CN110468080A - 促生水稻与降镉的微生物菌剂及其制备方法和使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了促生水稻与降镉的微生物菌剂及其制备方法和使用方法，属于微生物治理重金属污染技术领域。本发明提供的微生物菌剂包括格氏利斯特氏菌、伯克氏菌、施氏假单胞菌、枯草芽孢杆菌和棘孢小单孢菌，经过菌种活化、扩大培养、发酵培养后混合制备而成，在水稻生长的返青期以体积比1:400加入水稻水培盆栽营养液中培养至最高分蘖期。在格氏利斯特氏菌50％、伯克氏菌占20％、施氏假单胞菌占10％、棘孢小单孢菌占10％、枯草芽孢杆菌占20％的数量百分比的情况下，水稻对重金属镉的吸收率最低且具有促进水稻生长的潜力。本发明制备的微生物菌剂对水稻促生和降低水稻对镉的吸收有着积极的影响，有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于微生物治理重金属污染技术领域，具体涉及一种促生水稻与降镉的微生物菌剂及其制备方法和使用方法。
背景技术
水稻是我国的主要粮食作物，也是一种对镉富集指数极高的农作物。据不完全统计，我国受镉污染的农田面积已超过20万公顷，每年生产镉含量超标的农产品达14.6亿千克，由于重金属污染导致的粮食每年减产1000多万吨，受污染粮食多达1200多万吨，经济损失达200多亿元。镉的移动性很强，容易通过植物根系的吸收作用富集在植物体内，扰乱植物的正常生理活动，诱导遗传因子发生变异，超过一定浓度还能导致植物猝死，除此之外，镉还能通过食物链在生物圈内传导，往往食物链等级越高的生物体内镉富集量越大。
传统的土壤重金属修复方法由于周期长、修复深度受限、不适宜大面积治理等缺点推广受到限制，迫切需求一种低成本、绿色高效的技术解决水稻生产安全问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提供一种促生水稻与降镉的微生物菌剂及其制备方法和使用方法，该微生物菌剂生长迅速，能够促进水稻生长，并能对水稻中镉的吸收与转运起到高效的抑制作用。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下:
第一方面，本发明提供一种促生水稻与降镉的微生物菌剂，包括以数量百分比计的如下成分：格氏利斯特氏菌(listeria grayi)46％-58％，伯克氏菌(Burkholderia sp.)12％-25％，施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)6％-13％，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)5％-15％，棘孢小单孢菌(Micromonospora echinospora)8％-12％。
优选地，所述菌剂包括以数量百分比计的如下成分，格氏利斯特氏菌(listeriagrayi)50％，伯克氏菌(Burkholderia sp.)20％，施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)10％，棘孢小单孢菌(Micromonospora echinospora)10％，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)20％。
优选地，所述格氏利斯特氏菌(listeria grayi)保藏号为CCTCC NO.97019，所述伯克氏菌(Burkholderia sp.)保藏号为CCTCC AB 209362，所述施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)保藏号为CICC NO.10402，所述棘孢小单孢菌(Micromonosporaechinospora)保藏号为CCTCC NO.205694，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)保藏号为CICC AB 10732。
第二方面，本发明还提供一种上述微生物菌剂的制备方法，包括以下制备步骤：
所述格氏利斯特氏菌(Listeria grayi)、所述伯克氏菌(Burkholderia sp.)、所述施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、所述棘孢小单孢菌(Micromonosporaechinospora)、所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株经固体斜面活化后，分别接种于液体培养基中进行扩大培养48-72h，然后分别加入发酵培养基，以葡萄糖作为碳源，牛肉膏作氮源，以氯化钙为无机盐，调节培养基pH值，在30℃，170r/min条件下培养36-60h，按照所述数量百分比将各菌株的发酵液混合即得到所述一种促生水稻与降镉的微生物菌剂。
优选地，所述格氏利斯特氏菌的液体培养基的配方为：琼脂2.5g/L，明胶80g/L，葡萄糖10g/L，灭菌脱纤维羊血或兔血6g/L，调整pH至7.2-9.6；
