CN109370955A - 一株死谷芽胞杆菌hsb-2及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株死谷芽胞杆菌HSB‑2及其应用；其保藏号为CGMCC No.15305，16S rDNA序列如SEQ.ID.NO.1所示；本发明还涉及死谷芽胞杆菌HSB‑2在制备减轻苹果连作障碍菌肥中的应用；死谷芽胞杆菌HSB‑2对引起苹果连作障碍的四种镰孢菌属病原菌有明显的拮抗作用。利用死谷芽胞杆菌HSB‑2制作的菌肥，能促进平邑甜茶幼苗地上部及地下部的生长，在根际可以稳定定殖并显著抑制土壤中引起苹果连作障碍的腐皮、层出、轮枝和尖孢四种镰孢菌属病原菌的生长，能显著提高土壤脲酶、磷酸酶和蔗糖酶活性及根系保护酶SOD、POD、CAT活性，能减轻连作障碍。

Description

一株死谷芽胞杆菌HSB-2及其应用

技术领域

本发明涉及一株死谷芽胞杆菌HSB-2及其应用，属于果树栽培领域。

背景技术

受土地资源限制，苹果连作现象普遍存在，导致苹果连作障碍发生。研究发现引起意大利地区苹果连作障碍的主要病原菌是腐皮镰孢菌(Fusarium solani)和尖孢镰孢菌(F.oxysporum)；王晓宝等研究表明，镰孢菌属有害真菌是造成西北黄土高原和环渤海湾地区苹果连作障碍发生的主要病原菌；徐文凤和刘志分别从环渤海湾苹果产区的老龄苹果园土壤中分离到大量的尖孢镰孢菌(F.oxysporum)、轮枝镰孢菌(F.verticillioides)、腐皮镰孢菌(F.solani)和层出镰孢菌(F.proliferatum)，并验证其对平邑甜茶幼苗具有强致病性，张先富等也提到尖孢、轮枝、腐皮和层出镰孢菌是苹果连作障碍的有害病原真菌。

目前，防治苹果再植病害最有效的措施是土壤熏蒸技术，但存在应用困难、成本高，以及危害环境和人类健康等诸多问题而难以应用或被逐渐淘汰。相比之下，生物防治是一种可以产生抑制病原体活性的代谢物，并诱导植株提高抗性的新型方法，且具有绿色环保、成本低、可持续发展等特点。林英等从醋糟基质中分离到一株死谷芽胞杆菌(Bacillusvallismortis)CZ可有效防治由立枯丝核菌引起的黄瓜立枯病；张猛等从番茄植株中分离到1株对西瓜枯萎病菌具明显拮抗作用的内生死谷芽胞杆菌(B.vallismortis)wm005并具有广谱的抑菌效果；陈倩倩等发现，暹罗芽胞杆菌(B.siamensis)FJAT-28592能够分泌iturin A类的脂肽来抑制尖孢镰孢菌；陈志杰等研究发现暹罗芽胞杆菌(B.siamensis)4-z-3分泌的胞外蛋白质类抗菌活性物质对多种植物病原真菌都有显著的抑菌作用，且抑菌活性稳定。然而，目前少有芽胞杆菌在防治苹果连作障碍方面的研究。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一株死谷芽胞杆菌HSB-2及其应用；本发明从老龄苹果园健康果树根际土中分离得到了一株具有促生抑菌效果的死谷芽胞杆菌HSB-2，采用平板对峙法研究其对尖孢镰孢菌、轮枝镰孢菌、层出镰孢菌和腐皮镰孢菌的拮抗作用，并验证了死谷芽胞杆菌HSB-2在果树根际土壤中的定殖情况及其抑菌效果，说明其能作为减轻苹果连作障碍的生物防控。

一株死谷芽胞杆菌(B.vallismortis)HSB-2，已于2018年1月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.15305。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所；其16S rDNA序列如SEQ.ID.NO.1所示。

所述死谷芽胞杆菌HSB-2从老龄苹果园健康果树根际土壤中分离得到，经鉴定为死谷芽胞杆菌(Bacillus vallismortis)，命名为死谷芽胞杆菌HSB-2；HSB-2菌株在LB培养基上培养24h后，单菌落呈乳白色或微黄色，边缘不规则，表面褶皱干燥，粗糙不透明；在LB液体培养基中静止培养后有菌膜形成，好氧。扫描电镜下，HSB-2菌体呈杆状，两端钝圆，无鞭毛，大小为(0.6-0.8)μm×(1.8-2.2)μm。荧光显微镜100×/1.30油镜下观察，细胞呈短杆状，革兰氏染色呈阳性。能拮抗四种镰孢菌属病原菌。

