CN111748603B - 一种玉米品种抗茎基腐病人工接种鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种玉米品种抗茎基腐病人工接种鉴定方法。属于农业技术领域。包括下列步骤：孢子悬浮液的配制、玉米抗性资源的准备、接种和统计数据；其中，接种：用注射器在距离地面1.2～1.7cm、注射器针头与茎成45°插入到茎的中心位置并缩回0.18～0.22cm后，注入1.4～1.6ml孢子悬浮液；拔出针头，正常管理和统计数据；统计数据：待接种25d后，统计植株发病情况，计算病情指数，并按病情指数确定抗感类型。本发明省时、省力、接种速度快，适合大量玉米抗性材料的筛选和调查。

Description

一种玉米品种抗茎基腐病人工接种鉴定方法

技术领域

本发明涉及农业技术领域，更具体的说是涉及一种玉米品种抗茎基腐病人工接种鉴定方法。

背景技术

玉米(Zea mays L.)是一种重要的粮食作物和饲料，在全球20多个国家为3.1亿人提供食物，占人类饮食总热量的20～30％。可靠的玉米生产是维持中国粮食安全和农业稳定的必要条件。然而，由各种病原菌引起的玉米茎腐病是世界上大多数玉米产区发生的最具破坏性的病害之一。玉米茎腐病是造成许多国家玉米产量和品质严重下降的原因，并已成为中国玉米生产的主要挑战之一。选育和利用抗病品种是最有效最经济的方法。而抗病品种的选育和筛选主要通过人工接种进行抗病性鉴定，适合的接种方法是非常关键的。

但是，国内外对玉米茎腐病的人工接种尚无统一的标准。常用的接种方法有埋入法、牙签法、钻孔法和注射法。这些方法中应用最多的人工接种的方法是根埋法，而埋根法发病率低，受环境影响大，接种效果稳定性差，且准备接种体和接种过程复杂工作量大。也有牙签法，其准备阶段工作量大，接种量不容易控制，不适合作大量的玉米抗性资源的鉴定。传统的已经报道的注射法是采用普通注射器接种，接种时期为玉米生长中后，用电钻将根茎部打孔后，用注射器将菌悬液注射到茎部，用凡士林堵住接种部位，该方法工作量大，后期发病不容易调查。目前，所报道的接种方法，均不适合大批量抗性材料的鉴定，

因此，提供一种玉米品种抗茎基腐病人工接种鉴定方法，适合大量玉米抗性材料的筛选和调查是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种玉米品种抗茎基腐病人工接种鉴定方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种玉米品种抗茎基腐病人工接种鉴定方法，包括下列步骤：

(1)孢子悬浮液的配制：将样本菌培养制备孢子悬浮液备用；

(2)玉米抗性资源的准备：种植玉米，待玉米长至6～8叶期接种；

(3)接种：用注射器在距离地面1.2～1.7cm、注射器针头与茎成45°插入到茎的中心位置并缩回0.18～0.22cm后，注入1.4～1.6ml步骤(2)所述孢子悬浮液；

(4)统计数据：待接种25d后，统计植株发病情况，计算病情指数，并按病情指数确定抗感类型。

有益效果在于，通过优选接种位置有利于悬浮液注射，避免堵塞针头。有利于为后期的统计分析工作打下坚实的鸡翅。；

优选的：步骤(1)样本菌的来源：市售代表菌株或经组织分离法对病株组织分离培养鉴定得到。

优选的：组织分离法对病株分离培养：取病健交接部分的组织，置于酒精中浸泡，取出置于升汞中浸泡，再经无菌水换洗，晒干后转移至PDA平板上封口，置于25～27℃环境，黑暗培养2～3d，挑取菌落进行纯化，备用。

有益效果在于：采取上述措施可以快速杀死表面杂菌，不影响真正病原菌分离，且简单和快捷。

优选的：酒精为质量体积比75％酒精，浸泡时间2～3s，所述升汞质量体积比0.1％，浸泡时间2～3min。

有益效果在于：处理时间过长，会把组织内的病原菌也都杀死，无法分离玉米茎基腐病菌，处理时间过短，组织表面的杂菌杀不死，无法分出真正的病原菌。

优选的：步骤(1)培养的具体步骤依次为：将样本菌株在PDA培养基上培养5～7d；更换培养基接种并培养5d后用无菌水冲洗得孢子悬浮液并用双层纱布过滤；调整孢子悬浮液浓度为1×10⁶孢子/ml。

