CN105410031B - 一株深褐芽孢杆菌yl3及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种生防菌剂，其中有效活性成分由深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)YL3组成。其特征在于：该生防菌剂是水剂，其组成与重量百分含量为：深褐色芽孢杆菌YL3：89.5‑99.8％；十二烷基磺酸钠：0.1‑10％；山梨酸钾：0.1‑0.5％。应用时，将上述水剂叶面喷施用于防治草莓炭疽病和草莓白粉病，灌根用于防治多种作物枯萎病等。其优点是：通过引进对人畜安全、对草莓及多种植物病害具有较好防治作用的深褐芽孢杆菌YL3，达到利用生防菌剂防治植物病害；减少化学药剂用药量；同时改善生态环境、减少化学药剂在农产品中残留量的目的。

Description

一株深褐芽孢杆菌YL3及其应用

技术领域

本发明涉及一种生防菌剂及其应用，尤其是一株深褐芽孢杆菌YL3及其在防治植物病害中的应用。

背景技术

随着种植业结构的调整和外来有害生物的入侵，近年来农作物重大病害频繁暴发。目前，生产上防治植物病害主要依靠化学农药，这不仅造成生态环境严重污染，而且直接增加农产品中有毒化学物质的残留，对人类健康带来严重危害。为了达到有效防治植物病害、减少化学农药使用量的目的，使用生物防治技术控制植物病害的方法越来越受到各国政府和人民的关注。生物防治技术主要是利用生物多样性，通过在自然界释放或引进有益微生物，可持续控制植物病害。1950年以来国内外均开展了利用生防菌剂防治植物病害的研究，已取得显著成效。如：利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)防治水稻纹枯病、大豆锈病、大白菜软腐病等；利用荧光假单胞杆菌(Fluorescent pseudomonads)防治棉花、亚麻、苜蓿、黄瓜等作物的枯萎病；利用酵母菌(Candida saitoana)、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)和成团泛菌(Pantoea agglomerans)防治植物多种病害等。

江苏省农业科学院从内蒙古海拉尔草原采集的土样中，分离纯化后获得一株新颖的生防菌株YL3。前期研究结果表明：生防菌株YL3对草莓生产上多种重要病害(如炭疽病、白粉病等)有很好的防治效果。经中国科学院微生物研究所检测鉴定，根据细胞形态、生理生化特征、16S rRNA基因序列等实验数据综合分析，菌株YL3鉴定为深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)。同时，深褐芽孢杆菌YL3已于2015年9月14日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记入册，地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.11377。

已有文献报道的深褐芽孢杆菌主要对小麦赤霉病(辛海峰等，2013年，《ChineseJournal ofEcology》)、大丽轮枝菌(孙崇思等，2014年，《植物保护》)具有拮抗作用。已有深褐芽孢杆菌相关申请专利主要是对立枯丝核菌、早疫病菌、马铃薯褐腐病菌、辣椒疫霉病菌、瓜果腐霉病菌、杨树炭疽病和棉铃疫病等具有显著的室内抑菌效果(专利申请号：CN201410461213；CN201410397803；CN201310306988；KR20130021972；CN201210028087)。目前，深褐芽孢杆菌(Bacillusatrophaeus)对草莓炭疽病、白粉病和作物枯萎病害的生防应用国内外未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一株具有较好应用前景的生防菌株-深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)YL3，该菌株已于2015年9月14日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记入册，地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.11377。

本发明提供了一种生防菌剂，其中有效活性成分由深褐芽孢杆菌YL3组成。

本发明所述的生防菌剂，其中深褐芽孢杆菌YL3分泌的代谢产物中包括蛋白酶、嗜铁素和几丁质酶三种抗菌相关物质。

本发明所述的生防菌剂，它是水剂。

本发明所述的水剂，其特征在于：各组成及重量百分含量如下：深褐芽孢杆菌YL3：89.5-99.8％；十二烷基磺酸钠：0.1-10％；山梨酸钾：0.1-0.5％；pH 6.5-7.0。。

本发明所述的水剂喷施植物叶面用于防治草莓炭疽病和草莓白粉病，灌根用于防治作物枯萎病等多种植物真菌病害。

本发明的优点在于：开发出一株对人畜安全、具有较好应用前景的生防菌株-深褐芽孢杆菌YL3，丰富了生防资源；该生防菌剂可以用来防治多种植物病害，减少生产中化学药剂的使用量，同时改善生态环境、减少化学药剂在农产品中的残留量。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