所述伯克氏菌的液体培养基的配方为：甘露醇10g/L，硫酸铵2g/L，蛋白胨2g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化钠0.1g/L，硫酸亚铁0.05g/L；硫酸锰0.05g/L，调整pH值至7.0；
所述施氏假单胞菌的液体培养基配方为：胰蛋白胨15g/L，大豆胨5.0g/L，氯化钠5.0g/L，琼脂13g/L，调整pH至7.0；
所述棘孢小单孢菌的液体培养基的配方为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，调整pH至7.0；
所述枯草芽孢菌的培养基的配方为：牛肉膏10g/L，琼脂2g/L，蛋白胨2g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化钠0.1g/L，硫酸亚铁0.05g/L，硫酸锰0.05g/L，调整pH值至7.0；
将保存在液氮中的菌种冻干粉接种到SMAY平板上，在25±1℃和12L:12D光照条件下培养7d，长满孢子的平板贮藏于-20℃冰箱备用，所有孢子粉的活孢率不低于95％。
进一步地，所述发酵培养基中包括葡萄糖15-25g/L，牛肉膏3.0-5.0g/L，氯化钙1.0-6.0g/L，调节培养基pH值至6.0-7.0。
第三方面，本发明还提供一种上述促生水稻与降镉的微生物菌剂的用途，所述用途为：
将所述微生物菌剂在水稻生长的返青期以体积比1:400加入水稻水培盆栽营养液中培养至最高分蘖期。
进一步的，将所述微生物菌剂菌体浓度调整至1×108cfu/mL后使用。
本发明的有益效果在于：
本发明提供的制备方法简单，采用多种菌株培养混合而成，生产成本低，适合推广和工业化大规模生产。本发明提供的使用方法是将微生物菌剂加入水稻水培盆栽营养液中对水稻进行培养，有利于水稻的吸收且处理量大、操作简单。本发明提供的微生物菌剂首次采用对水稻具有促生作用及降低水稻对重金属镉的吸收作用的混合菌群，进行扩大培养，复配在一起能很好地共生，能高效协同降低水稻对重金属镉的吸收，不仅可以避免资源浪费，还可以高效绿色的解决降低水稻对重金属镉的吸收的危害问题，具有广泛的应用前景。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的格氏利斯特氏菌(Listeria grayi)菌株CCTCC NO.97019购自中国典型培养物保藏中心。
下述实施例中所用的所述伯克氏菌(Burkholderia sp.)菌株CCTCC AB209362购自中国典型培养物保藏中心。
下述实施例中所用的所述施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)菌株CICCNO.10402购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。
下述实施例中所用的棘孢小单孢菌(Micromonospora echinospora)菌株CCTCCNO.205694购自中国典型培养物保藏中心。
下述实施例中所用的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株CICC AB 10732购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。
以下通过实施例对本发明作进一步阐述，但不作为对本发明的限定。
实施例
格氏利斯特氏菌的液体培养基的配方为：琼脂2.5g/L，明胶80g/L，葡萄糖10g/L，灭菌脱纤维羊血或兔血6g/L调整pH至7.2-9.6；
伯克氏菌的液体培养基的配方为：甘露醇10g/L；硫酸铵2g/L；蛋白胨2g/L；磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化钠0.1g/L；硫酸亚铁0.05g/L；硫酸锰0.05g/L，调整pH值至7.0；
施氏假单胞菌的液体培养基配方为：胰蛋白胨15g/L，大豆胨5.0g/L，氯化钠5.0g/L，琼脂13g/L，调整pH至7.0；
棘孢小单孢菌的液体培养基的配方为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，调整pH至7.0；
枯草芽孢杆菌的液体培养基的配方为：牛肉膏10g/L；琼脂2g/L；蛋白胨2g/L；磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化钠0.1g/L；硫酸亚铁0.05g/L；硫酸锰0.05g/L，调整pH值至7.0；
制备例1
一种促生水稻与降镉的微生物菌剂，包括以数量百分比计的如下成分：格氏利斯特氏菌50％、伯克氏菌20％、施氏假单胞菌10％、棘孢小单孢菌10％、枯草芽孢杆菌20％。
一种促生水稻与降镉的微生物菌剂的制备方法为：格氏利斯特氏菌、伯克氏菌、施氏假单胞菌、棘孢小单孢菌、枯草芽孢杆菌菌株经固体斜面活化后，分别接种于液体培养基中进行扩大培养48h，然后分别加入发酵培养基，以葡萄糖作为碳源，牛肉膏作氮源，以氯化钙为无机盐，调节培养基pH值，在30℃，170r/min条件下培养36h，发酵培养基中包括葡萄糖15g/L，牛肉膏3.0g/L，氯化钙1.0g/L，调节培养基pH值至6.5，按照数量百分比将各菌株的发酵液混合即得到一种促生水稻与降镉的微生物菌剂。
