CN103333844A - 一株拮抗杨树炭疽病菌的菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株防治杨树炭疽病的拮抗菌菌株及其应用。本发明拮抗菌为萎缩芽孢杆菌Bacillus atrophaeus XW2，微生物保藏号为CGMCC NO.7698。本发明的萎缩芽孢杆菌Bacillus atrophaeus XW2是杨树内生菌经平板对峙培养筛选获得，对杨树炭疽病菌的拮抗作用明显，可以有效的抑制杨树炭疽病菌菌丝的生长及孢子的萌发，可以防治杨树炭疽病菌引起的植物病害，是一种防效高，环境安全性好的生物防治潜力菌株，具有良好的开发应用前景。

Description

一株拮抗杨树炭疽病菌的菌株及其应用

技术领域

本发明涉及一株细菌菌株，特别涉及一株拮抗植物病原真菌的拮抗细菌及其应用，属于微生物领域，可用于植物保护，防治植物病害。

背景技术

杨树品种繁多，抗逆性、适应性强，是我国造林绿化、生态环境建设和社会经济发展的重要树种，也是我国栽培面积最大的用材树种，在世界各地亦有广泛分布。

近年来，中国杨树病害频发，年均发生面积超过660万亩，造成了巨大的经济和生态损失。其中杨树炭疽病是一种重要的叶部病害，其病原为胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）。杨树炭疽病主要危害杨树的叶片和枝条，引起早期落叶和枯梢，导致树势降低而诱发其它次期性生物灾害或枯死。杨树炭疽病菌侵害叶片后在叶面出现半圆形、圆形或不规则的灰褐色病斑，子实体呈轮纹状排列；叶柄受害后常导致叶片变黑枯死而悬挂于树上，直到翌年新叶萌出才陆续脱落。受害枝条基部或近基部出现黑色凹陷坏死斑，形成枯梢。后期在病部产生黑色小点状的分生孢子盘，湿度大时从中产生桔红色的分生孢子堆。

杨树炭疽病在中国南北各杨树栽培区均有不同程度的发生危害，严重威胁杨树林的健康和生产安全。陕西省毛白杨（Populus tomentosa）当年扦插苗发病株率可达78%，4～5年幼树发病株率可达100%，叶片受害率达100%。京津冀地区作为防护林、行道树广泛栽植的北京杨（Populus×beijingens）的炭疽病发病尤为严重，2005年延庆、昌平防护林的病株率高达100%。目前，杨树炭疽病的防治仍以化学防治为主，长期使用化学农药不仅使植物病原菌产生抗药性，同时造成农药的残留，杀伤天敌，污染环境，威胁人类健康，破坏生态平衡。利用拮抗微生物的防治植物病害，在环境友好的前提下减少病害的发生与危害，有效避免了化学防治的弊端，已成为植物保护领域最具有前景的防治技术之一，颇受世界各国的广泛重视，其防治效果和应用范围在不断扩大，显示出其在植物病害防治中的突出地位。

从杨树体内分离筛选获得的对杨树炭疽病菌有拮抗作用的生防菌株，对于杨树炭疽病的防治具有非常重要的意义。目前，应用拮抗微生物防治植物病害已经有很多的报道，但能够有效防治杨树炭疽病的拮抗菌在国内外尚未见报道。

发明内容

本发明的目的之一是针对现有杨树炭疽病防治存在的技术问题提供一株能高效生物防治杨树炭疽病菌的拮抗菌Bacillus atrophaeus XW2的菌株，本发明的拮抗菌Bacillus atrophaeus XW2的菌株是从杨树叶部中分离筛选获得的对杨树炭疽病具有高效拮抗作用的生防细菌菌株，应用本发明的拮抗菌Bacillus atrophaeus XW2的菌株解决了目前杨树炭疽病化学农药防治难，环境污染严重而生物防治现有技术空白的问题。

本发明的目的之二是提供上述拮抗菌Bacillus atrophaeus XW2的菌株在用于防治杨树炭疽病方面的用途，尤其是拮抗菌Bacillus atrophaeus XW2的菌株在防治杨树炭疽病等方面的多种应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明的一株高效防治杨树炭疽病的拮抗菌为萎缩芽孢杆菌Bacillus atrophaeusXW2，其微生物保藏号是：CGMCC NO.7698；分类命名是：Bacillus atrophaeus；保藏时间：2013年6月18日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路，中国科学院微生物研究所；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC）。

本发明所述拮抗杨树炭疽病菌的细菌菌株的形态特征：

萎缩芽孢杆菌Bacillus atrophaeus XW2为革兰氏阳性杆菌，菌体大小约0.5-0.8um×1.5-2.5um，无荚膜，有芽孢，周生鞭毛，能运动。菌体在LB培养基平板上呈乳白色，不透明，菌落光滑，中央隆起，边缘完整。

其中，每1000ml所述LB培养基含有胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，琼脂粉15g，pH7.0-7.2。