图1是深褐芽孢杆菌YL3对细菌的抑制作用

图2是深褐芽孢杆菌YL3对病原真菌的抑制作用。

图3是深褐芽孢杆菌YL3产生蛋白酶。

图4是深褐芽孢杆菌YL3产生嗜铁素。

图5是深褐芽孢杆菌YL3产生几丁质酶。

图中A：深褐芽孢杆菌YL3；B：巨大芽孢杆菌；C：梨火疫病菌；D：水稻细菌性条斑病菌；E：番茄枯萎病菌；F：水稻纹枯病菌；G：油菜菌核病菌；H：草莓炭疽病菌；1：甘蓝黑斑病菌。

具体实施方式：

实施例1、

深褐芽孢杆菌YL3对细菌的抑制作用

A、供试病原细菌

供试细菌包括巨大芽孢杆菌、梨火疫病菌和水稻细菌性条斑病菌，由江苏省农业科学院植物保护研究所提供。用LB培养液(蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10g，蒸馏水1000mL)28℃、150rpm振荡培养2d，用无菌水稀释至10⁸cfu/mL，备用。

B、试验方法：

将江苏省农业科学院筛选获得的深褐芽孢杆菌YL3在LB培养基上进行活化，然后移入50mL LB培养液中，于28℃、150rpm振荡培养2d，用无菌水稀释至10⁸cfu/mL，备用。

吸取深褐芽孢杆菌YL3菌液5μL，点接在LB平板中央，28℃培养48h后用病原细菌稀释液喷雾，28℃培养过夜，调查抑菌圈直径。每处理重复3次，取平均值。设清水对照。

C、试验结果：

试验结果见图1。深褐芽孢杆菌YL3菌液对对供试的3种细菌均有一定的抑制作用，对巨大芽孢杆菌的抑菌圈直径为20.5mm；对梨火疫病菌的抑菌圈直径为36.5mm；对水稻细菌性条斑病菌的抑菌圈直径为60.5mm。

如图1所示。

实施例2

深褐芽孢杆菌YL3对5种植物病原真菌的抑制作用

A、供试病原真菌：

病原真菌包括番茄枯萎病菌、水稻纹枯病菌、油菜菌核病菌、草莓炭疽病菌和甘蓝黑斑病菌，均由江苏省农业科学院植物保护研究所提供。用PDA培养基(200g马铃薯、20g葡萄糖、20g琼脂和1000mL蒸馏水，pH 6.5-7.0)28℃培养5d，备用。

B、试验方法：

深褐芽孢杆菌YL3菌液制备同实施例1。

将病原真菌菌饼(直径为6mm)置于空白PDA平板一侧，距平板边缘30mm。平板另一侧，距平板边缘30mm，点接深褐芽孢杆菌YL3菌液5μL。28℃恒温培养，设清水对照，待对照平板病原菌菌落长满时调查各处理病原菌生长直径，计算抑制率。每处理重复3次，取平均值。

病原真菌抑制率＝[(对照病原菌生长直径-处理病原菌生长直径)/对照病原菌生长直径]×100％。

C、试验结果：

试验结果见表1和图2。结果表明：深褐芽孢杆菌YL3菌液对供试的5种病原真菌均有抑制作用。其中对番茄枯萎病菌、油菜菌核病菌、草莓炭疽病菌和甘蓝黑斑病菌菌丝生长的抑制率在40％左右，对水稻纹枯病菌的抑制率只有26.78％。

表1 深褐芽孢杆菌YL3对供试病原真菌的抑制作用

如图2所示。

实施例3

深褐芽孢杆菌YL3代谢分泌物-抗菌相关物质的产生

供试材料：蛋白酶检测培养基：脱脂奶粉100g，琼脂20g，定容至1000mL。嗜铁素检测培养基：CAS 60.5mg，10mL三价铁溶液(1mmol·L^-1FeCl₃·6H₂O)，HDTMA 72.9mg，琼脂20g，定容至1000mL，pH 7.0。几丁质酶检测培养基：几丁质15g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，FeS0₄·7H₂O 0.01g，K₂HPO₄ 0.7g，KH₂P0₄ 0.3g，琼脂20g，定容至1000mL，pH 7.0-7.2。纤维素酶检测培养基：蛋白胨10g，酵母粉10g，羧甲基纤维素钠10g，NaCl 5g，KH₂PO₄ 1g，琼脂20g，定容至1000mL，pH 7.0。

