CN110157641A - 一株防治玉米茎基腐病的生防细菌bv23及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株防治玉米茎基腐病的生防细菌BV23及其应用，本发明从玉米根际分离到126株细菌中筛选出一株能有效防治玉米茎基腐病的生防菌株BV23，该菌株能够有效抑制玉米茎基腐病菌的菌丝生长，孢子产生和孢子萌发；在2次盆栽防治玉米苗期茎基腐病中防效分别为65.6％和67.9％，和空白对照相比，差异显著。

Description

一株防治玉米茎基腐病的生防细菌BV23及其应用
技术领域
本发明涉及农业微生物技术领域，更具体的说是涉及一株防治玉米茎基腐病的生防细菌BV23及其应用。
背景技术
玉米是我国的主要粮食作物，是世界上的第三粮食作物，中国是世界玉米主要生产和消费国之一，其产销量占世界总产量的20％左右，居世界第二位，仅次于美国。它不仅是主要的粮食作物，还是重要的饲料作物和加工原料，在食品、医药和工业等方面应用甚广。近年来，随着秸秆还田技术推广等原因，使玉米茎基腐病逐渐成为玉米生产中最主要病害之一。目前，在河南、山东、山西、广西、四川、黑龙江、吉林、云南、浙江、陕西等省发生并呈现出逐年加重的趋势。玉米茎基腐病(又称玉米茎腐病或玉米青枯病)，是一种世界性土传性病害。化学药剂防治是一种快速有效的防治方法，特别是在土传病害和种子带菌传播的病害上，有着不可代替的作用，但长时间的使用不仅造成病原菌抗药性的增加，使药效降低，而且也会造成农药残留等环境污染及人体健康等问题。特别是针对玉米茎基腐病，由于该病是全生育期发病，化学防治(生产上主要是种子包衣)一般只能控制苗期茎基腐，无法控制后期茎基腐病的发生，导致后期茎基腐病严重发生。
随着人们对环境保护意识的加深，生物防治在综合防治中所占的比例越来越重。国内外近年来有许多对于生物制剂的研究。Windels等研究发现采用木霉菌(Trichoderniaharzianum)处理待播种的种子，对防治玉米茎基腐病具有较好的效果。陈捷等报道由瓜果腐霉和禾谷镰孢引起的玉米茎基腐病，采用美国生产的两种生物农药BG-2、Soiled防治效果明显，分别对镰孢菌和腐霉菌的防效为55.14％和55.57％。陈捷等还报导应用绿色木霉(Trichoderma viride)和细菌在人工接种试验中，对霉菌和镰孢菌的防治效果分别是58.15％和56.25％，而在自然带有病原菌的土壤中防效可高达100％。这些研究为本发明提供了生物防治的可行性和理论研究基础。
因此，提供一株防治玉米茎基腐病的生防细菌BV23及其应用是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一株防治玉米茎基腐病的生防细菌BV23及其应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一株死谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)BV23，保藏编号为CGMCC No.17628。
死谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)BV23，保藏编号为CGMCC No.17628，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期2019年04月25日。
进一步，所述的死谷芽孢杆菌BV23在防治玉米茎基腐病中的应用。
进一步，所述的死谷芽孢杆菌BV23在制备抑制玉米茎基腐病菌禾谷镰孢菌丝生长制剂中的应用。
进一步，所述的死谷芽孢杆菌BV23在制备抑制玉米茎基腐病菌禾谷镰孢孢子产生制剂中的应用。
进一步，所述的死谷芽孢杆菌BV23在制备抑制玉米茎基腐病菌禾谷镰孢孢子萌发制剂中的应用。