本发明拮抗杨树炭疽病菌的细菌菌株Bacillus atrophaeus XW2的分离筛选方法：

1）取新鲜采集的健康杨树树叶1.5g，置于装有10mL无菌水的灭菌研钵中，加入少许灭菌的石英砂研磨均匀，静置15min。取1mL悬浮液用10倍梯度稀释法依次稀释得到10^-3、10^-4、10^-5浓度梯度的稀释液，从各个浓度梯度悬浮液中取0.1mL，用无菌涂布棒涂于LB培养基平板上，以无菌水为对照，涂抹均匀后放到恒温箱中28℃恒温倒置培养；

2）连续观察8天后，挑取菌落形态不同的菌株，再次在平板上进行划线纯化培养，获得杨树内生菌菌株；

3）在马铃薯琼脂培养基（PDA）平板中央接入新鲜的杨树炭疽病菌（提供自中国林业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CFCC80308）菌饼，其中炭疽病菌菌饼的直径为6mm，接着用接种环分别挑取少许分离纯化后的杨树内生菌菌苔，在距杨树炭疽菌菌饼两侧2cm处轻轻划线，放置于培养箱中，28℃恒温倒置对峙培养，每个对峙实验平行重复3次。

4）7天后观察并记录抑菌带的有无以及大小，选出对杨树炭疽病菌具有最强抑制效果，抑菌带最宽的内生菌株。

本发明菌株Bacillus atrophaeus XW2的筛选及防治杨树炭疽病菌特性测定采用的培养基如下：

筛选培养基成分：每1000mL LB培养基含有胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，琼脂粉15g，pH7.0-7.2。

发酵培养基成分：每1000mL NB培养基含有蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl5g，pH7.0-7.2。

碳源测定时用碳源基础培养基成分：每1000mL含有（NH₄）₂SO₄2.0g，NaH₂PO₄·H₂O0.5g，K₂HPO₄0.5g，MgSO₄·7H₂O0.2g，CaCl₂·2H₂O0.1g，pH7.0-7.2，分别加入0.5%～1%的葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、麦芽糖、D-木糖、阿拉伯糖、淀粉、乙醇、丙三醇、甘露醇、山梨醇或0.1%～0.2%的乳酸、乙酸、乳酸、柠檬酸、丙氨酸作为碳源。

氮源测定时用氮源基础培养基成分：每1000mL含有Na₂HPO₄2.16g，KH₂PO₄1.36g，MgSO₄·7H₂O0.2g，FeSO₄0.5g，CaCl₂5.00g，葡萄糖10g，pH7.0-7.2，分别加入0.05%～0.1%的蛋白胨、酵母膏、谷氨酸、天冬氨酸、干酪素、硝酸铵、硫酸铵、硝酸钙、硝酸钾、氯化铵、磷酸氢二铵、亚硝酸钠、尿素作为氮源。

本发明的萎缩芽孢杆菌Bacillus atrophaeus XW2的培养特性：

本发明的萎缩芽孢杆菌Bacillus atrophaeus XW2最佳生长碳源为乳酸；最佳生长氮源为蛋白胨；最适培养基为LB培养基；培养温度为10℃～45℃，最适温度为28℃；培养pH为4～10，最适pH为7；能在0.5%～10%的NaCl浓度的NB培养基中生长。能氧化L-阿拉伯糖、甘露醇，产酸；能氧化葡萄糖，但不产气，而且卵黄水解呈阳性；但不能氧化D-木糖产酸，能在含有酪氨酸的NB培养基（每1000mL含有牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，酪氨酸1g，琼脂20g，pH7.0-7.2）上产生黑色色素。

根据《常见细菌鉴定手册》，对照菌株XW2的形态特征及生理生化特性鉴定菌株XW2为Bacillus属菌株，并确认本发明菌株为萎缩芽孢杆菌Bacillus atrophaeusXW2。

本发明的拮抗菌株还包括以上述菌株的能高效防治杨树炭疽病的菌株萎缩芽孢杆菌Bacillus atrophaeus XW2，微生物保藏号为CGMCC NO.7698的突变体、变异体或其各种代谢产物、衍生物。

以上述萎缩芽孢杆菌Bacillus atrophaeus XW2，微生物保藏号为CGMCCNO.7698为活性成分的生物制剂也属于本发明的保护范围。在需要的时候，该菌剂中还可包含菌剂制备中常用的载体和辅料。

本发明细菌菌种通过下述培养基培养得到的培养物、发酵培养液或发酵培养液的过滤液用于拮抗杨树炭疽病菌的处理，所述液体培养基为NB培养基。

固体培养基按1.5%添加琼脂。高压灭菌后备用。

液体培养时将本发明的菌株按5%的接种量接入装有100ml发酵培养基的250ml三角瓶中，在往复式摇床（180rpm）上28℃下，进行恒温发酵培养，培养3天后发酵液，发酵过滤液、发酵混合物即可用于拮抗杨树炭疽病菌。

本发明的拮抗杨树炭疽病菌的萎缩芽孢杆菌Bacillus atrophaeus XW2在防治杨树炭疽病方面的应用，所述应用包括抑制杨树炭疽病病菌；致畸杨树炭疽病病菌的菌丝；抑制杨树炭疽病病菌的分生孢子的萌发、致畸杨树炭疽病菌萌发孢子。