深褐芽孢杆菌YL3菌液制备同实施例1。在各检测培养基平板中央点接深褐芽孢杆菌YL3菌液5μL，每处理重复3次。28℃恒温培养3-7d，观察。

蛋白酶检测：观察有无透明圈产生。若产生透明圈，说明该拮抗菌可分泌蛋白酶。

嗜铁素检测：28℃恒温培养7-10d后观察有无黄色晕圈产生。若产生黄色晕圈，说明该拮抗菌可分泌嗜铁素。

几丁质酶检测：观察有无透明圈产生。若产生透明圈，说明该拮抗菌可分泌几丁质酶，降解几丁质。

纤维素酶检测：观察菌落周围有无透明圈产生。若产生透明圈，说明该拮抗菌可分泌纤维素酶。

试验结果表明：深褐芽孢杆菌YL3不能分泌纤维素酶；能分泌蛋白酶，利用检测平板中的蛋白质，在菌落周围形成透明圈(图3)；能分泌嗜铁素，与检测平板中的Fe³⁺结合，在菌落周围形成桔黄色晕圈(图4)；能分泌几丁质酶，利用检测平板中的几丁质，在菌落周围形成透明圈(图5)。

如图3、图4和图5所示。

实施例4

深褐芽孢杆菌YL3水剂的获得

A、菌种准备及活化。

LB培养基(同实施例1)按常规方法加琼脂后灭菌，做成斜面。接种深褐芽孢杆菌YL3，28℃培养2d。

B、液体发酵。

一级发酵：将上述培养好的试管斜面，用接种环移一环菌苔入300mL LB培养液(同实施例1)。在28℃、150rpm振荡培养2d，备用。

二级发酵：培养基配方：豆饼粉1％，大豆粉0.5％，酵母膏0.15％，玉米粉1％，玉米浆0.5％，蔗糖0.5％，NaCl 0.05％，CaCO₃ 0.18％。灭菌前pH 7.0。2吨发酵罐中投料1吨。121℃灭菌30分钟。冷却至30℃左右时接种上述一级发酵菌种液300mL。液体发酵温度32℃，搅拌转速300rpm。通气量1∶1.5。发酵周期为18小时。

三级发酵：培养基配方同二级发酵。15吨发酵罐中投料10吨。121℃灭菌30分钟。冷却至30℃左右时接种上述二级发酵菌种液1吨。液体发酵温度32℃，搅拌转速300rpm。通气量1∶1.5。发酵周期为24小时左右，放罐。

C、水剂配置。

发酵液放入储罐中，加入十二烷基磺酸钠0.1-10％、山梨酸钾0.1-0.5％，搅拌均匀。测得发酵液pH值为6.5-7.0，活菌数为10⁹-2×10⁹cfu/mL。灌装成深褐芽孢杆菌YL3水剂。

实施例5

深褐芽孢杆菌YL3水剂对草莓炭疽病防效的小区试验

试验地点：江苏省农业科学院草莓种植圃内进行。

试验品种：红颊，由江苏省农业科学院园艺研究所提供。

试验药剂和对照药剂：深褐芽孢杆菌YL3水剂由实施例4提供。对照药剂为生产上防治草莓炭疽病的常用化学药剂25％咪鲜胺，由江苏辉丰农化股份有限公司提供，按其田间推荐剂量使用。

试验方法：草莓老母株于2014年4月1日移栽。试验设5个处理：：深褐芽孢杆菌YL3水剂10倍稀释液、YL3水剂100倍稀释液、25％咪鲜胺750倍稀释液、25％咪鲜胺1500倍稀释液和清水对照。3次重 复，共15个小区，每个小区面积为20m²，随机排列。本试验于2014年6月10日施第一次药，均匀喷施草莓植株、叶片正反面及匍匐茎。间隔7d再喷施1次，共防治4次。药后10d和20d每小区随机取样调查50根匍匐茎，调查发病情况，计算发病指数和防效。草莓炭疽病病情分级标准如下：