进一步，所述的死谷芽孢杆菌BV23在制备植物病原真菌抑制剂中的应用，所述真菌为水稻立枯丝核菌、菜豆白绢病菌、水稻纹枯病菌、小麦肉孢核瑚菌、玉米禾谷镰孢、大豆尖镰孢、四季豆立枯丝核菌和玉米禾生腐霉中的一种或几种。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一株防治玉米茎基腐病的生防细菌BV23及其应用，本发明从玉米根际分离到126株细菌中筛选出一株能有效防治玉米茎基腐病的生防菌株BV23，该菌株能够有效抑制玉米茎基腐病菌的菌丝生长，孢子产生和孢子萌发；在2次盆栽防治玉米苗期茎基腐病中防效分别为65.6％和67.9％，和空白对照相比，差异显著。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明筛选出的BV23；
其中，两条平行线为BV23，中间为禾谷镰孢；
图2附图为本发明16S rRNA基因的拮抗细菌BV23的系统发育树。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1生防菌筛选
供试样品：土壤样品来自中国哈尔滨玉米种植区收集的玉米根际土。
供试方法：使用标准稀释平板法分离细菌，通过单菌落分离纯化培养的细菌分离物以测定其拮抗作用。
供试病原菌：玉米茎腐病菌禾谷镰孢(Fusarium graminearum)。
供试培养基：
马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂17～20g，水1000mL；pH7.0-7.2。
营养琼脂(NA)培养基：牛肉浸膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，琼脂20g，水1000mL；pH 7.0。
Luria-Bertani(LB)液体培养基：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 10.0g；水1000mL，用于培养细菌。
生防菌筛选：测试126种细菌分离株对禾谷镰孢的拮抗活性：
将禾谷镰孢在25℃下于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上生长5天；用打孔器打取以中点为圆心等距离(同龄)的菌丝体块(0.7厘米)置于PDA平板的中央。
细菌培养物在30℃的LB培养基中培养24h，然后用移菌钩蘸取细菌悬液在病原菌菌蝶两侧距离中心3cm处划线接种细菌(2条平行线/每个平板)。每个细菌分离物使用3个平板，在无菌操作台晾干培养基表面的水分后，将PDA平板放在26℃培养5d。
利用游标卡尺测量禾谷镰孢菌落的最长和最短半径，并且通过最长半径/最短半径量化细菌的拮抗活性。使用上述方法把具有拮抗禾谷镰孢活性的细菌分离株对其他真菌病原体进行测试。在相同的条件下重复试验两次。
共测试了126株细菌分离株，其中4株对禾谷镰孢的体外研究显示出强烈的拮抗活性。分离株23号(命名为BV23)(图1)具有最强的拮抗活性，最长半径/最短半径比为2.9，如表1所示。
表1玉米茎基腐禾谷镰孢部分生防菌筛选
实施例2BV23的鉴定
Ⅰ、传统形态学及生理生化反应鉴定
(1)供试材料
革兰氏染色：结晶紫染液、番红复染液、卢戈氏碘液、95％乙醇溶液。
(2)供试培养基和试剂
LB培养基、PDA培养基、明胶液化培养基、淀粉水解培养基、M.R.试验测定的培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、糖醇类发酵试验培养基、柠檬酸盐利用试验培养基、酪朊水解试验牛奶培养基、需氧性测定的培养基和V-P试剂。
(3)供试方法
参照Dong and Cai的《常见细菌系统鉴定手册》，通过形态学，生理学和生物化学特征来鉴定拮抗菌株。观察到的细菌形态包括：所述菌株在牛肉膏蛋白胨(NB)培养基菌落乳白色，圆形、中心稍隆起、表面透明、湿润；菌体呈杆状，具鞭毛，G+，有芽孢。生物化学特征包括过氧化氢酶，酪蛋白酶，硝酸还原酶，葡萄糖产酸和产气，明胶水解和淀粉水解的能力以及蔗糖，葡萄糖，内酯，甘露糖，柠檬酸盐和苯并唑的利用，根据MR的生理和生物化学特性使用Schaad等人的方法分析测试和VP测试。在相同的条件下重复两次试验。结果如表2所示。
