CN104531545A - 一株萎缩芽孢杆菌株dppg-28及其在作物病害防治方面的应用 - Google Patents

一株萎缩芽孢杆菌株dppg-28及其在作物病害防治方面的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种萎缩芽孢杆菌DPPG-28菌株及其在作物病害防治方面的应用，属于农业生物技术领域。该菌株从加工番茄主产区且有立枯病发生的滴灌田中土壤分离得到，菌株保藏号为CGMCC No.9394。该菌株可用于立枯丝核菌、瓜果腐霉菌、早疫菌、辣椒疫霉菌、番茄疮痂菌等作物病原菌的生物防治，对加工番茄立枯病、辣椒早疫病和棉花立枯病的防治效果分别可达74.17％、66.83％和70.12％，并可显著提高作物发芽率和苗期株高、鲜重和干重。本发明具有高效广谱杀菌性，在生防治剂方面有广阔的应用前景。

Description

一株萎缩芽孢杆菌株DPPG-28及其在作物病害防治方面的应用
技术领域
本发明涉及一株新筛选到的萎缩芽孢杆菌DPPG-28及其应用，属于农业生物技术领域。本发明的目的在于提供一株可用于番茄枯萎病害防治的萎缩芽孢杆菌DPPG-28，具有高效、广谱杀菌活性，可用于多种作物病害的防控。
背景技术
新疆是我国最大的棉花生产区和优质商品棉基地，在新疆经济生产中占有举足轻重的地位，近几年辣椒加工业也在新疆逐渐兴起，在新疆经济生产中占据重要地位。而近年来被称为“红色产业”的番茄加工业也逐渐成为新疆的支柱产业。新疆加工番茄种植面积达一百多万亩，加工番茄年生产总值占全国的90％，已逐渐形成产业化、规模化生产，年出口量占全国市场份额的70％，成为继棉花产业后的第二大经济作物。然而随着大规模的商业种植，各种作物病害也在种植地区大规模的发生，尤其是立枯丝核菌(Rhizictonia solani)、辣椒疫霉菌等引起的苗期病害，往往造成分布规模广、危害重、难防治的土传病害，而新疆当地为解决水资源紧缺而采取的滴灌技术虽然达到了节约用水的目的，但是可能会有利于作物土传病害的发生，严重影响了作物产量和农业的可持续发展。
长久以来，植物病害的防治主要以化学防治为主，但化学杀菌剂的长期使用往往会导致病原菌对杀菌剂产生抗药性，同时农药的残留污染环境、破坏生态平衡。而通过选育和推广抗性品种来提高植物抗病性，要考虑病原菌复杂的致病型，且周期较长，因此难以取得很大的突破。而生物防治因其无污染，对环境生态友好等优点成为近年来研究的热点，越来越多的人们逐渐地将目光转向从自然界中筛选和开发高效生防菌剂。
相关研究表明，利用微生物开发生防菌剂在防治植物病害、促进逆境下植物生长发育等方面有良好的应用效果。芽孢杆菌Bacillus M3，Bacillus OSU-142和Microbacterium FS01单独或组合后可促进澳洲青苹果的生长并显著提高产量，与对照相比较，根长增加16.4-29.6％，茎直径增加15.9-18.4％，果实重量增加13.9-25.5％，累积产量增加26.0-88.0％(Huseyin K,Ahmet E,Metin T,Fikrettin S.Effects of root inoculation of plant growth promoting rhizobacteria (PGPR)on yield,growth and nutrient element contents of leaves of apple[J].Scientia Horticulturae,2007,114:16-20)。接种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)可以增加番茄叶片数量，促进番茄生长发育(Markus W,Helmut J,Wilfried HS.Bacillus subtilis as growth promotor in  hydroponically grown tomatoes under saline conditions[J].Acta Hortic,2004,1(659):363-369)。