本发明还涉及死谷芽胞杆菌HSB-2在制备减轻苹果连作障碍菌肥中的应用。

一种死谷芽胞杆菌HSB-2菌肥，先将载体进行高温灭菌，再将死谷芽胞杆菌HSB-2加入载体中，使载体中死谷芽胞杆菌HSB-2含量达到2×10⁸CFU/g，所述载体为现有的果树专用肥。

本发明有益效果：

1、本发明分离得到的死谷芽胞杆菌HSB-2对引起苹果连作障碍的四种镰孢菌属病原菌有明显的拮抗作用。

2、利用死谷芽胞杆菌HSB-2制作的菌肥，能促进平邑甜茶幼苗地上部及地下部的生长，在根际可以稳定定殖并显著抑制土壤中引起苹果连作障碍的腐皮、层出、轮枝和尖孢四种镰孢菌属病原菌的生长，能显著提高土壤脲酶、磷酸酶和蔗糖酶活性及根系保护酶SOD、POD、CAT活性，能减轻连作障碍。

附图说明

图1为HSB-2菌落、电镜及革兰氏染色形态；

图1说明：HSB-2菌株单菌落呈乳白色或微黄色，边缘不规则，表面褶皱干燥，粗糙不透明；扫描电镜下，HSB-2菌体呈杆状，两端钝圆，无鞭毛，大小为(0.6-0.8)μm×(1.8-2.2)μm；荧光显微镜100×/1.30油镜下观察，细胞呈短杆状，革兰氏染色呈阳性。

图2为HSB-2菌株与4种镰孢菌的对峙试验(PDA培养基)；

图2说明：HSB-2菌株对4种病原镰孢菌菌丝的生长有极强的抑制作用。在改良PDA培养基上对层出、腐皮、尖孢和轮枝镰孢菌的抑制率分别达到77.27％，68.18％，61.36％和65.90％，且均在菌落交界处产生抑菌带。

图3为HSB-2菌株16S rDNA序列的系统发育树；

图3说明：菌株HSB-2的16S rDNA基因序列和死谷芽胞杆菌B.vallismortis(AB021198.1)16S rDNA基因序列属于进化树内同一分支上，同源性最高(100％)。

图4为HSB-2的双抗菌株对平邑甜茶幼苗生长的影响；

图4说明：HSB-2的双抗菌株在不含抗生素的LB平板上转接5代后，遗传稳定性较好，且菌体形态与原菌株相比没有发生改变，平板对峙试验表明HSB-2双抗菌株的拮抗活性与原菌株并无明显差异，且接种HSB-2的双抗菌株培养液后的平邑甜茶幼苗生长正常。

图5为不同时间HSB-2在平邑甜茶幼苗根际土中的定殖情况；

图5说明：灌根结果显示在接种HSB-2的双抗菌株培养液后0d，1d，3d，7d，14d，21d，28d，35d均可回收到大量双抗标记的细菌菌株，且细菌的总量随时间的延长呈下降趋势，灌根接种35d后，根际土壤中的拮抗菌数量仍＞10⁷CFU/g，说明HSB-2在平邑甜茶幼苗根际土中有较强的定殖能力。

图6为不同处理对镰孢菌基因拷贝数的影响；

图6说明：菌株HSB-2处理显著降低了尖孢、轮枝、腐皮和层出镰孢菌的基因拷贝数，分别降低了60.0％、73.9％、57.1％和76.7％。可见，菌株HSB-2在土壤中对镰孢菌也有很好的抑制效果。

图7为不同处理对平邑甜茶幼苗根系形态的影响；

图7说明：菌株HSB-2处理后根系总长度、根系表面积、根尖数和分叉数分别是老果园土壤处理的3.86倍、5.16倍、2.38倍和5.52倍。可见，施加HSB-2菌肥处理可显著促进平邑甜茶幼苗根系的生长。

具体实施方式

本发明所涉及的培养基及组分如下：

1.酵母膏蛋白胨琼脂培养基LB：胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，NaCl 10.0g，琼脂15.0g，pH 7。