抑制杨树炭疽病病菌是指抑制杨树炭疽病菌的生长，降低杨树炭疽病菌菌丝生长速率，本发明拮抗菌XW2显著降低杨树炭疽病菌的生长速率，菌落生长速率，拮抗菌XW2发酵菌悬液对杨树炭疽病菌的菌落生长速率的抑制率在一周内都保持较高的水平，培养7天能保持86.71%的抑菌效果，甚至培养10天后依然能保持较高的抑菌效果；拮抗菌对杨树炭疽病菌菌丝生长量的抑制明显，显著降低菌丝的生长量，菌丝生长量的抑制效率高大88.74%。

致畸杨树炭疽病病菌的菌丝是拮抗菌XW2处理的杨树炭疽病菌前期菌丝原生质浓缩，菌丝膨大，形态不均匀，后期菌丝膨大加剧呈断裂、破碎状。

抑制杨树炭疽病病菌的分生孢子的萌发，拮抗菌Bacillus atrophaeus XW2菌株发酵上清液处理组中杨树炭疽病菌孢子被完全抑制，没有萌发，对杨树炭疽病孢子的抑制率为100%；发酵培养液的过滤液对杨树炭疽病菌孢子的抑制率为86.0%；拮抗菌株XW2的发酵培养液的上清液、稀释液萌发的孢子芽管生长缓慢，芽管短、变畸形且粗细不均匀，芽管前端明显膨大呈泡囊状，后期芽管断裂呈碎裂状，萌发孢子芽管畸形率均达到100%。本发明的Bacillus atrophaeus XW2菌株的发酵培养液的上清液、过滤液中含有对杨树炭疽病菌有高效抑制作用的活性成分，表明XW2菌株在发酵培养过程中产生了对杨树炭疽病菌有抑制作用、致畸作用的代谢产物。

本发明的拮抗菌株Bacillus atrophaeus XW2对温度、pH等自然环境条件的适应范围广，在10-45℃、pH4-10的范围内都具有拮抗杨树炭疽病菌的能力。本发明的菌株来源于健康杨树植株组织（叶片），容易培养和保持，利用乳酸、葡萄糖、蔗糖、果糖和柠檬酸做碳源生长良好，还可以在0.5%～10%的NaCl浓度下生长，能拮抗杨树炭疽病菌。

本发明的拮抗杨树炭疽病菌的萎缩芽孢杆菌Bacillus atrophaeus XW2在防治杨树炭疽病方面的作用极为显著，对杨树炭疽病菌有很强的抑制作用，能明显抑制杨树炭疽病菌菌丝的生长，并使菌丝畸形断裂，也能明显抑制杨树炭疽病菌孢子的萌发及导致萌发的孢子芽管畸形断裂，具有很好的防治杨树炭疽病菌引起的植物病害的潜力。它作为杨树植株内生菌为防治由杨树炭疽病菌引起的植物病害提供了一条环保、简单、有效的途径，利于环境保护。

附图说明

图1为萎缩芽孢杆菌Bacillus atrophaeus XW2（微生物保藏号CGMCC NO.7698）的菌落形态图，其中A为Bacillus atrophaeus XW2菌株在LB培养基上的培养形态；B为Bacillus atrophaeus XW2菌株革兰氏染色后的阳性观察结果（10×40）。

图2为萎缩芽孢杆菌Bacillus atrophaeus XW2（微生物保藏号CGMCC NO.7698）菌株对杨树炭疽病菌抑制作用检测的对峙培养试验结果，其中A为没有接种Bacillusatrophaeus XW2，仅接种杨树炭疽病菌的生长情况；B为划线接种Bacillusatrophaeus XW2和杨树炭疽病菌的平板对峙培养生长情况结果。

图3为萎缩芽孢杆菌Bacillus atrophaeus XW2（微生物保藏号CGMCCNO.7698）发酵液的过滤液对杨树炭疽病菌菌丝的致畸作用的显微观察结果，其中A为杨树炭疽病菌的正常菌丝（10×40）；B为添加Bacillus atrophaeus XW2菌株发酵液的过滤液后形成的杨树炭疽病菌中间或前端膨大状的畸形菌丝（10×40）。

图4为萎缩芽孢杆菌Bacillus atrophaeus XW2（微生物保藏号CGMCCNO.7698）发酵菌悬液对杨树炭疽病菌菌丝生长的抑制试验结果，其中A为添加无菌水的对照组杨树炭疽病菌正常生长情况；B为添加Bacillus atrophaeus XW2菌株发酵菌悬液后，杨树炭疽病菌被抑制，几乎没有生长。

图5为萎缩芽孢杆菌Bacillus atrophaeus XW2（微生物保藏号CGMCC NO.7698）发酵液过滤液对杨树炭疽病菌萌发孢子的芽管致畸作用的试验结果，其中A为正常的孢子萌发并形成附着胞（10×40）；B为添加Bacillus atrophaeus XW2菌株发酵液过滤液后，形成的病菌孢子，虽能萌发但芽管畸形，前端膨大呈泡囊状，不能形成正常附着胞（畸形变大或变形）（10×40）。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

