CN105670963A - 一种复合微生物肥料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种复合微生物肥料及其制备方法。该复合微生物肥料以萎缩芽孢杆菌和木霉菌为主要活性成分，可以在田间用于在蔬菜灰霉病等真菌病害的防治。该复合微生物肥料中的萎缩芽孢杆菌对多种植物病原真菌具有抑制作用，同时木霉菌LTR-2具有植酸酶活性，可用于防治由植物病原真菌引起的多种植物病害，同时还具有提高植物对土壤中磷元素的利用、改善土壤结构、促进植物生长等作用，是一种多功能的微生物复合菌剂。

Description

一种复合微生物肥料及其制备方法
技术领域
本发明涉及微生物肥料技术领域，特别是涉及一种复合微生物肥料及其制备方法，该复合微生物肥料以木霉菌和萎缩芽孢杆菌为主要活性成分，可以在田间用于在蔬菜灰霉病等真菌病害的防治。
背景技术
微生物肥料是由一种或数种有益微生物活细胞制备而成的肥料。目前常见的微生物肥料有根瘤菌、固氮菌剂、解硅菌剂（钾细菌剂）、磷细菌剂、抗生菌剂、复合菌剂等。微生物肥料是以微生物的生命活动导致作物得到特定肥料效应的一种制品，是农业生产中使用肥料的一种。
保障国家粮食安全和重要农产品有效供给建设现代农业的首要任务。在人口压力大、环境资源紧张、农业基础薄弱，且农业有害生物多发重发频发的严峻形势下，化肥农药做出了重要的贡献。然而，过量和不能合理、适时、对症用肥用药，肥药利用率不高，带来了土壤板结、酸化、农药残留毒性、病虫抗（耐）药性上升、次要害虫大发生、环境污染和生态平衡破坏等一系列问题，严重威胁着农产品质量安全和农业生态环境安全。
微生物肥料提供的是能固氮、解磷、解钾等有益微生物，这些活的微生物能在植物根际生长、繁殖。首先，通过这些有益微生物的生命活动，固定转化空气中不能利用的分子态氮为化合态氮，分解土壤中不能利用的化合态磷、钾为可利用态的磷、钾，并可分解土壤中的10多种中、微量元素；其次，通过这些有益微生物的生命活动，分泌生长素、细胞分裂素、赤霉素、吲哚酸等植物激素，在促进作物生长，调控作物代谢，提高农作物品质等方面也起得到一定的作用；最后，一些微生物的代谢产物具有抗生作用等，可起到杀菌的作用，提高作物的防病、抗病能力，从而实现增产增收。自然界中有不少微生物（病毒、细菌、真菌和线虫）具有杀虫、杀菌、除草及植物生物调节活性。这种微生物具有很高的专一性，其对靶标病原物具有极高的选择性，而对其他生物却十分安全。将一些具有固氮、解磷、解钾等有益微生物与具有防病、抗病能力的微生物复合，配制成一定比例的复合微生物肥料产品，已成为当前一些肥料生产企业发展新型肥料的一个趋势。
发明内容
本发明的目的就是针对上述存在的缺陷而提供一种复合微生物肥料及其制备方法。该复合微生物肥料以萎缩芽孢杆菌和木霉菌为主要活性成分，可以在田间用于在蔬菜灰霉病等真菌病害的防治。该复合微生物肥料中的萎缩芽孢杆菌能够对多种植物病原真菌具有抑制作用，可用于防治由植物病原真菌引起的多种植物病害，同时还具有提高植物对土壤中磷元素的利用、改善土壤结构、促进植物生长等作用，是一种多功能的微生物复合菌剂。
本发明的一种复合微生物肥料及其制备方法技术方案为，该复合微生物肥料有效活性成分由萎缩芽孢杆菌和木霉菌组成。
所述萎缩芽孢杆菌为萎缩芽孢杆菌(Bacillusatrophaeus)BsR05，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，其保藏编号是CGMCCNo.11665，保藏日期是2015年11月16日。