制备例2
一种促生水稻与降镉的微生物菌剂，包括以数量百分比计的如下成分：格氏利斯特氏菌46％、伯克氏菌25％、施氏假单胞菌6％、棘孢小单孢菌12％、枯草芽孢杆菌11％。
一种促生水稻与降镉的微生物菌剂的制备方法为：格氏利斯特氏菌、伯克氏菌、施氏假单胞菌、棘孢小单孢菌、枯草芽孢杆菌菌株经固体斜面活化后，分别接种于液体培养基中进行扩大培养60h，然后分别加入发酵培养基，以葡萄糖作为碳源，牛肉膏作氮源，以氯化钙为无机盐，调节培养基pH值，在30℃，170r/min条件下培养48h，发酵培养基中包括葡萄糖20g/L，牛肉膏4.0g/L，氯化钙2.0g/L，调节培养基pH值至6.5，按照数量百分比将各菌株的发酵液混合即得到一种促生水稻与降镉的微生物菌剂。
制备例3
一种促生水稻与降镉的微生物菌剂，包括以数量百分比计的如下成分：格氏利斯特氏菌49％、伯克氏菌21％、施氏假单胞菌13％、棘孢小单孢菌6％、枯草芽孢杆菌11％。
一种促生水稻与降镉的微生物菌剂的制备方法为：格氏利斯特氏菌、伯克氏菌、施氏假单胞菌、棘孢小单孢菌、枯草芽孢杆菌菌株经固体斜面活化后，分别接种于液体培养基中进行扩大培养72h，然后分别加入发酵培养基，以葡萄糖作为碳源，牛肉膏作氮源，以氯化钙为无机盐，调节培养基pH值，在30℃，170r/min条件下培养60h，发酵培养基中包括葡萄糖25g/L，牛肉膏5.0g/L，氯化钙6.0g/L，调节培养基pH值至6.0，按照数量百分比将各菌株的发酵液混合即得到一种促生水稻与降镉的微生物菌剂。
制备例4
一种促生水稻与降镉的微生物菌剂，包括以数量百分比计的如下成分：格氏利斯特氏菌53％、伯克氏菌23％、施氏假单胞菌9％、棘孢小单孢菌6％、枯草芽孢杆菌9％。
一种促生水稻与降镉的微生物菌剂的制备方法为：格氏利斯特氏菌、伯克氏菌、施氏假单胞菌、棘孢小单孢菌、枯草芽孢杆菌菌株经固体斜面活化后，分别接种于液体培养基中进行扩大培养48h，然后分别加入发酵培养基，以葡萄糖作为碳源，牛肉膏作氮源，以氯化钙为无机盐，调节培养基pH值，在30℃，170r/min条件下培养40h，发酵培养基中包括葡萄糖20g/L，牛肉膏5.0g/L，氯化钙4.0g/L，调节培养基pH值至7.0，按照数量百分比将各菌株的发酵液混合即得到一种促生水稻与降镉的微生物菌剂。
实验例1
实验方法为：
(1)用水选法选取颗粒饱满充实水稻种子，置于5％次氯酸钠溶液中浸泡15分钟后，用蒸馏水洗净。于28℃恒温培养箱中浸种，催芽4d，采用水培法，播种在塑料盆内(200株/盆)，在适宜的环境中培养。待水稻苗长到三叶一心(三叶期)后开始移栽于水培盆栽中试验；
(2)水培盆栽中加入CdCl2溶液，Cd2+终浓度为100ppb；
(3)将菌剂中的菌体浓度调整至1×108cfu/mL后使用，在水稻生长返青期以体积比1:400加入水稻水培盆栽营养液中，培养至最高分蘖期后测定其根茎叶中的镉含量。
(4)设置多个不同处理。镉的含量用常规方法测定。接种放恒温箱(DHP-9082，武汉环视检测设备有限公司)内培养3d、4d、7d。
处理1-4中分别施用制备例1-4制备的微生物菌剂和Cd2+终浓度为100ppb的CdCl2溶液。
处理5仅施用格氏利斯特氏菌发酵液，其他设置与处理1相同。
处理6仅施用伯克氏菌发酵液，其他设置与处理1相同。
处理7仅施用施氏假单细胞菌发酵液，其他设置与处理1相同。
处理8仅施用棘孢小单孢菌发酵液，其他设置与处理1相同。
处理9仅施用枯草芽孢杆菌发酵液，其他设置与处理1相同。
处理10为CK，其他设置与处理1相同。
表1不同处理下水稻根、茎、叶的镉含量
如表1所示，接种的培养天数对降低根中镉、茎中镉和叶中镉的含量的影响不大。处理1-4说明，施用本发明提供的微生物菌剂，能够有效降低根中镉、茎中镉和叶中镉的吸收，使得水稻根中镉含量下降87％-93％、茎中镉降低79％-90％，叶中镉降低84％-89％。其中，处理1对重金属镉的吸收率最低，效果最好。处理5-处理9中均仅施用本发明提供的微生物菌剂中一种菌株的发酵液，由表1数据可知除处理5外，单施其中某一种菌株的发酵液对土壤有机质含量无显著影响，说明本发明的促生水稻与降低水稻对镉吸收的复合菌剂中的各菌种具有良好的协同效果，以一定比例配合施用效果优于单施其中某一种菌的发酵液。
实验例2
本实验例设两个处理，分别是制备例1实验组和空白对照组，将无病稻种30℃下催芽至露白后用制备例1所得的微生物(108cfu·mL-1)浸种30min，以无菌水作对照。
将处理后的稻种分别播种于盆钵中，于植物生长室培养并定期记录株高。在水稻分蘖期测定地上部鲜重和干重(去根植株地上部60℃烘干后质量)和植株高度(植株茎基部至叶片顶端高度)。最终实验数据为三次重复实验结果的平均值。通过灭菌土盆栽试验测定植株的株高、干重等指标。结果如表2所示，
表2灭菌土盆栽试验测定水稻植株的株高、鲜重和干重
如表2所示，微生物菌剂浸种处理后，水稻植株地上部鲜重质量相对未接种的阴性对照组增加123.73％，干重质量相对未接种的阴性对照组增加159.43％，植株高度相对未接种的阴性对照组增加32.90％，这表明本发明提供的微生物菌剂具有促进水稻生长潜力。