下述实施例中的方法，无特别说明，均为常规方法。下述实施例中的百分含量，无特殊说明，均为质量百分含量。

实施例1拮抗菌萎缩芽孢杆菌Bacillus atrophaeus XW2的筛选及其鉴定

1、杨树炭疽病菌拮抗菌Bacillus atrophaeus XW2的筛选

本发明的菌株采自北京市昌平区大汤山村健康杨树。

1A）取新鲜采集的健康杨树树叶1.5g，置于装有10mL无菌水的灭菌研钵中，加入少许灭菌的石英砂研磨均匀，静置15min。取1mL悬浮液用10倍梯度稀释法依次稀释得到10^-3、10^-4、10^-5浓度梯度的稀释液，从各个浓度梯度悬浮液中取0.1mL，用无菌涂布棒涂于LB培养基平板上，以无菌水为对照，涂抹均匀后放到恒温箱中28℃恒温倒置培养；其中LB培养基（1000mL）：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，琼脂粉15g，pH7.0-7.2。

1B）连续观察8天后，挑取菌落形态不同的菌株，再次在平板上进行划线纯化培养，获得杨树内生菌菌株，并保存备用。

1C）在马铃薯琼脂培养基（PDA）平板中央接入新鲜的杨树炭疽病菌（提供自中国林业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CFCC80308）菌饼，其中炭疽病菌菌饼的直径为6mm，接着用接种环分别挑取少许分离纯化后的杨树内生菌菌苔，在距杨树炭疽菌菌饼两侧2cm处轻轻划线，放置于培养箱中，28℃恒温倒置对峙培养，每个对峙实验平行重复3次。

1D）7天后观察并记录抑菌带的有无以及大小，选出对杨树炭疽病菌具有最强抑制效果的1株内生菌株。结果表明XW2菌株的抑菌效果最好，抑菌带宽度最宽，抑菌带宽度≥25mm。

1E）无菌操作从具有抑菌效果最明显的PDA平板上筛选出抑菌效果最明显（抑菌活性最强）的菌株进行纯化培养，获得一株对杨树炭疽病菌具有强拮抗作用的菌株Bacillus atrophaeus XW2。

2、杨树炭疽病菌拮抗菌XW2菌株的鉴定

采用菌落形态观察、常规生理生化方法对Bacillus atrophaeus XW2菌株进行鉴定，鉴定出该菌株属于芽孢杆菌属。

2A）萎缩芽孢杆菌Bacillus atrophaeus XW2在LB培养基（每1000mL含有胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，琼脂粉15g，pH7.0-7.2）平板上呈乳白色，不透明，菌落光滑，中央隆起，边缘完整，如图1A所示。

2B）通过显微镜观察表明Bacillus atrophaeus XW2菌体大小约0.5-0.8um×1.5-2.5um之间，无荚膜，有芽孢，周生鞭毛，能运动，革兰氏染色阳性，如图2B所示。

2C）生化实验结果表明，Bacillus atrophaeus XW2具有运动性，好氧，V-P反应呈阳性，甲基红反应呈阳性，氧化酶反应呈阳性，接触酶反应呈阳性，能还原硝酸盐，水解淀粉和酪蛋白，能液化明胶，能氧化葡萄糖、L-阿拉伯糖、甘露醇产酸，不能氧化D-木糖产酸，氧化葡萄糖但不产气，能在含有酪氨酸的NB培养基（每1000mL含有牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，酪氨酸1g，琼脂20g，pH7.0-7.2）上产生黑色色素。能在0.5%-10%的NaCl浓度的NB培养液（每1000mL含有牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，pH7.0-7.2）中生长。依据《常见细菌鉴定手册》，进一步对Bacillus atrophaeus XW2菌株的形状、大小、其它生理生化反应进行检测，明确基本生物学特性。本发明的Bacillus atrophaeus XW2菌株的生物学特性如表1所示。

表1Bacillus atrophaeus XW2菌株的基本生物学特性

注：“＋”表示阳性，“－”表示阴性。

根据《常见细菌鉴定手册》，对照菌株XW2的形态特征及生理生化特性，鉴定菌株XW2为Bacillus属菌株。并确认本发明菌株为萎缩芽孢杆菌Bacillus atrophaeus。而且，该株萎缩芽孢杆菌生理生化特征中卵黄水解呈阳性及利用D-木糖产酸呈阴性的特征区别于典型的萎缩芽孢杆菌。本发明的萎缩芽孢杆菌Bacillus atrophaeus XW2菌株已于2013年6月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC,北京市朝阳区北辰西路），中国科学院微生物研究所；保藏号为CGMCCNO.7698。

实施例2Bacillus atrophaeus XW2菌株对不同碳源、氮源的利用情况的确定

1、Bacillus atrophaeus XW2菌株对不同碳源的利用情况的确定

1A）参考《常见细菌系统鉴定手册》中的方法，利用碳源基础培养基（每1000mL含有（NH₄）₂SO₄2.0g，NaH₂PO₄·H₂O0.5g，K₂HPO₄0.5g，MgSO₄·7H₂O0.2g，CaCl₂·2H₂O0.1g，pH7.0-7.2），分别加入不同的碳源，碳源的终浓度除糖醇类为0.5%～1%之外，一般为0.1%～0.2%，制得含有不同碳源的碳源基础培养基；