日本东京技术研究所的Bacillus subtills RB14和Bacillus subtilis NB22分别对Rhizoctonia solani，Fusarium oxysporum和Pseudomonas solanacearum引起的番茄病害有良好的防效(Asaka O,Shoda M.Biocontrol of Rhizoctonia solani damping-off of tomato with Bacillus subtilis RB14.Appl Environ Microbiol，1996,62(11):4081-4085)。
但是生防微生物与土壤环境中的微生物群落之间往往存在相互作用，外源拮抗微生物的引入可以引起作物根际土壤微生物群落的组成发生变化，因此生防菌剂的使用有很大的地域适应性。目前国内外的一些商品化生防菌制剂由于上述原因在防治新疆农作物上的一些土传病害时，效果并不理想，这就迫切需要立足新疆特有的微生物资源，筛选出一些适合本土土壤和气候条件的生防菌用于作物病害的防治，这不论在技术发明上还是在实际应用方面都有重大意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种适宜于新疆特殊地理气候条件，特别是可以很好地控制以棉花、加工番茄和辣椒为主的经济作物的土著病害发生的生防菌株及其用途。该菌株属于萎缩芽孢杆菌，保藏名称萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)DPPG-28，保藏单位为：“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏日期2014年6月30日，保藏号CGMCC No.9394。保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明所述的生防菌经鉴定为萎缩芽孢杆菌，其特点在于：该菌株为革兰氏阳性，产芽孢，菌落形态为四周凸起中间凹陷的白色菌落，有褶皱，菌体为杆状，氧化酶接触酶阳性，产淀粉，能利用多种碳源，有反硝化作用，其特点在于能够用于立枯丝核菌、瓜果腐霉菌、早疫菌、辣椒疫霉菌、菌核菌、番茄疮痂菌等病原菌的生物防治，对番茄、辣椒和棉花病害有良好的防治效果，并能够促进其苗期生长发育。
具体内容如下：
在本发明中，以筛选新疆特殊生境和滴灌条件下番茄主要病原菌拮抗菌为目的，从滴灌田中采集加工番茄根际土壤164份，分离纯化得到细菌及放线菌分离物1029株。根据体外抑菌活性的测定，筛选出了一批对新疆加工番茄主要病害具有抑制作用的细菌，本发明所涉及的生防菌株经鉴定为萎缩芽孢杆菌。对该菌株进行抑菌活性测定，结果表明，该菌株及其发酵液对立枯丝核菌、瓜果腐霉菌、早疫菌、辣椒疫霉菌、菌核菌、番茄疮痂菌等病原菌均有一定的抑菌效果。
利用该萎缩芽孢杆菌进行不同作物的防病促生实验，结果表明，该菌株可显著防治番茄立枯病、棉花立枯病和辣椒早疫病并促进作物的苗期生长，可作为生防治剂用于作物病害防 治。
本发明的有益效果如下：
针对目前国内外的一些商品化生防菌制剂在防治新疆农作物上的一些土传病害时效果并不理想，本发明创新性地提供了一种适合新疆土壤和气候条件并能有效防治番茄、辣椒和棉花病害同时促进其生长的生防菌萎缩芽孢杆菌Bacillus atrophaeus DPPG-28。利用该菌株获得的生防菌剂对作物主要病原菌的防治效果稳定，适应性强，可显著提高作物发芽率和苗期株高、鲜重和干重，对加工番茄立枯病、辣椒早疫病和棉花立枯病的防治效果分别可达74.17％、66.83％和70.12％。该菌可作为生防菌剂使用，不仅可以减少化学农药的用量，减轻环境污染，还增加农民经济收入，同时具有良好的生态效益和社会效益。