2.基础摇瓶发酵培养基：葡萄糖20.0g，蛋白胨20.0g，MgSO₄.7H₂O 0.5g，NaH₂PO₄.2H₂O 2.0g，Na₂HPO₄.2H₂O 4.0g，蒸馏水1000mL。

3.改良PDA培养基：马铃薯200.0g，牛肉膏5.0g，葡萄糖20.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1000mL。

4.发酵培养基:蔗糖20g，酵母膏15g，硫酸镁1g，磷酸二氢钠2g，磷酸氢二钠4g，温度30℃，pH 7.0。

实施例1

死谷芽胞杆菌HSB-2的分离纯化及筛选

1.拮抗菌株的分离纯化

采用如下改良的稀释涂布平板法分离根际细菌：新鲜土样过直径3～4mm的筛子，去除土壤中的杂质。称取5g根际土壤，加入盛有45mL无菌水的三角瓶中(带玻璃珠)，180rpm振荡30min，静置5min后，用无菌水系列稀释至1×10^-4，将梯度稀释的上清液取100μL涂布于LB平板上，重复三次，于28℃恒温培养箱中倒置培养。待平板内长出单菌落后，挑取不同形态的单菌落于新的LB平板上划线纯化。同时，将纯化的所有单菌落接种于液体LB培养基(胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，NaCl 10.0g，pH 7)中，在28℃下以180rpm恒定振荡12h，4℃下以10000r离心10min后倒掉上清液加入15％的甘油，-80℃储存。

2、拮抗菌株的筛选及其抑菌作用

采用平板对峙法测定上一步骤分离出的菌株对四种镰孢菌的拮抗作用，即先将分离出的菌株划线接种于LB平板(胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，NaCl 10.0g，琼脂15.0g，pH7)上，挑取单菌落接种于LB培养液中(250mL锥形瓶中装100mL)，在28℃下以180rpm恒定振荡培养48h，然后以10000r离心20min获得细菌菌体，将细菌重新悬浮于PBS缓冲液(pH7.0，1/25体积，10mmol·L^-1))中，调节浓度至1×10⁹CFU·mL^-1。在改良PDA培养基中央接种一块直径5mm的镰孢菌菌饼，然后将4个无菌滤纸片(直径6mm)等距离置于菌饼四周，每个滤纸片滴10μL细菌悬浮液，用无菌蒸馏水(SDW)作为对照，试验重复三次。所有平板在28℃下孵育7天，测量抑菌带的宽度并计算抑菌率。计算公式为：抑制率＝(对照菌落半径-处理菌落半径)/对照菌落半径×100％。

通过上述稀释涂布平板法，从莱州市沙河镇(H)、金城镇(D)及郭家店镇(X)3个老龄苹果园根际土壤中检测到133株细菌，分离纯化后进行平板对峙实验，其中46株细菌对镰孢菌具有抑制作用，在其周围形成抑菌圈，通过比较抑菌圈的大小，最终确定细菌HSB-2为试拮抗菌株(图1A)。

对峙试验结果表明，HSB-2菌株对4种病原镰孢菌菌丝的生长有极强的抑制作用(图2，表1)。其中对层出镰孢菌的抑制率较高，在改良PDA培养基上抑制率达到77.27％；对腐皮、尖孢和轮枝镰孢菌的抑制作用次之，在改良PDA培养基上抑制率分别达到68.18％，61.36％和65.90％，且均在菌落交界处产生抑菌带。

表1HSB-2菌株对4种镰孢菌的抑制率

–，没有抑菌圈；+，抑菌圈<5mm，抑制作用较弱，菌丝在细菌边缘处停止生长；

++，中度抑制，抑菌圈5～10mm；+++，抑制作用较强，抑菌圈>10mm。

实施例2

HSB-2菌株的分类鉴定

1.形态学及生理生化鉴定

将分离获得的HSB-2菌株在LB培养基上28℃培养24h，待出现单菌落，观察菌落形态特征。采用结晶紫进行革兰氏染色，并利用尼康荧光显微镜BX-51和扫描电子显微镜SU-8010观察细菌的形态和大小，扫描电子显微镜样品制备过程参见林英等的方法。生理生化特性分析按照《伯杰氏细菌鉴定手册(第二版)》和《常用细菌系统鉴定手册》的方法进行鉴定，每项指标检测3次，试验重复2次。

如图1所示，HSB-2菌株在LB培养基上培养24h后，单菌落呈乳白色或微黄色，边缘不规则，表面褶皱干燥，粗糙不透明(图1A)；在LB液体培养基中静止培养后有菌膜形成，好氧。扫描电镜下，HSB-2菌体呈杆状，两端钝圆，无鞭毛，大小为(0.6-0.8)μm×(1.8-2.2)μm(图1B)。荧光显微镜100×/1.30油镜下观察，细胞呈短杆状，革兰氏染色呈阳性(图1C)。

表2拮抗菌HSB-2的生理生化特征

注：“+”代表阳性反应或可利用；“－”代表阴性反应.