1B）挑取一菌环活化后的Bacillus atrophaeus XW2菌于1mL无菌水中振荡混匀制备成菌悬液；

1C）分别吸取10uL菌悬液，接种于装液量为5mL的含有不同碳源的碳源基础培养基的试管中，即为试验组；含有不同碳源的碳源基础培养基分别设置对照组，即在装液量为5mL的含有不同碳源的碳源基础培养基的试管中不接种Bacillusatrophaeus XW2菌悬液，将试验组与各设置的对照组于28℃，180rpm条件下振荡培养3d后，分别以不同碳源基础培养基的对照组为空白对照，测定培养后的接种了Bacillus atrophaeus XW2菌悬液的试管培养基的OD₆₀₀值，比较确定细菌Bacillusatrophaeus XW2对不同的碳源的利用情况。测定结果如表2所示。

表2Bacillus atrophaeus XW2菌株对不同碳源的利用情况

注：“＋＋＋＋”表示利用最好，“＋＋＋”表示利用较好，“＋＋”表示利用好，“＋”表示利用一般，“－”不能利用。

测定结果表明：Bacillus atrophaeus XW2菌株利用乳酸做碳源最好，其次是利用葡萄糖、蔗糖、果糖和柠檬酸做碳源较好，不能利用乳糖、乙醇、乙酸、D-木糖、丙二酸做碳源。

2、Bacillus atrophaeus XW2菌株对不同氮源的利用情况的确定

2A）参考《常见细菌系统鉴定手册》中的方法，利用氮源基础培养基（每1000mL含有Na₂HPO₄2.16g，KH₂PO₄1.36g，MgSO₄·7H₂O0.2g，FeSO₄0.5g，CaCl₂5.00g，葡萄糖10g，pH7.0-7.2），分别加入不同的氮源，氮源的浓度为0.05%～0.1%，制得含有不同氮源的氮源基础培养基；

2B）挑取一菌环活化后的Bacillus atrophaeus XW2菌于1mL无菌水中振荡混匀制备成菌悬液；

2C）分别吸取10uL菌悬液接种于装液量为5mL含不同氮源的基础培养基的试管中，即为试验组；含有不同氮源的氮源的基础培养基分别设置对照组，即在装液量为5mL的含有不同氮源的氮源基础培养基的试管中不接种Bacillus atrophaeusXW2菌悬液，将试验组与各设置的对照组于28℃，180rpm条件下振荡培养3d后，分别以不同碳源基础培养基的对照组为空白对照，测定培养后的接种了Bacillusatrophaeus XW2菌悬液的试管培养基的OD₆₀₀值，比较确定细菌Bacillus atrophaeusXW2对不同的氮源的利用情况。测定结果如表3所示。

表3Bacillus atrophaeus XW2菌株对氮源的利用情况

注：“＋＋＋＋”表示利用最好，“＋＋＋”表示利用较好，“＋＋”表示利用好，“＋”表示利用一般，“－”不能利用。

测定结果表明：Bacillus atrophaeus XW2菌株利用蛋白胨做氮源最好，其次利用酵母膏、谷氨酸和天冬氨酸做氮源较好，不能利用亚硝酸钠做氮源。

实施例3Bacillus atrophaeus XW2菌株的培养特性的确定

1、Bacillus atrophaeus XW2菌株生长最适培养基的确定

1A）配制培养基

LB培养基成分：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，蒸馏水调节总体积为1000ml，pH7.0-7.2；

NB培养基成分：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl5g，蒸馏水调节总体积为1000ml，pH7.0-7.2；

PDB培养基成分：马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水调节总体积为1000ml，pH7.0-7.2；

高氏1号培养基成分：可溶性淀粉20g，KNO₃1g，NaCl0.5g，K₂HPO₄0.5g，MgSO₄·7H₂O0.5g，FeSO₄·7H₂O0.01g，蒸馏水调节总体积为1000ml，pH7.0-7.2；

King B2培养基成分：蛋白胨20g，MgSO₄·7H₂O1.5g，甘油10mL，K₂HPO₄1.5g，蒸馏水调节总体积为1000ml，pH7.0-7.2；

玉米粉培养基成分：玉米粉5g，蛋白胨0.1g，葡萄糖1g，蒸馏水调节总体积为1000ml，pH7.0-7.2；

麸皮培养基成分：麸皮36g，(NH₄)₂HPO₄10g，K₂HPO₄0.2g，MgSO₄·7H₂O0.1g，蒸馏水调节总体积为1000ml，pH7.0-7.2；

参考培养基1成分：牛肉膏3g，蛋白胨5g，酵母粉0.5g，葡萄糖10g，蒸馏水调节总体积为1000ml，pH7.0-7.2；

参考培养基2成分：葡萄糖20g，大豆粉20g，蛋白胨6g，NaCl5g，CaCO₃4g，蒸馏水调节总体积为1000ml，pH7.0-7.2；

参考培养基3成分：可溶性淀粉5g，葡萄糖3g，大豆粉5g，蛋白胨4g，酵母膏4g，KNO₃1g，NaCl0.5g，CaCO₃0.5g，KH₂PO₄0.5g，MgSO₄0.5g，FeSO₄0.01g，蒸馏水调节总体积为1000ml，pH7.0-7.2；