所述木霉菌为绿色木霉(Trichodermaviride)LTR-2，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址：北京市海淀区中关村北一条13号，邮编：100101，其保藏编号是CGMCCNo.1498，保藏日期是2005年10月20日。
萎缩芽孢杆菌BsR05和木霉菌LTR-2孢子比例为4-6:1。
所述的一种复合微生物肥料的制备方法，包括以下步骤：
（1）萎缩芽孢杆菌菌液的制备
将萎缩芽孢杆菌(Bacillusatrophaeus)菌种经斜面培养、种子培养、发酵罐培养，得到萎缩芽孢杆菌孢子数≥8.0×109cfu/mL的菌液；
（2）木霉菌LTR-2孢子悬液的制备
包括固体一级种子制备、液体种子制备、接种固体培养基、制备孢子悬液，获得孢子浓度为2.0×109个/mL的孢子悬液；
（3）复合菌剂的制备：
将步骤（1）和（2）制得萎缩芽孢杆菌菌液和木霉菌孢子悬液混合，然后使用吸附剂吸附，形成固体菌剂。
步骤（1）具体为：采用固体LB培养基，将萎缩芽孢杆菌(Bacillusatrophaeus)试管菌种接种在试管培养基中，30℃恒温条件下培养24小时；然后，将斜面菌种的单菌落接种在液体LB培养基中置摇床上30℃恒温条件下培养18小时，获得萎缩芽孢杆菌种子液；最后是萎缩芽孢杆菌发酵罐培养，培养基按质量百分数为：2%玉米粉、6%豆粕粉、0.2%（NH4）2SO4、KH2PO4·2H2O0.2%、K2HPO4·2H2O0.4%、FeSO4·5H2O0.05%、CaCO30.3%，pH7.0-7.5,121℃灭菌20分钟，将萎缩芽孢杆菌种子液以2%的接种量接种于500升发酵罐内，30℃培养，每分钟通气量与发酵罐容积比为1.2-1.5:1，搅拌速度为250r/min，培养时间为28-36小时，在芽孢脱落70%（芽孢率（%）=成熟芽孢数/（成熟芽孢数+营养菌体数）×100）时终止发酵。
步骤（2）具体为：
固体一级种子制备：采用PDA培养基，将木霉菌LTR-2试管菌种接种在试管培养基中，28℃培养，4℃冰箱保存，要求菌丝与分生孢子丰满，无杂菌；然后接种茄型瓶，采用PDA培养基，28℃培养，菌龄3－4天，要求菌落表面无液态水，菌丝与分生孢子丰满，无杂菌污染；
液体种子制备：将1-2个茄瓶的种子用灭菌水洗下，接种于500立升的种子罐内，30℃培养，通气量1：0.6-0.8，搅拌速度为每分钟200转，约培养36h，镜检时菌丝应分枝多，顶端尖锐，无污染的杂菌，10×20显微镜视野全部为菌丝体所覆盖；液体种子的培养基为：1%葡萄糖，4%玉米粉，2%豆饼粉，0.05%硫酸镁，0.1%磷酸二氢钾，0.02%消泡剂，pH6.0；
接种固体培养基：固体培养基的组成为：麦粒：稻壳（W/W）＝49：5，含水量为70％（其中包括接种的液体发酵液的水分），FeSO4为100ppm，121℃灭菌40分钟后以循环水冷却，按要求量接种，在混合接种器内将发酵液和培养基混合均匀，转移到固体培养室内培养；培养条件为：培养基厚度为5cm，料温控制在30±2℃，室温控制在25－30℃，空气的相对含水量控制在95－100％，发酵培养96-120h；
制备孢子悬液：将发酵好的固体发酵培养基按1：1（W:W）浸润至水中，搅拌使固料中的分生孢子分散至水中，过滤去除固体发酵原料，获得孢子悬液；调整浓度至2.0×109个/mL。
步骤（3）具体为：将步骤（1）和（2）制得萎缩芽孢杆菌菌液和木霉菌孢子悬液按重量份数计5:5的比例混合，然后使用硅藻土、麦饭石或草炭土吸附，形成固体菌剂，调整菌数为2.0×108cfu/g，然后分装为袋装产品。
本发明的一种复合微生物肥料及其制备方法有益效果为：