表2生防细菌BV23生理生化分析
注：”+"表现阳性反应；”-"表现阴性反应。
从表2中可以看出，该细菌在革兰氏染色、接触酶反应、V-P试验、淀粉水解、硝酸盐还原试验、酪蛋白水解试验、M.R试验中均呈现阳性；BV23细菌为需氧菌，其中蔗糖、葡萄糖、果糖可用，而表2中其他不可用。
Ⅱ、分子鉴定
16s rDNA序列分析：使用天根植物基因组提取试剂盒(Tiangen Biotech，Beijing，China)提取BV23的基因组DNA。通过使用细菌特异性引物27f：(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；SEQ ID NO.1)和1492r(5’-TACCTTGTTACGACTT-3’；SEQ IDNO.2)进行16s rRNA基因扩增。在含有0.1ng DNA，2mM MgCl2，200μm每种dNTP，200nM每种引物和0.25U Taq DNA聚合酶(Invitrogen Carlsbad，CA，USA)的25μl反应混合物中进行聚合酶链式反应(PCR)。使用以下方案在热循环仪中进行扩增：94℃4min；94℃1min，54℃30秒，72℃2min，35个循环；最后延伸72℃10min。使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen，Germantown，MD，USA)按照产品说明纯化PCR产物。PCR产物用DNA级水稀释(FisherScientific，Pittsburgh，PA，USA)并由上海生物工程有限公司测序。将序列与GenBank数据库中可用的DNA序列进行比较，一致性达99％，通过系统分育树分析(见图2)，初步判定该BV23菌株为死谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)。
综上所述，从形态学、生理生化反应及分子生物学鉴定结果表明，BV23为死谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)。
实施例3田间防效的测定
(1)真菌扩繁
为了制备禾谷镰孢的接种物，将100g在水中浸泡12h的高粱种子用适量的水煮沸30min；然后，将煮过的高粱放入250mL三角瓶(每三角瓶20g)中并连续2次在121℃高压灭菌30min。
将禾谷镰孢在PDA培养基上培养5-6d的5个菌蝶(直径0.7cm)用移菌钩转移到具有灭菌的高粱的三角瓶中。将三角瓶在26℃下培养7d，并且每天手动振荡混合1次。
(2)生防细菌扩繁
将菌株BV23接种于LB培养基中，30℃振荡培养12h，取1mL转移至含有100mL LB的三角瓶中，30℃振荡培养120h。将液体培养基离心(5000rpm)，并将细菌沉淀物重新悬浮于无菌蒸馏水(SDW)中，并使用分光光度计(OD600＝0.1＝108cfu/mL)通过测量OD600将其调整至109cfu/mL。
(3)温室盆栽防效测定
在2016年和2017年进行了盆栽试验，以评价选定的细菌分离物对由禾谷镰孢引起的玉米茎腐病的防治效果。试验在温室中进行，将由禾谷镰孢完全定殖的10粒高粱种子均匀分布在塑料钵(10×10cm)的营养土(草炭土：蛭石2：1)顶部，然后覆盖0.5厘米的无菌营养土。在未接种的对照中，使用相同数量的灭菌高粱种子。将8粒玉米种子(栽培品种：绥玉10)用0.1％HgCl表面消毒5min，用无菌蒸馏水洗涤3次，然后播种到每个钵中。在2016年和2017年的试验中都包含了3次重复的5个处理：1)出苗后用细菌悬液灌根0.2mL/株；2)出苗后用细菌悬液灌根0.6mL/株；3)出苗后用细菌悬液灌根1.0mL/株；4)用10％嘧菌酯·戊唑醇·甲霜灵悬浮种衣剂(2g/kg种子)种子包衣；5)用未处理的种子进行对照。盆栽被保存在25±3℃的温室中，每隔1d对幼苗进行1次浇水以保持土壤水分。