附图说明
图1菌株DPPG-28对番茄立枯丝核病菌抑菌效果
图2菌株DPPG-28对加工番茄苗期生长的影响，左图为对照。
具体实施方式
下面通过具体实施例对发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
实施例1防病促生菌株的分离、纯化和筛选
(1)根围微生物的分离、纯化和保存
将从加工番茄产区采来的土样各称取10g，加入100ml灭菌水中，再加入适量玻璃珠剧烈振荡30min后，静置10min，取上清液1ml加入盛有99ml灭菌水的三角瓶中，进行梯度稀释至10-6浓度。将上述稀释液各200μl分别加入PDA、NA和高氏1号培养基平板上，用涂布器均匀涂布，冷却后倒置于28℃温箱内培养，重复两次。3-7d后从每个皿中挑取不同形态的单菌落于试管斜面上纯化待测。菌株保存用蒸馏水保存法。需要长期保存的菌株用甘油管(甘油含量为15％)置于﹣70℃超低温冰箱中低温冷冻保存。
营养琼胶培养基(NA)：牛肉膏3g/L，蛋白胨5g/L，NaCl 5g/L，葡萄糖10g/L，琼脂15g，pH 7.0-7.2，121℃湿热灭菌20min，用于生防菌的常规培养。
马铃薯糖琼脂培养基(PDA)：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂15g/L，pH 6.8，121℃湿热灭菌20min。
淀粉琼脂培养基(高氏培养基)：可溶性淀粉20g/L，硝酸钾1g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化钠0.5g/L，硫酸亚铁0.01g/L，琼脂20g/L，pH 7.0-7.5，121℃湿热灭菌20min。
(2)防病促生菌株的初筛
病原真菌和病原细菌拮抗菌的筛选，采用两种不同的方法：(1)病原真菌拮抗菌的筛选(平板对峙法)：在PDA平板中央接种目标病原真菌，待病原真菌菌丝扩展至1/5平板大小时，在病原菌周围距菌丝边缘2cm处等距离接种5-8株供试细菌，25-28℃下培养2-4d后检查结果，记录抑菌带宽。(2)病原细菌拮抗菌的筛选(影印法)：将20-30株供试菌等距离共同点接于一个NA平板中活化2-7d，将病原细菌制成一定浓度的菌悬液，分别取200μl加入NA平板上涂布均匀，待平板表面稍干，立即用印具将活化好的供试菌影印到涂有病原菌的平板上，重复两次，作好标记，25-28℃下培养，细菌2-4d后检查结果。经筛选获得一株DPPG28菌株对主要病原菌抑菌效果显著，抑菌实验结果如表1所示。测定结果表明：菌株DPPG-28对几种病原菌均有一定的抑菌效果。
表1 加工番茄病原菌拮抗菌的抑菌圈实验
注：表中数据为目标菌株分别对七种不同的病原菌所产生的抑菌带的宽度，单位为mm。
(3)防病促生菌的抑菌活性的测定
针对几种番茄病原真菌采用平板对峙法：PDA平板中央接种病原真菌，距病原菌2cm处等距离打孔4-6个，分别将培养48h后的供试菌株发酵液取30μL至孔洞中，28℃培养48h测量抑菌圈直径。
针对病原细菌采用涂布点接法：将摇瓶培养48h后的病原细菌取200μL在NA平板上均匀涂布后在平板上均匀等距打孔8-10个，再分别将供试菌株发酵液各30μL点接至孔洞中，28℃培养48h测量抑菌圈直径，每处理重复4次。抑菌平板实验结果见图1。抑菌活性测定结果如表2所示。
抑菌效价：每1μL待测物所产生1μm抑菌圈直径为一个抑菌效价单位(UI)。
表2 菌株对病原菌的抑菌活性(UI)
测定结果表明，菌株DPPG-28对六种病原菌都有不同程度的抑制作用，对立枯丝核菌、番茄早疫菌和辣椒疫霉菌的抑菌效果更为明显。
实施例2 DPPG-28菌株的鉴定特征