0级：无病斑；

1级：病斑面积环绕整个匍匐茎的5％以下；

3级：病斑面积环绕整个匍匐茎的6％-10％；

5级：病斑面积环绕整个匍匐茎的11％-25％；

7级：病斑面积环绕整个匍匐茎的26％-50％；

9级：病斑面积环绕整个匍匐茎的50％以上或子苗死亡。

病情指数＝[(各级发病数×各级代表值)/(调查总株数×最高级代表值)]×100

防治效果(％)＝[(对照的病情指数一防治的病情指数)/对照的病情指数]×100％

试验结果见表2。用药10d后深褐芽孢杆菌YL3水剂10倍稀释液的防效最高，为83.10％，常规化学药剂25％咪鲜胺750倍稀释液的防效次之，为73.24％。深褐芽孢杆菌YL3水剂100倍稀释液的防效高于25％咪鲜胺1500倍稀释液。药后20d，清水对照的病情指数增加显著，深褐芽孢杆菌YL3水剂10倍稀释液和25％咪鲜胺750倍稀释液的防效相当。结果表明：深褐芽孢杆菌YL3可以替代化学药剂咪鲜胺防治草莓炭疽病，效果显著。

表2 深褐芽孢杆菌YL3水剂对草莓炭疽病的田间防治效果

实施例6

深褐芽孢杆菌YL3水剂对草莓白粉病防效的小区试验

试验地点：江苏省徐州市贾汪区耿集镇进行。

试验品种：红颊，由江苏省农业科学院园艺研究所提供。

试验药剂和对照药剂：深褐芽孢杆菌YL3水剂由实施例4提供。对照药剂为生产上防治草莓白粉病的常用化学药剂10％苯醚甲环唑水分散粒剂，由浙江世佳科技有限公司提供，按其田间推荐剂量使用。

试验方法：试验大棚历年白粉病发生严重，试验共设5个处理：深褐芽孢杆菌YL3水剂10倍稀释液、YL3水剂100倍稀释液、10％苯醚甲环唑600倍稀释液、10％苯醚甲环唑1200倍稀释液和清水对照。试验3次重复，共15个小区，每个小区面积为20m²，随机排列。本试验于2014年11月20日施第一次药，均匀喷施草莓叶片正反面及幼果果面。间隔7d再喷施1次，共防治4次。药后7d和15d每小区随机取5株，调查每株所有叶片发病情况，计算发病指数和防效。草莓白粉病病情分级标准如下：

0级：叶片上无病斑；

1级：病斑面积占整个叶面积的5％以下；

3级：病斑面积占整个叶面积的6％-15％；

5级：病斑面积占整个叶面积的16％-25％；

7级：病斑面积占整个叶面积的26％-50％；

9级：病斑面积占整个叶面积的50％以上。

病情指数＝[(各级发病数×各级代表值)/(调查总株数×最高级代表值)]×100

防治效果(％)＝[(对照的病情指数-防治的病情指数)/对照的病情指数]×100％

试验结果见表3。药剂处理前各小区的病情指数基本一致，为14.20-14.32。用药4次后7d，对照小区病情指数为36.20，深褐芽孢杆菌YL3水剂10倍稀释液的防效最高，为77.21％，与常规化学药剂10％苯醚甲环唑600倍稀释液的防效相当。深褐芽孢杆菌YL3水剂100倍稀释液的防效次之，为65.91％，10％苯醚甲环唑1200倍稀释液的防效较低，仅为26.57％。药后14d，清水对照小区的病情指数继续增加至45.11，深褐芽孢杆菌YL3水剂10倍稀释液和10％苯醚甲环唑600倍稀释液防效均大于75％。结果表明：深褐芽孢杆菌YL3可以替代化学药剂苯醚甲环唑有效防治草莓白粉病。

表3 深褐芽孢杆菌YL3水剂对草莓白粉病的田间防治效果

实施例7

深褐芽孢杆菌YL3水剂对番茄枯萎病的盆栽防效测定

试验地点：江苏省农业科学院植物保护研究所温室内进行。

试验品种：江蔬一号，由江苏省农业科学院蔬菜所提供。

试验药剂和对照药剂：深褐芽孢杆菌YL3水剂由实施例4提供。对照药剂为50％多菌灵，购自江苏辉丰农化股份有限公司，是生产上防治番茄枯萎病的常用化学药剂，按商品田间推荐剂量使用。

番茄枯萎病菌孢子液的制备如下：将番茄枯萎病菌接种于PDA培养基平板，28℃培养5d，用无菌水洗下平板中的孢子，过滤菌丝，摇匀。显微镜下用血球计数板计数，用无菌水调至孢子浓度为10⁶个/mL。