对HSB-2菌株进行12项生理生化指标检测，结果如表2所示，接触酶反应、过氧化氢反应、淀粉水解反应、吲哚实验、甲基红反应、柠檬酸盐利用、V-P反应和硝酸盐还原为阳性；丙二酸盐和明胶液化试验为阴性；可利用葡萄糖和蔗糖。根据HSB-2菌株以上生理生化结果，参考《伯杰氏细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》，初步推测HSB-2菌株属于芽胞杆菌属(Bacillus spp.)。

2.16S rDNA片段的扩增、序列分析及系统发育分析

将菌株接种于液体LB培养基中，在28℃下以200r/min的速度振荡培养12h，采用细菌基因组提取试剂盒抽提菌株全基因组DNA。使用引物27F(5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’)(SEQ.ID.NO.2)和1492R(5’GGTTACCTTGTTACGACTT33’)(SEQ.ID.NO.3)进行扩增，50μL PCR反应体系为总DNA含量3μL，引物各1μL，d NTP 1μL，10x PCR buffer 5μL，Taq DNA聚合酶0.6μL，ddH2O 38.4μL。PCR反应条件为：预变性94℃，4min；变性94℃，1.5min；退火55℃，1min；延伸72℃，1.5min；共30个循环，总延伸72℃，10min。扩增产物送往上海生工生物工程技术有限公司进行测序，测序结果通过国家生物技术信息中心(NCBI)核苷酸数据库进行BLAST比对，用MEGA 7.0.26软件，采用邻接法N-J聚类分析对分离的拮抗菌进行序列分析并构建系统发育树，自展值(bootstrap value)1000次重复检验。

如图3所示，HSB-2菌株16S rDNA基因序列长度为1452bp，其16S rDNA序列如SEQ.ID.NO.1所示。将此序列在NBCI的GenBank数据库中进行BLAST比对，结果表明HSB-2菌株的16S rDNA基因序列与死谷芽胞杆菌B.vallismortis(JF496324.1)的相似性为99％。结合MEGA 7.0.26，利用16S rDNA基因序列构建系统进化树，结果表明，菌株HSB-2的16S rDNA基因序列和死谷芽胞杆菌B.vallismortis(AB021198.1)16S rDNA基因序列属于进化树内同一分支上，同源性最高(100％)。结合以上分析表明HSB-2菌株为死谷芽胞杆菌B.vallismortis。

3.Biolog微生物自动分析系统

Biolog微生物鉴定系统(Biolog GEN III系统)能通过检测细菌利用微孔板上95种碳源进行有氧代谢活动产生的氧化还原产物与显色物质结合而导致吸光度变化以及由于微生物自身生长造成的浊度差异，生成特征指纹图谱，与标准菌株图谱数据库进行比对鉴定菌株。当细菌培养16～24h时，SIM值≥0.50，Biolog GEN III系统自动给出鉴定结果，SIM值越接近1.00，鉴定结果越准确。

表3HSB-2菌株Biolog生理生化鉴定结果

Biolog微生物鉴定系统通过细菌对不同碳源的利用进行菌株鉴定。表3结果显示Species ID:Bacillus vallismortis/subtilis，PROB、SIM、DIST的值分别为0.582、0.582、6.157；SIM＞5，说明匹配结果可靠。结合HSB-2菌株的形态特征及生理生化结果，判断HSB-2为芽胞杆菌属。