(4)病害调查
在播种15d后调查植株发病情况，计算其发病率，结果如表3所示。
病害防治效果(％)＝(未处理对照的发病率-处理的发病率)/(未处理的发病率)×100％。
表3 BV23对玉米茎腐病盆栽的防效
注：BV 23使用浓度为1×109CFU/mL；化学杀菌剂为10％嘧菌酯·戊唑醇·甲霜灵悬浮种衣剂；不同处理包括不同的剂量。SE＝标准差；根据Duncan的多重范围检验，列后有不同字母的值有显著性差异(P<0.05)。
从表3可以看出，在2016年和2017年的试验中，与未处理的对照相比，施用0.2、0.6和1mL/株(109cfu/mL)的BV23使玉米茎腐病减少了54.2-67.9％，具有显著差异。以1mL/株施用BV23比0.2mL/株在该病害控制方面更有效。在施用1mL/株的BV23与通过10％嘧菌酯·戊唑醇·甲霜灵悬浮种衣剂对病害的控制之间没有显著差异。结果表明，BV23能够有效减少玉米茎腐病的发生，对玉米在表观上无药害产生。
实施例4BV23抑菌谱的测定
(1)供试病原菌
立枯丝核菌Rhizoctonia solani(水稻)，月状弯孢菌Curvularia lunata(玉米)，白绢病菌Athelia rolfsii(菜豆)，大豆疫霉Phytophthora megasperma(大豆)，链格孢菌Alternaria alternata(丁香)，轮枝镰孢Fusarium verticillioide(玉米)，水稻纹枯病菌Thanatephorus cucumeris(水稻)，肉孢核瑚菌Typhula incarnata Lasch(小麦)，立枯丝核菌R.solani(马铃薯)，禾谷镰孢F.graminearum(玉米)，尖镰孢F.oxysporum(大豆)，立枯丝核菌R.solani(四季豆)，木贼镰孢F.equiseti(大豆)，半裸镰孢F.semitectum(大豆)，腐皮镰孢F.solani(大豆)，瓜枝孢菌Cladosporium allii(黄瓜)，玉米大斑病菌Exserohilumturcicum(玉米)，禾生腐霉菌Pythium graminicola(玉米)，层出镰孢F.proliferatum(玉米)和亚黏团镰孢F.subglutinans(玉米)。
(2)供试方法
用移菌钩刮取少量拮抗细菌(BV23)并置于NA板上，在28℃培养48h后，在离PDA平板中心3cm处划线接种拮抗细菌。使用20种植物病原真菌扩繁后制作菌蝶(直径0.7cm)，在上述PDA板的中央接种并用封口膜密封。每种植物病原真菌重复3次，26℃培养6d。然后测量它们的最长半径和最短半径，结果如表4所示。
表4 BV23对20种植物病原菌菌丝生长的影响
a表示由病原真菌引起的不同作物病害；b根据Duncan的多重范围检验，列后有不同字母表示差异显著性(P<0.05)。
表4的结果表明，BV 23对其它真菌病原菌也有拮抗作用，其最长半径/最短半径比值为1.20～2.90；特别是，BV23对立枯丝核菌Rhizoctonia solani(水稻)，白绢病菌Athelia rolfsii(菜豆)，水稻纹枯病菌Thanatephorus cucumeris(水稻)，肉孢核瑚菌Typhula incarnataLasch(小麦)，禾谷镰孢F.graminearum(玉米)，尖镰孢F.oxysporum(大豆)，立枯丝核菌Rhizoctonia solani(四季豆)，和禾生腐霉菌Pythium graminicola(玉米)具有良好的拮抗作用。其中BV23对F.graminearum(玉米)的拮抗作用最强。
实施例5 BV23无菌滤液的抑菌机理测定
(1)BV23无菌滤液的获得
细菌分离株BV23在30℃振荡培养过夜，摇动过夜，将1mL转移到含有100mL LB的三角瓶中，并在30℃下振荡(170rpm)温育120h。使用细菌过滤器(膜孔径为0.2μm直径)过滤BV23的发酵液以获得无菌滤液。然后，使用无菌滤液测定BV23的抗菌机理。
(2)试验方法
