理后播种育苗盘，常规管理，待长到三片真叶时准备接种；
(二)挑取待鉴定病菌进行纯培养，28℃培养10d后，用无菌打孔器在待鉴定病菌平板培养菌落的边缘打取直径为6mm的菌饼4片，放入装有150mlPD液体培养基三角瓶中，150rpm·min-1，28℃振荡培养4d，用无菌水将培养液稀释为浓度为1×107孢子/ml的孢子悬浮液即为接种菌液。
(三)用1mL注射器吸取0.1mL步骤(二)制得的接种菌液，在步骤(一)培养好的番茄幼苗的茎基部刺入木质部，将接种菌液少量多点注射到番茄幼苗茎基部内，注射点3-5处，剩余接种菌液注射到茎基部外表皮，20-30℃继续培养番茄幼苗，15天后调查发病情况。
实施例6
一种番茄茎腐根腐病苗期快速接种鉴定方法，所述鉴定方法步骤如下：
(一)将番茄种子经杀菌处理后播种育苗盘，常规管理，待长到三片真叶时准备接种；
(二)挑取待鉴定病菌进行纯培养，28℃培养10d后，用无菌打孔器在待鉴定病菌平板培养菌落的边缘打取直径为6mm的菌饼4片，放入装有150mlPD液体培养基三角瓶中，150rpm·min-1，28℃振荡培养4d，用无菌水将培养液稀释为浓度为1×107孢子/ml的孢子悬浮液即为接种菌液。
(三)用1mL注射器吸取0.1mL步骤(二)制得的接种菌液，在步骤(一)培养好的番茄幼苗的茎基部刺入木质部，将接种菌液少量多点注射到番茄幼苗茎基部内，注射点4处，每处注射0.02mL接种菌液，剩余0.02mL接种菌液注射到茎基部外表皮，20-30℃继续培养番茄幼苗，15天后调查发病情况。
对比例1
本对比例提供了一种浸根接种鉴定方法，具体方法为：
(一)将番茄种子经杀菌处理后播种育苗盘，常规管理，待长到三片真叶、四片真叶或六片真叶时将番茄幼苗连根挖起，用自来水清洗出去根部土壤，用滤纸轻轻吸干表面水分，然后用无菌解剖刀将主根根尖0.2cm处切断，准备接种；
将番茄种子经杀菌处理后播种育苗盘，常规管理，待长到四片真叶时准备接种；
(二)挑取待鉴定病菌进行纯培养，28℃培养10d后，用无菌打孔器在待鉴定病菌平板培养菌落的边缘打取直径为6mm的菌饼4片，放入装有150mlPD液体培养基三角瓶中，150rpm·min-1，28℃振荡培养4d，用无菌水将培养液稀释为浓度为1×105孢子/ml、1×106孢子/ml或1×107孢子/ml的孢子悬浮液即为接种菌液；
(三)将步骤(一)准备好的番茄幼苗根部浸泡在步骤(二)准备好的孢子悬浮液中，20min后移栽到营养钵中，置于温室大棚中培养，温度为20～30℃，15天后统计调查发病情况。
对比例2
本对比例提供了一种棉球接种鉴定方法，具体方法为：
(一)将番茄种子经杀菌处理后播种育苗盘，常规管理，待长到三片真叶、四片真叶或六片真叶时，距离土表0.5～1.0cm处缠绕少量浸湿的医用脱脂棉球，准备接种；
(二)挑取待鉴定病菌进行纯培养，28℃培养10d后，用无菌打孔器在待鉴定病菌平板培养菌落的边缘打取直径为6mm的菌饼4片，放入装有150mlPD液体培养基三角瓶中，150rpm·min-1，28℃振荡培养4d，用无菌水将培养液稀释为浓度为1×105孢子/ml、1×106孢子/ml或1×107孢子/ml的孢子悬浮液即为接种菌液；
(三)在脱脂棉球内侧接触处接种0.5ml菌液，接种后迷雾保湿48h，20～30℃继续培养番茄幼苗，15天后调查发病情况。
正交实验设计：采用本发明注射接种法、对比例1的浸根接种法和对比例2的棉球接种法，按照浓度为1×105孢子/ml、1×106孢子/ml或1×107孢子/ml的孢子悬浮液作为接种菌液，在番茄幼苗待长到三片真叶、四片真叶或六片真叶时进行接种，根据番茄病情指数考察接种方法的有效性。