实施例3

拮抗细菌的双抗标记和定殖情况

1.拮抗细菌的双抗标记

参考陈长卿等的方法加以改动，先将菌株HSB-2涂布于含利福平0.5μg·mL^-1的LB平板上培养，待长出单菌落后，选取生长情况良好和原始菌落形态相同的抗性菌株转接到下一个倍比浓度的LB平板上，逐步筛选出在含350μg·mL^-1利福平的LB平板上稳定生长的抗性菌株HSB-2，在此基础上，用同样的方法诱导抗性菌株HSB-2产生对硫酸链霉素的抗性，起始硫酸链霉素质量浓度为0.5μg·mL^-1，逐步提高硫酸链霉素浓度至320μg·mL^-1，最终获得HSB-2的双抗菌株。

2.HSB-2双抗菌株的遗传稳定性检测

将HSB-2双抗菌株在不含抗生素的LB平板(胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，NaCl10.0g，琼脂15.0g，pH 7)上转接继代培养，连续培养5代，分别获得菌株HSB-2双抗菌株子代F1～F5。再回接至含350μg·mL^-1利福平和320μg·mL^-1硫酸链霉素的LB平板上，分别测定F1～F5HSB-2的双抗菌株与HSB-2菌株菌体形态的异同，以证明其耐药性的遗传稳定性，并采用平板对峙法检测抑菌活性。

3.HSB-2双抗菌株在平邑甜茶幼苗根际土的定殖和消长动态检测

试验于山东农业大学本部根窖大棚内进行，参考陈羽等的方法，将HSB-2双抗菌株在含有350μg·mL^-1利福平和320μg·mL^-1硫酸链霉素的酵母膏蛋白胨液体培养基中振荡培养(28℃，180r·min^-1)(OD600≈1)，按体积比3％的接种量转接到含有350μg·mL^-1利福平和320μg·mL^-1硫酸链霉素的基础摇瓶发酵液体培养基中振荡培养(28℃，180r·min^-1)24h浓度约为1×10⁸CFU·mL^-1)，在栽植平邑甜茶幼苗后第3天，采用灌根法接种，每盆(盆高为140mm，盆口直径为120mm)浇灌25mL HSB-2双抗菌株的菌液，同时以基础摇瓶发酵液体培养基作为对照。

供试土壤和蛭石均进行灭菌处理，采用高压蒸汽灭菌，在121℃下灭菌30min，灭菌3次，每隔3天灭菌1次，灭菌后按照每盆先装入200mL无菌蛭石，再装入300g无菌土，栽植平邑甜茶幼苗后浇灌100mL自来水，每盆浇灌25mL HSB-2双抗菌株菌液后覆100mL无菌蛭石。后期管理每隔三天浇50mL自来水，分别于接种后0d，1d，3d，7d，14d，21d，28d，35d随机选择三盆进行取样，取样方法参照杨洪凤(杨洪凤，余向阳，薛雅蓉，刘常宏.内生解淀粉芽孢杆菌CC09在小麦根部定殖的电镜观察及防病效果[J].中国生物防治学报，2014，30(06):839-844)等，拔出幼苗后，抖落大部分土壤，留取少量根际土，剪下根系称重(m₁)，置于装有20mL无菌水的三角瓶中，用手轻摇30s后取出根系，将土壤悬液于200r/min摇床振荡30min，然后超声波(40Hz)处理4min，静置5min得上清液，将采过根际土的根系取出后，用滤纸吸尽根周围的水分并称重(m₂)，根际土壤质量为m₁-m₂。取0.5mL上清液置于4.5mL无菌水中，逐级梯度稀释，取100μL不同梯度的稀释液涂抹于含350μg·mL^-1利福平和320μg·mL^-1硫酸链霉素的LB平板上，28℃培养2d，重复三次，回收的菌株经生理生化特征分析和拮抗作用检测确定其为所施菌株HSB-2双抗菌株。计算每克根际土壤的菌落形成单位(CFU·g^-1)，计算公式如下：

菌株定量＝[每平板平均菌落数(CFU)×土样样品的定容体积(mL)×稀释倍数]/[涂布平板的菌液量(mL)×土壤重量(m₁－m₂)]