有益效果在于：孢子悬浮液浓度过高，导致发病过重，抗病品种抗性表现不出来，孢子悬浮液浓度过低，多不发病，也测不出品种的抗性。

优选的：更换培养基：更换为高粱培养基，高粱培养基的制备方法：将高粱粒用水于100℃加热20min；再转移至三角瓶中经121℃、时间45min灭菌。

有益效果在于：配制孢子悬浮液要避免杂质和菌丝，否则容易造成针头堵塞；故而应对高粱灭菌处理。

优选的：接种并培养5d后用无菌水冲洗得孢子悬浮液：每个三角瓶中接种5～7个直径7mm菌碟；置于26℃环境黑暗培养，每天振荡三角瓶1～2次；待菌丝长满每个高粱粒的表面，用无菌水冲洗带菌的高粱粒得孢子悬浮液。

优选的：步骤(2)种植玉米：5月初，将待检测当地优势种植的玉米品种或品系种植到田间，每个玉米品种或品系3次重复，随机排列在田间，每个重复30株。

有益效果在于：把控好接种时机，玉米太小，发病太重，鉴定不出抗性品种，玉米太大，造成后期玉米数据统计难度增、工作量加大，且效果不理想。

优选的：步骤(3)注射器为耐尔尼三用注射器，并调节注射器每次注射量为1.5ml。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种玉米品种抗茎基腐病人工接种鉴定方法，取得的技术进步在于采用耐尔尼三用注射器在玉米6-8叶期进行接种，25d后调查玉米抗病性表现，省时、省力、和接种速度快，适合大量玉米品种抗性材料的筛选。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明提供的采用邻近法对黑龙江省玉米茎基腐病菌JBZ3的ITS序列进行系统发育树分析图。

图2附图为本发明提供的采用邻近法对黑龙江省玉米茎基腐病菌JHL7的ITS序列进行系统发育树分析图。

图3附图为本发明提供的耐尔尼三用注射器注射剂量调至1.5ml示意图。

图4附图为本发明提供的田间使用耐尔尼三用注射器将1.5ml孢子悬浮液图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例公开了一种玉米品种抗茎基腐病人工接种鉴定方法。

实施例所需原料、设备、均为市售渠道购买，满足试验需求即可，对其品牌来源不做限定，例如玉米茎基腐病菌禾谷镰孢代表性菌株(Fusarium graminearum)购自北钠生物菌株产品编号BNCC119762；层出镰孢(F.proliferatum)购自北钠生物菌株产品编号BNCC143058；未提及的试验方法均为实验室常规试验方法，在此不再赘述。

实施例1

玉米茎基腐病菌分离与鉴定

1.玉米茎基腐病样的采集

在中国黑龙江省6个地级市的15个地点采集了玉米秸秆样品，显示出茎节下部浅棕色病变和深棕色髓组织或茎髓解体。每个地点采10株以上病样，带回实验室进行分离。

2.制作培养基

马铃薯琼脂(PDA)培养基：取200g去皮马铃薯块，切成小块，加入少于1000mL水煮沸30min，用双层纱布过滤后，用蒸馏水补足1000mL,加入20g葡萄糖，少量多次加入共18g琼脂粉，并不断搅拌，分装至试管及锥形瓶内，后将其放置于温热灭菌器中121℃20min灭菌,备用。

康乃馨叶片(CLA)培养基：在无菌操作台中，将新鲜的的康乃馨叶片剪下，并剪成1cm长小段，经过70％酒精处理2min后，用无菌水换洗3次，用无菌滤纸吸干，放置在已准备好PDA养基上，每皿放置5-6块。

3.病原菌的分离与培养

采用组织分离法，将取回的带病茎秆用剪刀将病健交接部分剪下，并剪成0.5×0.5cm大小的小块组织，将剪好组织用镊子夹起放入75％酒精中浸泡2s，然后取出放入0.1％升汞中浸泡2～3min,再取出放置无菌水中换洗3次，转移至无菌的滤纸上晾干，放在提前准备好的PDA平板上，每个培养皿中放置4块，最后用封口膜封口，放于26℃培养箱中黑暗培养2～3d,待组织块周围长出菌落后，挑取菌落边缘进行纯化至试管中，备用。