该复合微生物肥料中木霉菌LTR-2具有植酸酶活性，可以将土壤中大量的有机磷（植酸类有机磷是土壤中的有机磷的重要存在形式）转化为无机磷后才被植物所吸收。所以，本发明的复合微生物肥料可以促进植物对土壤中有机磷的利用，从而在一定程度上减少磷肥使用量，提高了植物对土壤中磷元素的利用、从而具有改善土壤结构、促进植物生长等作用，是一种多功能的微生物复合肥料。
本发明的一种复合微生物肥料功能全互补性强，在促进植物生长同时，由于肥料产品中含有萎缩芽孢杆菌，它在抑制多种植物病原真菌生长方面具有非常显著的抑制效果，试验结果表明，在连作黄瓜灰霉病的土壤上施用本产品后，黄瓜灰霉病发病率低于10%。
本发明对于减少化学肥料和农药使用，降低农产品农药残留，改善农产品品质具有重要的意义，适合用于无公害绿色农产品的生产应用。
附图说明
图1所示为萎缩芽孢杆菌(Bacillusatrophaeus)BsR05及对照菌株对灰霉病（灰葡萄孢Botrytiscinerea）平板抑制结果；
图2所示为萎缩芽孢杆菌(Bacillusatrophaeus)BsR05及对照菌株对红腐病（串珠镰刀菌FusariummoniliformeSheld）平板抑制结果；
图3所示为萎缩芽孢杆菌(Bacillusatrophaeus)BsR05及对照菌株对马铃薯晚疫病菌（疫霉BotrytisinfestansMontagne）平板抑制结果；
图4所示为萎缩芽孢杆菌(Bacillusatrophaeus)BsR05及对照菌株对小麦叶枯病（链格孢Alternariaalternata）平板抑制结果；
图5所示为萎缩芽孢杆菌(Bacillusatrophaeus)BsR05及对照菌株对小麦根腐病（长蠕孢Helminthosporiumsativum）平板抑制结果；
图6所示为萎缩芽孢杆菌(Bacillusatrophaeus)BsR05及对照菌株对棉花炭疽病（棉刺盘孢菌ColletotrichumgossypiiSoutllw.）的平板抑制结果。
图中，1-枯草芽孢菌BsR05，2-对照菌株PB-2。
具体实施方式：
为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但是本发明并不局限于此。
实施例1：萎缩芽孢杆菌(Bacillusatrophaeus)BsR05的拮抗植物病原菌能力测定
以灰霉病（灰葡萄孢Botrytiscinerea）、红腐病（串珠镰刀菌FusariummoniliformeSheld）、棉花炭疽病（棉刺盘孢菌ColletotrichumgossypiiSoutllw.）、小麦叶枯病（链格孢Alternariaalternata）、小麦根腐病（长蠕孢Helminthosporiumsativum）、马铃薯晚疫病菌（疫霉BotrytisinfestansMontagne）共6种病原菌为指示菌，采用PDA平板对峙生长法将进入初筛的菌株点接在距平板中央3cm处的4个角点上，平板中央同时移入一直径0.3cm的病原菌的琼脂块，置于25℃培养箱培养3-5天，观察结果请见说明书附图图1-6，图中，菌落1为枯草芽孢菌BsR05，菌落2为对照菌株PB-2。
结果表明，萎缩芽孢杆菌BsR05对上述6种植物病原真菌均具有明显的抑制效果，说明萎缩芽孢杆菌BsR05对上述病原真菌引起的植物病害具有生防潜能。
实施例2：萎缩芽孢杆菌(Bacillusatrophaeus)BsR05菌液的制备
多粘类芽孢杆菌PB-2的液体发酵，按以下步骤进行：
（1）斜面菌种：采用固体LB培养基，将试管菌种接种在试管培养基中，30℃恒温条件下培养36小时。
（2）摇瓶菌种：采用液体培养基，将斜面菌种的单菌落接种在液体LB培养基中置摇床上30℃恒温条件下培养18小时。
