CN101812412B - 蜡样芽孢杆菌及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有防治小麦纹枯病功能的蜡样芽孢杆菌及其制备方法和应用。本发明的菌株Bacillus cereus0-9 CCTCC No.M209041。对小麦纹枯病进行生物防治：将菌株Bacillus cereus0-9 CCTCC No.M209041在KMB液体培养基中28℃，200rpm扩大培养后，制备菌悬液，对小麦种子进行1h浸泡，将处理过的麦种播种于染病土壤，并以该细菌发酵液做一次灌根处理。本发明的菌株为小麦内生Bacillus cereus细菌，可以在小麦豫麦17中大量定殖，对小麦纹枯病具有较好的防效(82.86％)，且效果稳定，具有较好的推广应用前景。

Description

蜡样芽孢杆菌及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种蜡样芽孢杆菌，同时还涉及一种该蜡样芽孢杆菌的制备方法，及其在防治小麦纹枯病方面的应用。

背景技术

由禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)侵染小麦引起的小麦纹枯病(wheatsharp eyespot)是一种重要的土传病害，在我国广泛分布于黄淮冬麦区、西北春麦区和长江中下游麦区，严重危害到小麦的生产，一般田块可减产10％～30％，重病田块减产50％以上，个别田块甚至绝收。

目前，对于小麦纹枯病，尚缺乏有效抗病品种，病害的防治主要通过化学防治的方法，生产中主要采用立克秀、适乐时、三唑类等化学杀菌剂。由于农药的大量使用，不仅导致小麦种植成本的提高，还对环境造成危害，甚至导致抗药性菌株的出现，致使化学农药的防效降低或者丧失。生物防治作为一种有广泛前途的植物病害的防治方法，目前已经成为国内外研究和应用的热点，但是，由于传统生物防治是通过根际微生物及其代谢产物对病原物的竞争、拮抗以及诱导植物产生抗病作用(Induced systemic resistance，ISR)来实现的，容易受环境条件的影响，在实际应用过程中出现防效不稳定的现象。

植物内生细菌是指能定殖在健康植物组织内，并与植物建立了和谐关系的一类细菌。利用定殖于小麦内部的内生细菌来进行生物防治，可以克服上述传统生物防治的不足，具有重要的理论意义和广泛的应用前景。因此有必要加强筛选对病害有较高防治效果的小麦内生细菌，从而加以应用。目前关于用内生芽孢杆菌来防治小麦纹枯病的研究中，没有任何关于用蜡样芽孢杆菌的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种从拔节期健康小麦植株中分离筛选得到一株具有防治小麦纹枯病的内生细菌——蜡样芽孢杆菌。

同时，本发明的目的还在于提供一种该蜡样芽孢杆菌的制备方法。

更进一步地，本发明的目的在于提供了一种蜡样芽孢杆菌的应用。

为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了一种蜡样芽孢杆菌，Bacilluscereus O-9，其保藏号为CCTCC NO：M209041。

同时，本发明的技术方案采用了一种蜡样芽孢杆菌的制备方法，选取健康小麦，取新鲜小麦根，自来水冲洗表面，滤纸吸去水分，经消毒、无菌水冲洗2-4次后剪小段于无菌研钵中，加入无菌磷酸缓冲液(pH 7.0)，充分研碎；静止10-20min取上清进行稀释，取稀释液经培养基在28-30℃培养1-2d；菌落长出后再纯化于4-6℃保存。

所述的消毒是先用75％乙醇表面消毒25-35s，再用0.1％升汞消毒10-15min。

所述的培养基的具体成分为：蛋白胨20g，甘油10.0g，K₂HPO₄1.5g，MgSO₄·7H₂O 1.5g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH 7.2。

胰蛋白胨(tryptone)5g、酵母提取物(yeast extract)2.5g、NaCl 5g，琼脂粉15g溶解于800ml去离子水中，调pH至7.5。

进一步地，本发明的技术方案采用了一种蜡样芽孢杆菌在预防小麦纹枯病方面的应用及蜡样芽孢杆菌在治疗小麦纹枯病方面的应用。

本发明的用于防治小麦纹枯病的菌株为蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)O-9，该菌株是从黄淮麦区，拔节期小麦植株中分离得到的，短杆状，个体较小，两端钝圆，革兰氏阴性，接触酶实验阴性，不产生芽孢，在LB平板上菌落不透明、光滑、湿润、白色、全缘，该菌具有运动性，产生几丁质酶、铁载体等可能的生防相关因子。