采用双抗标记的方法，逐步诱导HSB-2菌株产生抗药性，最终获得了能在含350μg·mL^-1利福平和320μg·mL^-1硫酸链霉素的LB平板上正常生长的双抗菌株HSB-2。HSB-2双抗菌株在不含抗生素的LB平板上转接5代后，遗传稳定性较好，且菌体形态与原菌株相比没有发生改变，平板对峙试验表明HSB-2双抗菌株的拮抗活性与原菌株并无明显差异，且接种HSB-2双抗菌株培养液后的平邑甜茶幼苗生长正常(图4)，表明HSB-2双抗菌株对植株无害，可用于定殖试验。灌根结果显示在接种HSB-2双抗菌株培养液后0d，1d，3d，7d，14d，21d，28d，35d均可回收到大量双抗标记的细菌菌株，且细菌的总量随时间的延长呈下降趋势，灌根接种35d后，根际土壤中的拮抗菌数量仍＞10⁷CFU·g^-1(图5)，说明HSB-2在平邑甜茶幼苗根际土中有较强的定殖能力。

实施例四

盆栽试验

1.HSB-2菌肥制作

HSB-2菌肥制作方法如下：先将HSB-2菌株进行液体发酵得到HSB-2液体菌剂(发酵培养基为：蔗糖20g，酵母膏15g，硫酸镁1g，磷酸二氢钠2g，磷酸氢二钠4g，温度30℃，pH7.0)，然后将HSB-2液体菌剂充分与灭菌的载体混合均匀，使HSB-2液体菌剂与载体的混合物湿度为45％，以手握不留水印为宜；搅拌均匀后放在遮阳处盖上塑料布静置12-24小时，温度保持在35-38度；12-24小时后，再把液体菌剂与载体的混合物装入密封容器内，发酵15天后即可使用。所述的载体为牛粪：农作物秸秆＝3：1(质量比)的混合物。

2.试验设计

试验于山东农业大学国家苹果工程实验中心及苹果重茬与微生物实验室进行。2017年5月，将平邑甜茶幼苗(Malus hupeheusis Rehd.seedling)移栽至(外径38cm，内径28cm，高度26cm)泥瓦盆中，每盆装约7.543kg土壤，每盆定植3株幼苗，缓苗期结束后间掉1株，每个处理重复20盆。盆栽土壤分为以下4个处理：26年生老果园土壤(CK1)，26年生老果园土壤经溴甲烷熏蒸(CK2)，HSB-2菌肥处理(T1)，菌肥载体处理(只用牛粪和农作物秸秆按质量比3：1的混合物)(T2)，统一正常水肥管理。于2017年8月15日进行取样，每个处理随机选择三盆长势一致的幼苗，去除表层及盆周围土壤，用直径2mm的筛过滤土壤杂质，并将土壤样品装于无菌塑料密封袋中，带回放于-80℃，以提取土壤DNA用于进一步的实时荧光定量PCR分析，对土壤中的镰孢菌基因拷贝数进行检测，验证菌株HSB-2在土壤中对四种镰孢菌的抑制效果。幼苗洗涤干净并运回实验室进行生物量等指标的测定。

3.测定指标

用卷尺、游标卡尺和电子秤分别测定幼苗株高、地径和干鲜重。

用专业版Win RHIZO(2007年版)根系分析系统分析处理样品图像，记录根系总长度、根系表面积、分叉数和根尖数。

取0.5g过筛的新鲜土壤，按土壤DNA提取试剂盒操作步骤提取DNA，采用CFX96TMThermal Cycler(Bio-Rad)对土壤中4种镰孢菌的基因拷贝数进行实时荧光定量分析，验证HSB-2菌株在土壤中对4种镰孢菌抑制效果，特异性引物及反应步骤参考李家家的方法。

4.HSB-2菌株对平邑甜茶幼苗的促进生长作用

由表4可以看出，与老果园土壤处理(CK1)相比，HSB-2菌肥(T1)显著促进了连作平邑甜茶幼苗的株高、地径、地上部鲜重、地下部鲜重、地上部干重和地下部干重，分别增加了89.8％、53.4％、215.6％、176.8％、271.8％和201.4％，且HSB-2菌肥处理后连作平邑甜茶幼苗的株高、地径、地上部鲜重、地下部鲜重、地上部干重和地下部干重，分别是菌肥载体处理(T2)的1.64倍、1.28倍、1.64倍、1.67倍、1.72倍和1.64倍。可见，施用HSB-2菌肥可显著促进平邑甜茶幼苗的生长。

表4HSB-2菌肥对平邑甜茶幼苗生物量的影响

注：不同小写字母表示在0.05水平差异显著(Duncan’s检测)。Note:Differentletters indicate significantly different at 5％level by Duncan’s new multiplerange test.