（3）液体发酵：采用培养基，2%玉米粉、6%豆粕粉、0.2%（NH4）2SO4、KH2PO4.2H2O0.2%、K2HPO4.2H2O0.4%、FeSO4·5H2O0.05%、CaCO30.3%，,121℃灭菌20分钟，将（2）的种子接种于10升发酵罐内（接种量为1%），30℃培养，每分钟通气量与发酵罐容积比为1.2-1.5:1，搅拌速度为200r/min，培养时间为24-48小时，在芽孢脱落70%时终止发酵。发酵终止时菌液中萎缩芽孢杆菌芽孢数≥8.0×109cfu/mL。
实施例3：木霉菌LTR-2孢子悬液的制备
工艺流程的设计按照液固两相法，以期获得大量的木霉菌分生孢子。
工艺流程
斜面种子→茄瓶种子→液体种子→液体发酵→接种固体培养基→固体培养室培养→菌丝生长→分生孢子产生
工艺条件
斜面种子：PDA培养基，28℃培养，4℃冰箱保存，要求菌丝与分生孢子丰满，无杂菌。
茄瓶种子：PDA培养基，28℃培养，菌龄3－4天，要求菌落表面无液态水，菌丝与分生孢子丰满，无杂菌污染。
液体种子：将1-2个茄瓶的种子用灭菌水洗下，接种于500立升的种子罐内，30℃培养，通气量1：0.6-0.8，搅拌速度为每分钟200转，约培养36小时，镜检时菌丝应分枝多，顶端尖锐，无污染的杂菌，10×20显微镜视野全部为菌丝体所覆盖。液体种子的培养基为：1%葡萄糖，4%玉米粉，2%豆饼粉，0.05%硫酸镁，0.1%磷酸二氢钾，0.02%消泡剂，pH6.0。
接种固体培养基：固体培养基的组成为：麦粒：稻壳（W/W）＝49：5，含水量为70％（其中包括接种的液体发酵液的水分），FeSO4为100ppm，121℃灭菌40分钟后以循环水冷却，按要求量接种，在混合接种器内将发酵液和培养基混合均匀，转移到固体培养室内培养。
菌丝生长：培养基厚度为5cm，料温控制在30±2℃，室温控制在25－30℃，空气的相对含水量控制在95－100％，室内通气以1台100瓦的换气扇调节，培养物的面积为每60立方米设80平方米。
分生孢子的产生：基本条件与菌丝生长的相同，但应注意料温不能有大幅度变化，培养基表面不能有液态水，空气的相对湿度不能低于90％。
制备孢子悬液：将发酵好的固体发酵培养基按1：1（W:W）浸润至水中，搅拌使固料中的分生孢子分散至水中，过滤去除固体发酵原料，获得孢子悬液。调整浓度至2.0×109个/mL。
实施例4
将实施例2-3制备的萎缩芽孢杆菌菌液和木霉菌孢子悬液按重量份数计5:5的比例混合，然后使用硅藻土、麦饭石或草炭土吸附，形成固体菌剂，调整菌数为2.0×108cfu/g，然后分装为袋装产品。
实施例5
采用本发明实施例4制备的复合微生物菌剂，拌种或冲施使用，拌种按照每公斤种子100克使用，冲施按照10kg/亩作为冲施肥使用，根据黄瓜生长规律，通过拌种处理黄瓜种子，在作物生长、开花期和坐果期，共冲施3次，或在作物定植后，半个月冲施一次，共使用3～4次。使用后的效果如下：叶片加厚、保花率提高40%、挂果提前5～8天、产量提高10～15%，在黄瓜生长期内黄瓜灰霉病、白粉病的发病率低于10%。

Claims (8)

1.一种复合微生物肥料，其特征在于，有效活性成分由萎缩芽孢杆菌和木霉菌组成。
2.根据权利要求1所述的一种复合微生物肥料，其特征在于，所述萎缩芽孢杆菌为萎缩芽孢杆菌BsR05，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号是CGMCCNo.11665，保藏日期是2015年11月16日。
3.根据权利要求2所述的一种复合微生物肥料，其特征在于，所述木霉菌为木霉菌LTR-2，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号是CGMCCNo.1498，保藏日期是2005年10月20日。