参考培养基4成分：蔗糖10g，可溶性淀粉10g，大豆粉20g，K₂HPO₄0.5g，MgSO₄0.5g，NaCl1g，FeSO₄0.01g，蒸馏水调节总体积为1000ml，pH7.0-7.2；

1B）将Bacillus atrophaeusXW2菌株接种在NB培养基中，于28℃，180rpm的条件下振荡培养2d，制得Bacillus atrophaeus XW2菌株种子液，其中，Bacillusatrophaeus XW2菌株种子液稀释10倍后的OD₆₀₀值约为0.6；

1C）分别将上述制备的培养基100ml装入250mL的三角瓶中，灭菌后，分别接种1mL的Bacillus atrophaeus XW2菌株种子液，接着分别在28℃,180rpm条件下振荡培养2d，然后将不同培养基培养液稀释10倍后测定OD₆₀₀值。测定结果如表4所示。

表4Bacillus atrophaeus XW2菌株在不同培养基下的生长状况

培养基	OD600值	培养基	OD600值
				LB	0.981±0.040	参考培养基1	0.206±0.003
NB	0.672±0.010	参考培养基2	0.380±0.034
				PDB	0.548±0.020	参考培养基3	0.423±0.028
参考培养基4	0.664±0.070	高氏1号	0.082±0.020
				King B2	0.589±0.026	玉米粉培养基	0.041±0.005
麸皮培养基	0.338±0.020

测定结果表明：Bacillus atrophaeus XW2菌株在LB培养基中生长最好，其次在NB、PDB、King B2和参考培养基4中生长较好，在高氏1号和玉米粉培养基中生长一般。

2、XW2菌株最适生长温度的确定

2A）将Bacillus atrophaeusXW2菌株接种于灭菌的NB培养基中，于28℃，180rpm的条件下振荡培养2d，制得Bacillus atrophaeus XW2菌株种子液，其中，Bacillusatrophaeus XW2菌株种子液稀释10倍后的OD₆₀₀值约为0.6；

2B）将Bacillus atrophaeus XW2菌株种子液分别接种于装有100mL灭菌NB液体培养基的250mL三角瓶中，在5～55℃之间设12个温度梯度（具体取值如表5所示）处理，各温度处理组在180rpm下分别恒温振荡培养2d后，将培养液稀释10倍后测定OD₆₀₀值，测定结果如表5所示。

表5.XW2菌株在不同温度条件下的生长状况

温度	OD600值	温度	OD600值
				5℃	0	30℃	0.489±0.009
10℃	0.008±0.001	37℃	0.414±0.037
				15℃	0.139±0.005	40℃	0.200±0.037
20℃	0.221±0.012	45℃	0.029±0.009
				25℃	0.486±0.010	50℃	0
28℃	0.534±0.004	55℃	0

测定结果表明：Bacillus atrophaeus XW2菌株在10℃～45℃温度条件下能生长，在小于10℃大于45℃温度条件下不能生长，其中最适生长温度为28℃。

3、Bacillus atrophaeus XW2菌株最适生长pH的确定

3A）将Bacillus atrophaeusXW2菌株接种于灭菌的NB培养基中，于28℃，180rpm的条件下振荡培养2d，制得Bacillus atrophaeus XW2菌株种子液，其中，Bacillusatrophaeus XW2菌株种子液稀释10倍后的OD₆₀₀值约为0.6；

3B）将Bacillus atrophaeus XW2菌株种子液分别接种于装有100mL灭菌NB液体培养基的250mL三角瓶中，分别调节液体培养基至pH为3～11的不同pH值（具体取值如表6所示）条件下，在28℃,180rpm条件下振荡培养2d，然后将不同培养基培养液稀释10倍后测定OD₆₀₀值。测定结果如表6所示。

表6Bacillus atrophaeus XW2菌株在不同pH值条件下的生长状况

pH值	OD600值	pH值	OD600值
				3	0	7.5	0.603±0.007
4	0.005±0.001	8	0.604±0.002
				5	0.611±0.018	8.5	0.603±0.004
5.5	0.615±0.003	9	0.518±0.023
				6	0.604±0.001	10	0.005±0.001
6.5	0.599±0.004	11	0
				7	0.652±0.007

测定结果表明：Bacillus atrophaeus XW2菌株在pH为4～10的条件下生长，其中在pH为5～9之间的生长情况差异不大，在pH小于4和pH大于10的范围内不能生长，最适生长pH为7。

4、Bacillus atrophaeus XW2菌株生长耐盐性情况的确定

4A）将Bacillus atrophaeusXW2菌株接种于灭菌的NB培养基中，于28℃，180rpm的条件下振荡培养2d，制得Bacillus atrophaeus XW2菌株种子液，其中，Bacillusatrophaeus XW2菌株种子液稀释10倍后的OD₆₀₀值约为0.6；

4B）将Bacillus atrophaeus XW2菌株种子液分别接种于装有100mL灭菌NB液体培养基的250mL三角瓶中，分别调节液体培养基至0.5%～10%的不同NaCl浓度值（具体取值如表7所示）条件下，在28℃,180rpm条件下振荡培养2d，然后将不同培养基培养液稀释10倍后测定OD₆₀₀值。测定结果如表7所示。