4.致病力测定

采用菌丝块接种玉米茎基部的方法，种植玉米品种为良玉66的一批健康玉米植株。选取颗粒饱满，大小一致的玉米种子，在培养盆中放置500g高温灭菌土，将种胚向下放置摆在土壤中，每个盆中播种6粒，在上面覆盖约1cm土壤，浇水至微湿，放置在阳光适宜的地方。长至幼苗期，进行接种。用剪刀将茎叶部分剪下，留下倾斜伤口，以便扩大病菌接触面积，在已培养好的PDA培养皿上取下大约直径为0.5cm的圆形菌丝块，放置在灭菌枪头中，菌丝朝外，将枪头倒置扣在伤口处与其接触。每10盆中设置2盆对照组不进行接种。培养一段时间，对比健康植株与接种植株，记录发病情况与数据，并进行二次分离，将分离纯化后的菌丝与原菌丝进行对比，最终确认该病原菌是致病菌。

5.病原菌的鉴定

将分离到的菌株从形态学观察一致的挑取标志性菌株，转移至PDA和康乃馨叶片培养基上26℃黑暗培养5d，备用。

5.1形态学鉴定

鉴于《真菌鉴定手册》和《常见镰刀菌鉴定指南》对菌株进行初步的形态学鉴定。将菌碟在PDA和CLA培养基上培养5d后观察其菌落的大小、形态以及颜色等，并在显微镜下观察菌丝形态、分生孢子的大小、形态特征和着生方式，厚垣孢子的数量、形态特征和着生方式以及产孢细胞的形状等。

5.2分子生物学鉴定

为进一步确定分离物的种属，形态学鉴定归类后，选择标志性的菌株进行分子鉴定。用DNA试剂盒(离心柱型)对玉米茎基腐病病菌DNA进行提取，步骤如下：

首先，刮取适量菌丝放在1.5mLEP管中加入液氮中研磨，向研磨后的样品中加入400μL Buffer LP1和6μLRNaseA，振荡混匀后室温静置10min；加入600μL Buffer LP3后离心(12000rpm，1min)，保留吸附柱，丢弃离心液；加入500μL GW2后离心(12000rpm，1min)，丢弃离心液后重复该步骤；之后，12000rpm离心2min，弃废液，吸附柱室温下晾干；最后，在吸附膜上滴加75μL Buffer GE，室温下放置5min后离心(12000rpm，1min)，收集DNA溶液并检测。

除此之外，将提取的DNA用真菌通用引物ITS区和编码翻译延长因子1-alpha(TEF1-a)进行扩增，引物为：ITS1：5′-TCCGTAGGTGAAGCTGCGG-3′(SEQ ID NO.1)、ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′(SEQ ID NO.2)、EF-1F：5′-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3′(SEQ IDNO.3)、E F-1R：5′-TACTTGAAGGAACCCTTACC-3′(SEQ ID NO.4)。扩增体系及反应程序：Template 10pg-1μg、(ITS1 2μL、ITS4 2μL)或(EF-1F 2μL、EF-1R 2μL)、DNA 2μL、Taqmixture 25μL和ddH₂O 19μL；PCR反应程序如下表1：

表1

结果检测：用凝胶电泳检测DNA扩增产物。

序列测定：将电泳条带清晰的扩增产物送至上海生工测序，测序结果与G enBank数据库进行比较。

6.结果与分析

6.1病原真菌的分离与鉴定

从黑龙江省6个地级市15个地点采集的玉米病株中分离到152株具有致病力的真菌菌株。根据形态特征和分子鉴定的结合，这些分离物被鉴定为以下种类(表2)：32株禾谷镰孢(21.1％)、26株亚黏团镰孢(17.1％)、18株短臂镰孢(11.8％)、10株温和镰孢(6.6％)、26株谷类镰孢(17.1％)、8株层出镰孢(5.3％)、14株哈茨木霉(9.2％)和18株玉米平脐蠕孢(11.84％)。因此，禾谷镰孢和谷类镰孢被认为是引起黑龙江省玉米茎腐病的新优势菌株。