试验方法：将江蔬1号番茄种播于灭菌土壤中，当番茄苗长出5片真叶时，移至装有100g无菌土的盆钵中，每钵1株番茄苗，每株番茄苗灌根20mL枯萎病菌孢子液(浓度为10⁶孢子/mL)，24h后灌根20mL深褐芽孢杆菌YL3水剂原液和100倍稀释液。每处理20盆，常规管理。对照药剂为50％多菌灵，设清水对照。番茄苗移栽后生长30d后调查病情，计算防效。

番茄枯萎病病情分级标准如下：

0级为茎内维管束正常，外部无症状；

1级为茎内维管束1/4以下变色；

3级为茎内维管束1/4～1/2变色；

5级为茎内维管束1/2～3/4变色；

7级为茎内维管束3/4以上变色，部分叶片萎蔫；

9级为整株枯死。

病情指数＝[∑(各级发病数×各级代表值)/(调查总株数×最高级代表值)]×100

防治效果(％)＝[(对照的病情指数-处理的病情指数)/对照的病情指数]×100％

试验结果见表4。人工接种番茄枯萎病菌孢子液后，番茄枯萎病的盆栽病情指数为52.64，深褐芽孢杆菌YL3水剂原液和100倍稀释液对番茄枯萎病盆栽防效分别为70.44％和61.11％，而化学药剂50％多菌灵800倍稀释液的防效为51.31％。试验结果表明：深褐芽孢杆菌YL3水剂对番茄枯萎病的防效明显高于常规化学药剂多菌灵。

表4 深褐芽孢杆菌YL3水剂对番茄枯萎病盆栽防效测定

实施例8

深褐芽孢杆菌YL3水剂对草莓枯萎病防效的小区试验

试验地点：江苏省农业科学院溧水植物基地进行。

试验品种：“红颊”和“宁玉”两个品种，由江苏省农业科学院园艺研究所提供。

试验药剂和对照药剂：深褐芽孢杆菌YL3水剂由实施例4提供。对照药剂为50％多菌灵，购自江苏辉丰农化股份有限公司，是生产上防治草莓枯萎病的常用化学药剂，按商品田间推荐剂量使用。

试验方法：共设5个处理：深褐芽孢杆菌YL3水剂10倍稀释液、YL3水剂100倍稀释液、50％多菌灵800倍稀释液、50％多菌灵1600倍稀释液和清水对照。试验设两个品种，3次重复，共30个小区，每个小区面积为20m²，随机排列。本试验于2015年8月30日灌根第一次药，每棵苗300mL。间隔15d再灌根1次，共防治2次。9月底调查小区内草莓植株枯萎病发病情况，计算防效。

防治效果(％)＝[(对照小区发病株数-处理小区发病株数)/对照小区发病株数]×100％

试验结果见表5。对照小区“宁玉”品种的病情指数为10.50，而“红颊”品种的病情指数达17.60，因此“宁玉”品种比“红颊”品种更抗枯萎病。“宁玉”品种和“红颊”品种经过深褐芽孢杆菌YL3水剂10倍稀释液处理后，防效与对照药剂多菌灵效果相当。深褐芽孢杆菌YL3水剂100倍稀释液对“宁玉”品种和“红颊”品种的枯萎病防效分别为67.62％和59.26％，而化学药剂50％多菌灵1600倍稀释液的防效较差，分别为29.52％和34.89％。试验结果表明：深褐芽孢杆菌YL3水剂可以有效防治草莓枯萎病。

表5 深褐芽孢杆菌YL3水剂对草莓枯萎病田间防效测定

Claims (3)

1.一种生防菌剂，其特征在于：所述生防菌剂中有效活性成分由深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)CGMCC No.11377组成；所述深褐芽孢杆菌分泌的代谢产物中包括蛋白酶、嗜铁素和几丁质酶三种抗菌相关物质；所述生防菌剂为水剂。

2.根据权利要求1所述的生防菌剂，其特征在于：各组成及重量百分含量如下：深褐芽孢杆菌发酵液：89.5-99.8％；十二烷基磺酸钠：0.1-10％；山梨酸钾：0.1-0.5％。

3.根据权利要求1所述的生防菌剂的应用，其特征在于：叶面均匀喷施用于防治草莓炭疽病和草莓白粉病，灌根用于防治番茄枯萎病和草莓枯萎病。