病情指数＝[Σ(病级数×该病级株数)/(最高病级数×调查总株数)]×100正交实验设计因素水平见表1：
表1
正交试验具体实施方案见表2：
表2
浸根接种法的番茄染病等级划分见表3：
表3：
棉球接种法和注射接种法的番茄染病等级划分见表4：
表4：
正交试验各处理组合间番茄染病差异结果见表5：
表5
通过正交试验各组合病情指数调查统计，运用spss软件进行差异显著性分析，结果如表5所示，接种苗龄为三片真叶时期、菌液浓度1×107孢子/ml、注射接种法发病效果最显著，为最适宜的番茄茎腐根腐病苗期接种方法。
说明书附图1和图2显示的实施例5注射接种菌液并培养15天后番茄幼苗的发病情况，由图1可以看出，本发明注射接种法培养的番茄幼苗植株生长瘦弱，茎基部明显凹陷，有深褐色病斑，根毛也部分脱落，主根有病斑；而图2番茄幼苗的茎腐根腐病发病较为严重，基本从茎基部折倒死亡。图3显示的对比例1和实施例2接种菌液并培养15天后番茄幼苗发病对比图，其中左侧植株为浸根接种法，右侧植株为注射接种法，左边幼苗茎基部颜色变深，根毛有部分腐烂脱落；右边幼苗生长缓慢矮小，茎基部凹陷腐烂，根毛大部分脱落，主根腐烂；由此说明在相同培养条件下，注射接种法使番茄幼苗染病更严重，更易于观察判断。

Claims (8)

1.一种番茄茎腐根腐病苗期快速接种鉴定方法，其特征在于所述鉴定方法将番茄幼苗培养至接种苗龄，用注射器吸取待鉴定病菌的接种菌液，由番茄幼苗的茎基部刺入并将接种菌液注射到番茄幼苗茎基部，一定温度下继续培养番茄幼苗，15天后调查发病情况。
2.根据权利要求1所述一种番茄茎腐根腐病苗期快速接种鉴定方法，其特征在于所述接种苗龄为番茄种子经杀菌处理后播种育苗盘，常规管理，待长到三片真叶、四片真叶或六片真叶时开始接种。
3.根据权利要求1或2所述一种番茄茎腐根腐病苗期快速接种鉴定方法，其特征在于所述接种菌液的量为0.1mL。
4.根据权利要求3所述一种番茄茎腐根腐病苗期快速接种鉴定方法，其特征在于所述待鉴定病菌的接种菌液的配制方法为：用无菌打孔器在待鉴定病菌平板培养菌落的边缘打取直径为6mm的菌饼4片，放入装有150mlPD液体培养基三角瓶中，150rpm·min-1，28℃振荡培养4d，用无菌水将培养液稀释为浓度为1×105孢子/ml、1×106孢子/ml或1×107孢子/ml的孢子悬浮液即为接种菌液。
5.根据权利要求4所述一种番茄茎腐根腐病苗期快速接种鉴定方法，其特征在于所述将待鉴定病菌的接种菌液注射到番茄幼苗茎基部采用多点注射，注射点3～5处，注射时将注射器刺入番茄幼苗的木质部。
6.根据权利要求5所述一种番茄茎腐根腐病苗期快速接种鉴定方法，其特征在于所述将待鉴定病菌的接种菌液注射到番茄幼苗茎基部还包括将接种菌液注射到番茄幼苗的茎基部外表皮。
7.根据权利要求6所述一种番茄茎腐根腐病苗期快速接种鉴定方法，其特征在于所述培养番茄幼苗的温度为20～30℃。
8.根据权利要求7所述一种番茄茎腐根腐病苗期快速接种鉴定方法，其特征在于所述番茄茎腐根腐病的发病等级划分为：0级-没有症状；1级-番茄下部叶片发黄，茎基部有腐烂；2级-次生根腐烂，茎基部明显凹陷；3级-植株发育缓慢，茎基部凹陷，维管束褐变，主根腐烂；4级-全株萎蔫、折倒、死亡。
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