表2黑龙江省玉米茎腐病病原真菌种类及其分离频率

利用形态学特征鉴定了14株哈茨木霉和18株平脐蠕孢。从标志菌株(命名)JBZ3和JHL7的单孢分离培养物中提取基因组DNA，然后用通用真菌引物为：ITS1：5′-TCCGTAGGTGAAGCTGCGG-3′(SEQ ID NO.1)、ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′(SEQ IDNO.2)、EF-1F：5′-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3′(SEQ ID NO.3)、EF-1R：5′-TACTTGAAGGAACCCTTACC-3′(SEQ ID NO.4)。

扩增体系及反应程序：Template 10pg-1μg、(ITS1 2μL、ITS4 2μL)或(EF-1F 2μL、EF-1R 2μL)、DNA 2μL、Taq mixture 25μL和ddH₂O 19μL。

PCR反应程序为94℃,5min；94℃1min，58℃1min，72℃1min，第2～4步循环36次；72℃10min；4℃终止。对JBZ3和JHL7的PCR产物进行测序并存入GenBank数据库(ITS的检索号分别为MT378438和MT378439，TEF1-a的检索号分别为MT407981和MT407980)。Blast比对分析表明，JBZ3和JHL7的ITS序列分别与平脐蠕孢Bipolaris zeicola株CBS127731(登录号MH864760.1)和哈茨木霉Trichoderma harzianum株7-5(KU866299.1)的序列相似99.8％和99.5％；JBZ3和JHL7的TEF1-a序列分别与平脐蠕孢Bipolaris zeicola株BZ28(登录号KX834991.1)和strainW_NESO2_5_14(MN555297.1)的序列相似，分别为100％和99.7％。

利用邻接法构建和分析了JBZ3和JHL7的系统发育树，结果表明：JBZ3与玉米赤霉关系密切(图1)，JHL7与玉米赤霉关系密切(图2)。结合形态学特征、分子鉴定和系统发育树分析，将JBZ3和JHL7分别鉴定为玉米黑霉和哈茨曼霉。

由于禾谷镰孢和谷类镰孢被证实是东北地区玉米茎腐病的优势菌。表明东北地区玉米茎腐病病原菌种群结构日趋复杂。因此，监测各玉米产区玉米茎腐病病原菌的种群结构和致病性，对有效制定和实施玉米生产中的病害管理方案具有重要意义。

实施例2

玉米品种对茎基腐病的抗性鉴定

1.接种体的准备

由于禾谷镰孢和层出镰孢为黑龙江省玉米茎基腐病的优势菌，从市售渠道购买代表性菌株并分别在PDA平板上重新培养5d后，取直径7mm的菌碟接种到高粱粒培养基(高粱粒用开水煮20min后，转移至三角瓶中121℃45min灭菌)中，每个三角瓶中接种5～7个菌碟，26℃黑暗培养，每天振荡三角瓶1～2次，待菌丝长满每个高粱粒的表面。然后，用无菌水冲洗带菌的高粱粒，用灭菌双层纱布过滤后，利用血球计数板将孢子悬浮液浓度调整1×10⁶孢子/ml，三种病原菌孢子等量混合后，备用。

2.玉米品种的种植与管理

76个市售玉米品种植株于2019年和2020年五月初种植到黑龙江省哈尔滨市道外区民主乡某实验站，每个品种3次重复，随机排列在田间，每个重复30株，于5月初种植，正常田间管理，待长至6～8叶期接种。

3.接种

将准备好的孢子悬浮液装至接种瓶内，将耐尔尼三用注射器注射剂量调至1.5ml(图3)，距离地面1.5cm玉米茎基部将注射器针头刺入玉米茎的中心位置(针头面向地面与茎成45°斜插入)，缩回0.2cm针头，将孢子悬浮液注入其中(图4)，拔出针头，接种完毕，重复操作进行下一株接种。

4.发病情况统计调查

接种25天后，对植株进行田间调查，玉米茎基腐病分级标准为6个级别，分别为：0级无病症、1级叶片边缘有轻微坏死斑、3级植株略微矮小，无畸形，外缘叶片有较大坏死、5级植株矮小明显，有轻微畸形外缘叶片基本上缺失、7级植株矮小明显，畸形明显，植株无法正常生长，心叶出现坏死和9级植株矮小显著，畸形严重，心叶坏死或全株死亡。