5.土壤中HSB-2菌株对四种镰孢菌的抑制效果

从图6可以看出，与老果园土壤处理(CK1)相比，菌株HSB-2处理(T1)显著降低了尖孢、轮枝、腐皮和层出镰孢菌的基因拷贝数，分别降低了60.0％、73.9％、57.1％和76.7％；而菌肥载体处理(T2)后土壤中尖孢、轮枝、腐皮和层出镰孢菌的基因拷贝数分别增加了14.3％、46.6％、66.4％和70.9％，说明HSB-2菌肥施入土壤后可大量繁殖，使四种镰孢菌的生长繁殖受到抑制，可见，菌株HSB-2在土壤中对四种镰孢菌也有很好的抑制效果。

6.拮抗细菌对根系形态的影响

如图7所示，菌株HSB-2处理(T1)后根系总长度、根系表面积、根尖数和分叉数分别是老果园土壤处理(CK1)的3.86倍、5.16倍、2.38倍和5.52倍，但效果仍不及溴甲烷熏蒸处理(CK2)；与菌肥载体处理(T2)相比，菌株HSB-2处理后根系总长度、根系表面积、根尖数和分叉数分别增加了42.14％、71.2％、18.97％和71.42％，可见，施加HSB-2菌肥可显著促进平邑甜茶幼苗根系的生长。

序列表

<110> 山东农业大学

<120> 一株死谷芽胞杆菌HSB-2及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1452

<212> DNA

<213> 微生物(人工序列)

<400> 1

gcgtttgcgg cgtttctata catgcagtcg agcggacaga tgggagcttg ctccctgatg 60

ttagcggcgg acgggtgagt aacacgtggg taacctgcct gtaagactgg gataactccg 120

ggaaaccggg gctaataccg gatggttgtt tgaaccgcat ggttcagaca taaaaggtgg 180

cttcggctac cacttacaga tggacccgcg gcaccactta cagatggacc cgcggcgcat 240

tagctagttg gtgaggtaat ggctcaccaa ggcaacgatg cgtagccgac ctgagagggt 300

gatcggccac actgggactg agacacggcc cagactccta cgggaggcag cagtagggaa 360

tcttccgcaa tggacgaaag tctgacggag caacgccgcg tgagtgatga aggttttcgg 420

atcgtaaagc tctgttgtta gggaagaaca agtgccgttc aaatagggcg gcaccttgac 480

ggtacctaac cagaaagcca cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg 540

gcaagcgttg tccggaatta tttttcttaa gtctgatgtg aaagcccccg gctcaaccgg 600

ggagggtcat tggaaactgg ggaacttgag tgcagaagag gagagtggaa ttccacgtgt 660

agcggtgaaa tgcgtagaga tgtggaggaa caccagtggc gaaggcgact ctctggtctg 720

taactgacgc tgaggagcga aagcgtgggg agcgaacagg attagatacc ctggtagtcc 780

acgccgtaaa cgatgagtgc taagtgttag ggggtttccg ccccttagtg ctgcagctaa 840

cgcattaagc actccgcctg gggagtacgg tcgcaagact gaaactcaaa ggaattgacg 900

ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc 960

aggtcttgac atcctctgac aatcctagag ataggacgtc cccttcgggg gcagagtgac 1020

aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga 1080

gcgcaaccct tgatcttagt tgccagcatt cagttgggca ctctaaggtg actgccggtg 1140

acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga cctgggctac 1200

acacgtgcta caatggacag aacaaagggc agcgaaaccg cgaggttaag ccaatcccac 1260

aaatctgttc tcagttcgga tcgcagtctg caactcgact gcgtgaagct ggaatcgcta 1320

gtaatcgcgg atcagcatgc cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt 1380

cacaccacga gagtttgtaa cacccgaagt cggtgaggta acctttatgg agccagccgc 1440

cgaaggtgat cg 1452

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 27F (人工序列)

<400> 2

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 1492R(人工序列)

<400> 3

ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (3)

1.一株死谷芽胞杆菌(B.vallismortis)HSB-2，保藏号：CGMCC No.15305，已于2018年1月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；其16S rDNA序列如SEQ.ID.NO.1所示。

2.如权利要求1所述的死谷芽胞杆菌HSB-2在制备减轻苹果连作障碍菌肥中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，是将死谷芽胞杆菌HSB-2加入载体中，使载体中死谷芽胞杆菌HSB-2含量达到2×10⁸CFU/g，所述载体为果树专用肥。