挑取生防菌至100mL的LB培养基，28℃150r摇床振荡24h活化菌株，再用移液枪吸取1mL转接至另一LB培养基振摇5d。将菌液用0.22μm微孔滤膜过滤器过滤至灭菌的玻璃瓶中待用。
(3)BV23发酵液对禾谷镰孢孢子萌发的影响
将在PDA上于25℃培养5-6d的禾谷镰孢的5个菌蝶(直径0.7cm)转移到每个具有灭菌的高粱的三角瓶中。将三角瓶在26℃下培养一周，并且每1天手动晃动混合。用适量的无菌水洗涤含有禾谷镰孢的高粱，以在显微镜下调节禾谷镰孢的孢子悬浮液浓度(109个孢子/mL)。将无菌发酵液加入的孢子悬浮液中使其稀释至不同浓度(分别为1％，5％和10％)。每个处理重复3次。空白对照用无菌水代替。对禾谷镰孢孢子萌发进行计数，计算萌发率，结果见表5。对照孢子发芽率达60％以上，开始计数。
孢子萌发率(％)＝萌发孢子数/总孢子数×100；
孢子萌发抑制率(％)＝(对照孢子萌发率-处理孢子萌发率)/对照孢子萌发率×100％。
(4)BV23发酵液对禾谷镰孢孢子产生的影响
将在PDA上于25℃培养5-6d的禾谷镰孢用打孔器打成菌蝶(直径0.7cm)转移到新的PDA平板上，培养至4cm直径的菌落。添加15mL不同浓度(分别为1％，5％和10％)的无菌发酵液并刮取菌丝体，切除不含菌丝的培养基，每个处理重复3次，空白对照用无菌水代替。20min后，将培养平板中的液体移出培养皿中，在26℃下放入培养箱96h。用无菌水(15mL)洗涤后的各处理配成孢子悬浮液，采用血细胞计数法计数，计算抑制比率，结果见表5。
(5)BV23发酵液对禾谷镰孢菌丝生长的影响
将BV23发酵液加入PDA定量培养基中，制成不同浓度(分别为1％，5％和10％)的PDA平板，每个处理重复3次，空白对照用无菌水代替。然后在PDA平板中心于26℃下96h培养禾谷镰孢菌丝体(直径0.7cm)。测量菌落直径以计算抑制率，结果见表5。
抑菌率(％)＝[(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径]×100％。
表5 BV23无菌滤液对禾谷镰孢菌丝生长、分子萌发和产生的影响
注：a表示3个重复的菌落直径的平均值；b表示3个重复的分生孢子萌发率的平均值；c表示3个重复的分生孢子产生的平均值。不同小写字母在P<0.05时差异有显著性(P<0.05)。
从表5可以看出，BV2的次级代谢产物对菌丝生长，芽孢的萌发和产生具有较好的抑制作用，在使用浓度为(10％BV23发酵液)分别为66.2％、90.1％和86.7％。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 黑龙江省农业科学院土壤肥料与环境资源研究所
<120> 一株防治玉米茎基腐病的生防细菌BV23及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 2
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
taccttgtta cgactt 16

Claims (6)

1.一株死谷芽孢杆菌BV23，保藏编号为CGMCC No.17628。
2.根据权利要求1所述的死谷芽孢杆菌BV23在防治玉米茎基腐病中的应用。
3.根据权利要求1所述的死谷芽孢杆菌BV23在制备抑制玉米茎基腐病菌禾谷镰孢菌丝生长制剂中的应用。
4.根据权利要求1所述的死谷芽孢杆菌BV23在制备抑制玉米茎基腐病菌禾谷镰孢孢子产生制剂中的应用。
5.根据权利要求1所述的死谷芽孢杆菌BV23在制备抑制玉米茎基腐病菌禾谷镰孢孢子萌发制剂中的应用。
6.根据权利要求1所述的死谷芽孢杆菌BV23在制备植物病原真菌抑制剂中的应用，其特征在于，所述真菌为水稻立枯丝核菌、菜豆白绢病菌、水稻纹枯病菌、小麦肉孢核瑚菌、玉米禾谷镰孢、大豆尖镰孢、四季豆立枯丝核菌和玉米禾生腐霉中的一种或几种。
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