5.结果与分析

相关公式为：

病情指数＝∑(各级病株数×相对级数值)/(调查总株数×9)×100

在76个品种中，抗茎腐病水平存在显著差异，未发现品种免疫(表3)。3个品种(3.9％)表现出较高的抗性，分别为嫩单13、垦单26和绥玉23。20个品种(26.3％)被鉴定为抗性，包括丰单5、九单57和克玉16等。28个品种(36.8％)被鉴定为感病品种，包括德美亚3、禾田2和鹏玉1等。25个品种(32.9％)被鉴定为高感病品种，包括绥玉20、垦单5和兴垦3等，从以上数据可以看出，近70％的品种是敏感或高度敏感的。

表3 76个玉米品种抗性抗茎基腐病的评价

^a三次重复的平均值；^bPDI＝疾病指数百分比；HR：高抗，PDI<10％；R:10％≤PDI<20％；S:20％≤PDI<40％；HS:40％≤PDI高敏。

结果表明，本发明采用耐尔尼三用注射器在玉米6～8叶期进行接种，25d后统计调查玉米抗病性表现，省时、省力、接种速度快，适合大量玉米品种抗性材料的筛选。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 东北农业大学

黑龙江省农业科学院玉米研究所

<120> 一种玉米品种抗茎基腐病人工接种鉴定方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tccgtaggtg aagctgcgg 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcctccgctt attgatatgc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

catcgagaag ttcgagaagg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tacttgaagg aacccttacc 20

Claims (3)

1.一种玉米品种抗茎基腐病人工接种鉴定方法，其特征在于，包括下列步骤：

(1)孢子悬浮液的配制：将样本菌培养制备孢子悬浮液备用；

(2)玉米抗性资源的准备：种植玉米，待玉米长至6～8叶期接种；

(3)接种：用注射器在距离地面1 .2～1 .7cm、注射器针头与茎成45°插入到茎的中心位置并缩回0 .18～0 .22cm后，注入1 .4～1 .6ml步骤(1)所述孢子悬浮液；

(4)统计数据：待接种25d后，统计植株发病情况，计算病情指数，并按病情指数确定抗感类型；

步骤(1)样本菌的来源：市售代表菌株或经组织分离法对病株组织分离培养鉴定得到；

所述组织分离法对病株分离培养：取病健交接部分的组织，置于酒精中浸泡，取出置于升汞中浸泡，再经无菌水换洗，晒干后转移至PDA平板上封口，置于25～27℃环境，黑暗培养2～3d，挑取菌落进行纯化，备用；

所述酒精为质量体积比75％酒精，浸泡时间2～3s，所述升汞质量体积比0 .1％，浸泡时间2～3min；

步骤(1)培养的具体步骤依次为：将样本菌株在PDA培养基上培养5～7d；更换培养基接种并培养5d后用无菌水冲洗得孢子悬浮液并用双层纱布过滤；调整孢子悬浮液浓度为1×10⁶孢子/ml；

所述更换培养基：更换为高粱培养基，所述高粱培养基的制备方法：将高粱粒用水于100℃加热20min；再转移至三角瓶中经121℃、时间45min灭菌；

所述接种并培养5d后用无菌水冲洗得孢子悬浮液：每个三角瓶中接种5～7个直径7mm菌碟；置于26℃环境黑暗培养，每天振荡三角瓶1～2次；待菌丝长满每个高粱粒的表面，用无菌水冲洗带菌的高粱粒得孢子悬浮液。

2.如权利要求1所述的一种玉米品种抗茎基腐病人工接种鉴定方法，其特征在于，步骤(2)所述种植玉米：5月初，将待检测当地优势种植的玉米品种或品系种植到田间，每个玉米品种或品系3次重复，随机排列在田间，每个重复30株。

3.如权利要求2所述的一种玉米品种抗茎基腐病人工接种鉴定方法，其特征在于，步骤(3)所述注射器为耐尔尼三用注射器，并调节注射器每次注射量为1 .5ml。

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