根据菌体形态特征、菌落形态特征及革兰氏染色结果，结合《伯杰细菌鉴定手册》(Bergey’s Manual of Etermitive Bacteriology)第八版和《常见细菌鉴定手册》对菌株DPPG-28进行生理生化特性的鉴定。结果如表3所示，经初步鉴定，菌株DPPG-28为芽孢杆菌(Bacillus)属。
表3 菌株DPPG-28的生理生化特性
注：十：反应呈阳性或者可以生长、利用；一：反应呈阴性或者不可以生长、利用。
菌株DPPG-28的16S rDNA鉴定
将菌株DPPG-28的16SrDNA进行测序，测序获得的DPPG-28的16S rDNA序列片段大小为1540bp，在NCBI网站进行序列同源性比对分析，结合生理生化特征的鉴定结果，菌株DPPG-28被鉴定为到萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)。
实施例3 Bacillus atrophaeusDPPG-28生防菌剂的制备
(1)种子液的制备 
将实施例1得到的菌株DPPG-28接种在NA培养基上进行活化后，转接于装有100mLNA培养基的250mL的三角瓶中，30℃，200rpm培养24小时得到种子液。
(2)菌剂的制备 
配制培养基，牛肉浸膏5.0g，蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 5.0g，葡萄糖10.0g，蒸馏水1000mL，121℃湿热灭菌20min。将种子液以1:100比例接种于发酵培养基中，30℃，200rpm培养48h。发酵液中活菌浓度为108-1011cfu/mL。
实施例4 Bacillus atrophaeusDPPG-28对番茄立枯病害的防病促生应用效果
(1)拮抗菌对番茄种子发芽和苗期生长的影响
发芽试验：用供试菌株的发酵液(浓度为1011cfu/mL)浸泡番茄种子12h，晾干后均匀置于铺有3层润湿灭菌滤纸的托盘内，25℃下培养，每处理重复3次。每24h记录一次发芽数，6天后分别测量各处理的芽长、根长及鲜重。以灭菌培养液浸种为对照。
苗期试验：待营养钵中的加工番茄长至4-5片真叶时，分别用浓度为108cfu/mL的菌株发酵液灌根两次，每处理灌根30mL，两次灌根间隔10天。于第2次灌根15天后测量番茄植株的株高、鲜重和干重。每处理重复3次，CK是以灭菌培养液灌根为对照。室内测定目标菌株对加工番茄发芽及苗期的促生效果如表4所示。结果表明，菌株DPPG-28能使加工的发芽率提高30.1％，并能显著提高发芽期的芽长。使苗期株高、鲜重和干重分别增加55.7％、85.7％和50％。
表4 菌株对番茄发芽和苗期的影响
注：同列的相同字母表示新复极差检验差异不显著。
(2)芽孢杆菌组合BCL-8对番茄苗期立枯病的防治效果
室内盆栽：将菌株的发酵液(1011cfu/mL)浸泡加工番茄种子12h后晾干备用。立枯丝核菌用麦麸培养基培养5-7天与灭菌土以1∶8的体积比充分拌匀后装入营养钵中。将处理过的 加工番茄种子均匀播入拌有立枯丝核菌的营养钵中，每钵15粒种子，每处理重复3次，并设3个对照(CK1：灭菌培养液浸种，病土；CK2：灭菌培养液浸种，土壤为灭菌土；CK3：用种子重量0.8％的化学农药PCNB拌种，病土)。定期浇水，出苗后15天调查出苗率和发病情况。
小区试验：在石河子大学实验站进行，前茬作物为加工番茄。种子处理方法同室内盆栽，每处理浸泡120粒种子，立枯丝核菌用麦粒培养基扩繁培养5-7天后与试验田土壤以1∶5的体积比拌匀后撒入试验田中，撒菌量约为1kg/m2，耙平后覆膜，在膜上点播浸种处理过的番茄种子，每穴点播10粒，随机播种。并设3个对照：CK1(灭菌培养液浸种，病土)；CK2(用种子重量0.8％的化学农药PCNB拌种，灭菌土)；CK3(用种子重量1％的化学农药卫福拌种，病土)。出苗后每隔3天调查1次出苗率，播种35天后调查发病情况，并测各处理的植株鲜重、干重和株高。