4.根据权利要求3所述的一种复合微生物肥料，其特征在于，萎缩芽孢杆菌BsR05和木霉菌LTR-2孢子比例为4-6:1。
5.如权利要求4所述的一种复合微生物肥料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）萎缩芽孢杆菌菌液的制备
将萎缩芽孢杆菌Bacillusatrophaeus菌种经斜面培养、种子培养、发酵罐培养，得到萎缩芽孢杆菌孢子数≥8.0×109cfu/mL的菌液；
（2）木霉菌LTR-2孢子悬液的制备
包括固体一级种子制备、液体种子制备、接种固体培养基、制备孢子悬液，获得孢子浓度为2.0×109个/mL的孢子悬液；
（3）复合菌剂的制备：
将步骤（1）和（2）制得萎缩芽孢杆菌菌液和木霉菌孢子悬液混合，然后使用吸附剂吸附，形成固体菌剂。
6.根据权利要求5所述的一种复合微生物肥料的制备方法，其特征在于，步骤（1）具体为：采用固体LB培养基，将萎缩芽孢杆菌Bacillusatrophaeus试管菌种接种在试管培养基中，30℃恒温条件下培养24小时；然后，将斜面菌种的单菌落接种在液体LB培养基中置摇床上30℃恒温条件下培养18小时，获得萎缩芽孢杆菌种子液；最后是萎缩芽孢杆菌发酵罐培养，培养基按质量百分数为：2%玉米粉、6%豆粕粉、0.2%（NH4）2SO4、KH2PO4·2H2O0.2%、K2HPO4·2H2O0.4%、FeSO4·5H2O0.05%、CaCO30.3%，pH7.0-7.5,121℃灭菌20分钟，将萎缩芽孢杆菌种子液以2%的接种量接种于500升发酵罐内，30℃培养，每分钟通气量与发酵罐容积比为1.2-1.5:1，搅拌速度为250r/min，培养时间为28-36小时，在芽孢脱落70%时终止发酵。
7.根据权利要求5所述的一种复合微生物肥料的制备方法，其特征在于，步骤（2）具体为：
固体一级种子制备：采用PDA培养基，将木霉菌LTR-2试管菌种接种在试管培养基中，28℃培养，4℃冰箱保存，要求菌丝与分生孢子丰满，无杂菌；然后接种茄型瓶，采用PDA培养基，28℃培养，菌龄3－4天，要求菌落表面无液态水，菌丝与分生孢子丰满，无杂菌污染；
液体种子制备：将1-2个茄瓶的种子用灭菌水洗下，接种于500立升的种子罐内，30℃培养，通气量1：0.6-0.8，搅拌速度为每分钟200转，约培养36h，镜检时菌丝应分枝多，顶端尖锐，无污染的杂菌，10×20显微镜视野全部为菌丝体所覆盖；液体种子的培养基为：1%葡萄糖，4%玉米粉，2%豆饼粉，0.05%硫酸镁，0.1%磷酸二氢钾，0.02%消泡剂，pH6.0；
接种固体培养基与固体培养基的重量比组成为：麦粒：稻壳＝49：5，含水量为70％，其中包括接种的液体发酵液的水分，FeSO4为100ppm，121℃灭菌40分钟后以循环水冷却，按要求量接种，在混合接种器内将发酵液和培养基混合均匀，转移到固体培养室内培养；培养条件为：培养基厚度为5cm，料温控制在30±2℃，室温控制在25－30℃，空气的相对含水量控制在95－100％，发酵培养96-120h；
制备孢子悬液：将发酵好的固体发酵培养基按重量比1：1浸润至水中，搅拌使固料中的分生孢子分散至水中，过滤去除固体发酵原料，获得孢子悬液；调整浓度至2.0×109个/mL。
8.根据权利要求5所述的一种复合微生物肥料的制备方法，其特征在于，步骤（3）具体为：将步骤（1）和（2）制得萎缩芽孢杆菌菌液和木霉菌孢子悬液按重量份数计5:5的比例混合，然后使用硅藻土、麦饭石或草炭土吸附，形成固体菌剂，调整菌数为2.0×108cfu/g，然后分装为袋装产品。
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