表7Bacillus atrophaeus XW2菌株在不同NaCl浓度条件下的生长状况

测定结果表明：Bacillus atrophaeus XW2菌株能在0.5%～10%的NaCl浓度的NB培养基中生长，在0.5%～2%的NaCl的浓度的NB培养基中生长情况差异不大且生长最好，在大于15%的NaCl浓度的NB培养基中不能生长。

实施例4用本发明的Bacillus atrophaeus XW2菌株对杨树炭疽病菌的拮抗作用对峙培养试验

将直径为6mm的新鲜的杨树炭疽病菌（提供自中国林业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CFCC80308）菌饼置于PDA平板中央，接着在菌饼两侧2cm处划线接种筛选纯化后的Bacillus atrophaeus XW2菌株；对照组为不接种Bacillusatrophaeus XW2菌株；将PDA平板放入28℃培养箱中进行对峙培养，培养7天后，观察Bacillus atrophaeus XW2菌株的拮抗效果。

观察结果发现：对照组炭疽病菌生长正常（如图2A），处理组即本发明筛选得到的Bacillus atrophaeus XW2菌株对杨树炭疽病菌有很强的拮抗作用（如图2B）。

实施例5用本发明的Bacillus atrophaeus XW2菌株发酵过滤液对杨树炭疽病菌菌丝的致畸作用

1、制备Bacillus atrophaeus XW2菌株发酵过滤液

用接种环挑取在NA培养基（每1000mL含有胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，琼脂粉15g，pH7.0-7.2）上生长的Bacillus atrophaeus XW2菌种，用接种环接入装有100mL灭菌NB培养基的三角瓶（250mL）中，于28℃，180rpm振荡培养72h，得到即为发酵液菌悬液，发酵菌悬液离心后过0.45um细菌过滤器过滤，得到无菌的Bacillus atrophaeus XW2菌株发酵过滤液；

2、在凹玻片中分别加入20uL1%的葡萄糖溶液，挑取少许培养的杨树炭疽菌菌落边缘的新鲜菌丝混在凹玻片的葡萄糖溶液中，接着将凹玻片分成2组，在其中一组凹玻片中混入10uL的Bacillus atrophaeus XW2菌株发酵过滤液，作为处理组；在另一组凹玻片中不添加Bacillus atrophaeus XW2菌株发酵过滤液，将其作为对照组；

将2组凹玻片置于培养皿中保湿，于25℃的培养箱中培养，连续观察炭疽病菌菌丝的生长形态变化。显微观察发现对照组的杨树炭疽菌菌丝粗细均匀，原生质分布均匀（如图3A）；处理组菌丝前期菌丝原生质浓缩，菌丝膨大，形态不均匀，后期菌丝膨大加剧呈断裂、破碎状（如图3B）。

实施例6用本发明的Bacillus atrophaeus XW2菌株对杨树炭疽病菌菌丝生长的抑制作用

1、XW2菌株发酵液菌悬液对杨树炭疽病菌菌丝生长速率的影响

将筛选纯化后的Bacillus atrophaeus XW2菌株单菌落接种在NA培养基上，于28℃培养48h，各挑取一接种环接入装有100mL灭菌NB培养基的三角瓶（250mL）中，于28℃，180rpm振荡培养72h，制得Bacillus atrophaeus XW2菌株菌悬液，菌悬液稀释10倍后的OD₆₀₀值为0.654；

吸取XW2菌株发酵菌悬液混入到灭菌、冷却至45℃左右的PDA培养基中，其中菌悬液与PDA培养基的混合体积比为1：200，混匀倒平板，接着在平板中央接入直径为6mm的新鲜的杨树炭疽病菌菌饼，作为处理组；对照组为在PDA培养基中倒入与发酵菌悬液同等体积的无菌水；各处理3个重复，于28℃培养箱中培养，培养7d后测量菌落生长直径，计算菌落生长速率和抑菌率，测定结果如表8，其中菌落直径采用十字交叉法测定，菌落直径法测抑菌率计算公式如下：

抑菌率=(对照组菌落净生长距离—处理组菌落净生长距离)/对照组菌落净生长距离×100%

表8XW2菌株发酵菌悬液对杨树炭疽病菌菌丝生长速率的影响结果（7天）

注：CK表示加入无菌水的对照组，XW2为加入菌悬液的处理组。

实验结果表明：拮抗菌Bacillus atrophaeus XW2菌株对杨树炭疽病菌的菌丝生长速率的抑制作用明显，杨树炭疽病菌在实验平板上的生长几乎完全被抑制（如图4B），而对照组生长正常（如图4A）。在拮抗菌XW2的抑菌作用下，杨树炭疽病菌的生长速率明显减缓；且拮抗菌XW2发酵菌悬液对杨树炭疽病菌的抑制率在一周内都保持较高的水平，培养7天能保持86.71%的抑菌效果，甚至培养10天后依然能保持较高的抑菌效果。