本发明按照常规方法进行对小麦纹枯病的生物防治：将蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)O-9在KMB培养基中扩大培养后，制备成一定浓度的菌悬液，以此菌悬液处理小麦种子，将处理后的种子播种于感染了纹枯病菌的土壤，再以蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)O-9发酵液做一次浇灌；20天后，统计小麦纹枯病发病情况，计算防效。

本发明所涉及的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)O-9在防治小麦纹枯病方面的效果明显优于其他芽孢杆菌。

以下为本发明的菌株与现有的菌株在防治小麦纹枯病方面的对比

现有的菌株：枯草芽孢杆菌B1-41对小麦纹枯病菌的抑制作用.微生物学杂志200626(4)20～23

防效测定方法：小麦种子用0.1％升汞表面消毒5min，再用无菌水充分洗涤，置于液体培养所得的细菌液浸种过夜，播种于无菌土中，每重复20粒种子，重复3次，出苗后接种小麦纹枯菌，4周后调查发病率，计算控病效果。同时分别设置利用井冈霉素处理和仅用原始病菌作为对照。接种3周后调查，计算拮抗菌对小麦纹枯病的防治效果。

所用菌株：枯草芽孢杆菌

平均防效：60.3％

对照井冈霉素防效：52％。

本发明的菌株：采用以上所列防效测定方法，测得本发明的蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus0-9对小麦纹枯病的平均防效为74.6％。

本发明的蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus O-9分离方法如下：

从黄淮麦区大田中选取健康小麦，取新鲜小麦根，自来水冲洗表面，滤纸吸去水分，经75％乙醇表面消毒30s、0.1％升汞消毒10min、无菌水冲洗3次后剪小段于无菌研钵中，加入6mL无菌磷酸缓冲液(pH 7.0)，充分研碎。静止10min取上清进行10倍、50倍、100倍稀释，取各稀释液200μL涂KMB(蛋白胨20g，甘油10.0g，K₂HPO₄1.5g，MgSO₄·7H₂O 1.5g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH 7.2)平板，28℃培养1-2d；菌落长出后再纯化于4℃保存。

蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)O-9在LB平板上菌落呈扁平圆形，米黄色，表面湿润不透明，类似细小颗粒状。该菌具有运动性，产生葡聚糖酶、几丁质酶、蛋白酶、铁载体等，并有利福平抗性，其他生化属性如表1，经16s rDNA鉴定为蜡样芽孢杆菌，与其他变形斑沙雷氏菌的主要区别在于可在小麦根部大量定殖且对纹枯病有稳定防效。

表1菌株0-9鉴别特征

注：+，阳性；-，阴性

本发明的菌株：蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)O-9已经保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为：2009年3月17日，其保藏编号为CCTCC NO：M209041。

附图说明

图1为本发明的蜡样芽孢杆菌Bacillus cereusO-9处理的病菌指数曲线。

具体实施方式

实施例1

从黄淮麦区大田中选取健康小麦(豫麦17)，取新鲜小麦根，自来水冲洗表面，滤纸吸去水分，经75％乙醇表面消毒30s、0.1％升汞消毒10min、无菌水冲洗3次后剪小段于无菌研钵中，加入6mL无菌磷酸缓冲液(pH 7.0)，充分研碎。静止10min取上清进行10倍、50倍、100倍稀释，取各稀释液200μL涂KMB(蛋白胨20g，甘油10.0g，K₂HPO₄1.5g，MgSO₄·7H₂O 1.5g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH 7.2)平板，28℃培养1-2d；菌落长出后再纯化于4℃保存。

将保存的菌株接种于液体KMB培养基扩大培养(28℃，200rpm，1d)，离心收集菌体，以无菌水调整均悬液浓度为2×109cfu/mL，以该菌悬液对催芽后的内乡182小麦种子浸泡1h。将处理过的麦种播种于染小麦纹枯病病原菌的土壤，统计不同菌株的防效，挑取防效较好的菌株进行重复实验，反复筛选。

实施例2

本实施例与实施例1的区别仅在于分离培养基为改良LB，其配方为：胰蛋白胨(tryptone)5g、酵母提取物(yeast extract)2.5g、NaCl 5g，琼脂粉15g溶解于800ml去离子水中，调pH至7.5，加去离子水至总体积1L。

本发明的蜡样芽孢杆菌Bacillus cereusO-9的斜面保存：

斜面培养基为KMB(蛋白胨20g，甘油10.0g，K₂HPO₄1.5g，MgSO₄·7H₂O1.5g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH 7.2)，将Bacillus cereus0-9划线接种于斜面培养基上，28℃温度下培养24h，将斜面于4℃冰箱保存，每两个月进行一次传代，保证其存活。

蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus0-9定殖数量测定：

(1)小麦催芽

豫麦17麦种经表面消毒75％酒精浸泡30s后置于0.1％升汞中消毒10min，无菌水冲洗3次，无菌水浸泡8h，26℃催芽至露白，再表面消毒一次，75％酒精浸30s后置于0.1％升汞中消毒10min，无菌水冲洗3次。

(2)定殖方法

①实验处理

将已催芽小麦在生防菌菌悬液中浸种1h，后用无菌镊子放入含100mL淘洗干净灭菌沙的250mL三角瓶中，每瓶5粒，无菌沙覆盖麦子并浇灌生防菌菌悬液20mL，每细菌处理3瓶，用无菌容器封口膜封口，以无菌水浸种、浇灌的处理作为对照。22℃培养7d。实验重复3次。

②检测

用无菌水洗出生长7d的麦苗，剪取清洗干净的根部进行表面消毒，0.1％升汞中消毒10min，无菌水冲洗3次，消毒滤纸吸干表面水分，单株小麦根称重置于灭菌研钵中并加入已灭菌BPS(6mLBPS/g根)，研碎。静止10min取上清进行10倍、100倍稀释，取各稀释液200μL涂含利福平的KMB平板，28℃培养1-2d；吸取最后一次冲水涂布于KMB平板，检测表面消毒是否彻底。待平板上长出菌落后计算cfu/g值，并挑取与长出的菌落与出发菌比较生理生化特性差异。

经形态与菌株特性比较，平板上长出的菌与出发菌Bacillus cereus0-9相同，6次实验，平均结果为1.4×105cfu/g，说明该菌株可以在小麦根部长期稳定定殖。

蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus0-9生防活性测试试验

1、Bacillus cereus0-9的扩大培养

将Bacillus cereus0-9斜面培养物接种于含60mL KMB液体培养基的250mL三角瓶中，28℃，200r/min，摇培24h，离心取菌体(16℃8000r/min5min)，用无菌水配成2×109cfu/mL的菌悬液备用。

2、染病土准备

将麦粒沙培养的纹枯病菌与灭菌沙土按1∶30(w/w)的比例混匀，装入3cm×10cm(Φ×H)的灭菌塑料管中，每管30mL。

3、生防测试

表面消毒的豫麦17种子催芽后在上述细菌悬液中浸种1h，播种于含染病土的10个管中，每管3粒，浇灌细菌悬液，以无菌水浸种并浇灌的处理作为对照。无菌室20℃培养20d后根据下列分级标准统计根部发病情况。实验重复6次。

0级  健康，无病症

1级  在茎基部出现典型病症，病斑零星，未侵入茎杆。

2级  在茎基部病斑连片，症斑不超过茎周长的2/3，未侵入茎杆。

3级  茎基部病斑连片，占茎周长的2/3-1周。

4级  茎基部病斑环绕茎一周，叶鞘烂掉，病斑已侵入茎杆，但植株存活。

5级  叶鞘全烂掉，病斑侵入茎杆，植株枯死。

发病率＝(发病株数/总株数)×100％

4、生防测试结果

Bacillus cereus0-9处理后能明显降低小麦苗期纹枯病害病情指数和发病率(见表2，图1)，6次重复试验平均防效为82.86％。，同时从图1发现，每次试验对照组的病情指数并不十分稳定，这可能是由于温度、病菌状态、土质差异等因素影响了小麦纹枯病的发生，同样也可能影响生防菌的防治效果。

表2 Bacillus cereus0-9重复生防测试结果

注：表中数据为6次重复实验平均值，其后有相同字母的表示差异不显著(P＝0.05)。防治效果＝(对照组病情指数-处理组病情指数)/对照组病情指数×100％

结果表明：以Bacillus cereus O-9处理小麦种子，并以Bacillus cereus0-9菌悬液对小麦做一次灌根，可以大大降低小麦豫麦17纹枯病的发病比率和病情指数，起到较好的生防效果。

本发明变形蜡样芽孢杆菌O-9是从小麦根部分离得到的一株小麦内生细菌，该菌在本发明所用的小麦豫麦17中可以大量定殖，温室实验结果显示该菌株对小麦纹枯病有良好的防效，其生防效果优于已报道的其他菌株防效，具备了良好的应用和开发前景。

最后所应说明的是，以上实例仅用于说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (3)

1.蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）O-9，其保藏号为CCTCC NO:M209041。

2.如权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌O-9在预防小麦纹枯病方面的应用。

3.如权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌O-9在治疗小麦纹枯病方面的应用。

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