菌株对番茄立枯病的室内盆栽和小区防病效果见表5，从表中可以看出当番茄立枯丝核菌存在时，目标菌株DPPG28可以提高加工番茄的出苗率并对番茄立枯病有明显的防治效果。结果如表5所示。在温室和田间条件下，对加工番茄立枯病的防治效果分别达63.3％和74.17％。
表5 菌株对番茄苗期立枯病的防病效果
注：同列的相同字母表示新复极差检验差异不显著。
CK1(灭菌培养液浸种，病土)，CK2(灭菌培养液浸种，土壤为灭菌土)，CK3(用种子重量0.8％的化学农药PCNB拌种，病土)
实施例5 Bacillus atrophaeusDPPG-28对辣椒早疫病的防病促生应用效果
发芽试验、苗期实验和盆栽试验设计同实施例4，实验作物为辣椒种子，病原菌为早疫菌。
菌株DPPG-28对辣椒早疫病的防病促生效果见表6，从实验结果可看出，目标菌株DPPG-28对辣椒早疫病害有良好的防治作用，能明显提高辣椒出苗率并促进其苗期生长，对辣椒早疫病的防治效果66.83％。
表6 菌株对辣椒早疫病防病促生效果测定
注：同列的相同字母表示新复极差检验差异不显著。
CK1(灭菌培养液浸种，病土)，CK2(灭菌培养液浸种，土壤为灭菌土)，CK3(用种子重量0.8％的化学农药PCNB拌种，病土)
实施例5 Bacillus atrophaeusDPPG-28对棉花立枯病的防病促生应用效果
发芽试验、苗期实验和盆栽试验设计同实施例4，实验作物为棉花种子，病原菌为立枯丝核菌。
菌株DPPG-28对棉花立枯病的防病促生效果见表7，测定结果表明，目标菌株DPPG-28对棉花立枯病害同样有良好的防治作用，防治效果达可达70.12％，并能明显提高棉花出苗率和促进其苗期生长。
表7 菌株对棉花立枯病防病促生效果测定
注：同列的相同字母表示新复极差检验差异不显著。
CK1(灭菌培养液浸种，病土)，CK2(灭菌培养液浸种，土壤为灭菌土)，CK3(用种子重量0.8％的化学农药PCNB拌种，病土)
实施例的结果均表明，本发明的萎缩芽孢杆菌DPPG-28菌株对番茄、棉花和辣椒病害有较好的防治效果，明显降低了作物的发病率，并且对于作物的苗期生长发育有良好的促进作用。且由于其环境友好、无污染，有利于环境效益和经济效益的平衡发展，对在新疆地区乃至西北地区的作物病害防治方面有良好的应用前景。

Claims (4)

1.一种用于作物病害防治的萎缩芽孢杆菌DPPG-28，其特征在于该菌株为萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)，2014年6月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No.9394，命名为萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)DPPG-28。
2.如权利要求1所述的萎缩芽孢杆菌DPPG-28，其作物防病特征在于，可作为广谱生防菌应用，尤其是用于立枯丝核菌、瓜果腐霉菌、早疫菌、辣椒疫霉菌、菌核菌和番茄疮痂菌的生物防治，能有效防治棉花、番茄和辣椒苗期和生长期病害。
3.一种用来防治作物病害的生防菌剂，其特征在于活性成分为权利要求1所述的萎缩芽孢杆菌DPPG-28，所述菌剂活菌数在108--1013cfu/mL。
4.权利要求3所述的萎缩芽孢杆菌DPPG-28菌剂的应用，其特征在于该菌剂可用于作物病原菌的生物防治，所述作物包括以下几种：棉花、番茄和辣椒。所述病原菌包括以下一种或多种：立枯丝核菌、瓜果腐霉菌、早疫菌、辣椒疫霉菌、菌核菌和番茄疮痂菌，使用所述菌剂能有效促进作物种子的发芽和苗期生长。
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