2、XW2菌株发酵液菌悬液对杨树炭疽病菌菌丝生长量的影响

将上述“XW2菌株发酵液菌悬液对杨树炭疽病菌菌丝生长速率的影响”实验中处理组和对照组培养7d以后的长有杨树炭疽病菌菌丝的PDA培养基加热融化，过滤得到菌丝体，再用蒸馏水冲洗3-4次，将洗干净的菌丝体在60℃条件下烘干至恒重，称量菌丝体干重，计算拮抗菌XW2对杨树炭疽病菌菌丝生长量的抑制率，结果如表9所示，其中菌丝体干重法测抑菌率计算公式如下：

抑菌率=（对照组菌丝体净生长干重—处理组菌丝体净生长干重）/对照组菌丝体净生长干重×100%

表9XW2菌株发酵液悬浮液对杨树炭疽病菌菌丝生长量的影响结果（7天）

注：CK表示加入无菌水的对照组，XW2为加入菌悬液的处理组。

实验结果表明：拮抗菌Bacillus atrophaeus XW2对杨树炭疽病菌菌丝体生长量的抑制效率达到88.74%，说明拮抗菌XW2对杨树炭疽病菌的菌丝生长抑制作用显著。

实施例7用本发明的Bacillus atrophaeus XW2菌株发酵上清液和过滤液对杨树炭疽病菌的孢子萌发的抑制作用

采用凹玻片孢子萌发法检测XW2菌株对杨树炭疽病菌的孢子萌发的抑制能力。

1、制备XW2菌株发酵上清液、发酵过滤液

将在NA培养基上生长的XW2菌种用接种环接入装有100mL灭菌NB培养基的250mL的三角瓶中，于28℃，180rpm振荡培养72h，得到XW2菌株发酵菌悬液；

将发酵菌悬液离心，除去沉淀，得到XW2菌株发酵液上清液；接着将一部分XW2菌株发酵上清液再通过0.45um细菌过滤器过滤，得到无菌的XW2菌株发酵过滤液；然后将发酵过滤液稀释，得到稀释倍数为2倍、10倍、50倍、100倍、500倍的发酵过滤液稀释液；

2、在凹玻片中分别滴入10uL的杨树炭疽病菌孢子悬浮液（孢子浓度为2.5×10⁵个/mL），接着讲凹玻片分成2组，其中一组再在各凹玻片中分别滴入20uL的发酵液上清液和不同稀释倍数发酵过滤液稀释液，作为处理组；另一组为对照组，滴入20uL无菌水；混匀后置于培养皿中保湿，在25℃的培养箱中培养，24h以后观察孢子萌发情况，观察结果如表10和图5所示。

表10.XW2菌株培养液对杨树炭疽病菌孢子萌发的抑制作用

注：CK表示加入无菌水的对照组

实验结果表明：显微观察发现对照组孢子萌发率能够达到95.3%，并且生长正常，形成细长且均匀的芽管（如图5A），但在加有Bacillus atrophaeus XW2菌株发酵上清液的处理组中杨树炭疽病菌孢子被完全抑制，没有萌发，XW2菌株发酵上清液对杨树炭疽病孢子的抑制率为100%；发酵过滤液原液、稀释2倍和10倍的发酵过滤液稀释液中的孢子只有13.3%～76.0%的萌发率，抑制率达到86.0%，且萌发的孢子芽管生长缓慢，芽管短、变畸形且粗细不均匀，芽管前端明显膨大呈泡囊状，后期芽管断裂呈碎裂状（如图5B）；而且发酵过滤液原液、稀释2倍和10倍的发酵过滤液稀释液的萌发孢子芽管畸形率均达到100%；稀释50倍的发酵过滤液稀释液的萌发孢子芽管畸形率也达到31.5%（表10）。结果说明Bacillus atrophaeus XW2菌株的发酵过滤液中含有对杨树炭疽病菌有高效抑制作用的活性成分，表明XW2菌株在发酵培养过程中产生了对杨树炭疽病菌有抑制作用、致畸作用的代谢产物。

Claims (9)

1.一株拮抗杨树炭疽病的细菌菌株（Bacillus atrophaeus XW2），其微生物保藏号为CGMCC NO.7698。

2.权利要求1所述的细菌菌株的突变体、变异体或其衍生物。

3.如权利要求1所述的细菌菌株得到的菌株培养物、发酵培养液或发酵培养液的过滤液。

4.如权利要求2所述的细菌菌株的突变体、变异体或其衍生物得到的菌株培养物、发酵培养液或发酵培养液的过滤液。

5.权利要求1所述的细菌菌株为活性成分的生物菌剂。

6.权利要求1所述拮抗杨树炭疽病的细菌菌株在拮抗杨树炭疽病菌中的应用。

7.权利要求2所述的细菌菌株的突变体、变异体或其衍生物在拮抗杨树炭疽病菌中的应用。

8.如权利要求3或4所述的菌株培养物、发酵培养液或发酵培养液的过滤液在拮抗杨树炭疽病菌中的应用。

9.如权利要求6、7或8所述的应用，其特征是所述拮抗杨树炭疽病菌包括抑制杨树炭疽病菌的生长、致畸杨树炭疽病菌的菌丝、抑制杨树炭疽病菌的孢子萌发、致畸杨树炭疽病菌萌发孢子。

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