Claims (8)
1.一种促生水稻与降镉的微生物菌剂，其特征在于，所述促生水稻与降镉的微生物菌剂包括以数量百分比计的如下成分：格氏利斯特氏菌(Listeria grayi)46％-53％，伯克氏菌(Burkholderia sp.)20％-25％，施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)6％-13％，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)9％-20％，棘孢小单孢菌(Micromonospora echinospora)6％-12％。
2.根据权利要求1所述的一种促生水稻与降镉的微生物菌剂，其特征在于，所述菌剂包括以数量百分比计的如下成分：格氏利斯特氏菌(Listeria grayi)50％，伯克氏菌(Burkholderia sp.)20％，施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)10％，棘孢小单孢菌(Micromonospora echinospora)10％，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)20％。
3.根据权利要求1所述的一种促生水稻与降镉的微生物菌剂，其特征在于，所述格氏利斯特氏菌(Listeria grayi)保藏号为CCTCC AB 97019，所述伯克氏菌(Burkholderia sp.)保藏号为CCTCC AB 209362，所述施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)保藏号为CICCNO.10402，所述棘孢小单孢菌(Micromonospora echinospora)保藏号为CCTCC NO.205694，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)保藏号为CICC AB 10732。
4.一种如权利要求1或2所述的一种促生水稻与降镉的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述格氏利斯特氏菌(Listeria grayi)、所述伯克氏菌(Burkholderia sp.)、所述施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、所述棘孢小单孢菌(Micromonosporaechinospora)、所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株经固体斜面活化后，分别接种于液体培养基中进行扩大培养48-72h，然后分别加入发酵培养基，以葡萄糖作为碳源，牛肉膏作氮源，以氯化钙为无机盐，调节培养基pH值，在30℃，170r/min条件下培养36-60h，按照所述数量百分比将各菌株的发酵液混合即得到所述微生物菌剂。
5.根据权利要求4所述的一种促生水稻与降镉的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，
所述格氏利斯特氏菌的液体培养基的配方为：琼脂2.5g/L，明胶80g/L，葡萄糖10g/L，灭菌脱纤维羊血或兔血6g/L调整pH至7.2-9.6；
所述伯克氏菌的液体培养基的配方为：甘露醇10g/L，硫酸铵2g/L，蛋白胨2g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化钠0.1g/L，硫酸亚铁0.05g/L，硫酸锰0.05g/L，调整pH值至7.0；
所述施氏假单胞菌的液体培养基配方为：胰蛋白胨15g/L，大豆胨5.0g/L，氯化钠5.0g/L，琼脂13g/L，调整pH至7.0；
所述棘孢小单孢菌的液体培养基的配方为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，调整pH至7.0；
所述枯草芽孢杆菌的液体培养基的配方为：牛肉膏10g/L，琼脂2g/L，蛋白胨2g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化钠0.1g/L，硫酸亚铁0.05g/L，硫酸锰0.05g/L，调整pH值至7.0；
将保存在液氮中的菌种冻干粉接种到SMAY平板上，在25±1℃和12L:12D光照条件下培养7d，长满孢子的平板贮藏于-20℃冰箱备用，所有孢子粉的活孢率不低于95％。
6.根据权利要求4所述的一种促生水稻与降镉的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基中包括葡萄糖15-25g/L，牛肉膏3.0-5.0g/L和氯化钙1.0-6.0g/L，调节培养基pH值至6.0-7.0。
7.根据权利要求1或2所述的一种促生水稻与降镉的微生物菌剂的使用方法，其特征在于：所述微生物菌剂在水稻生长的返青期以体积比1:400加入水稻水培盆栽营养液中培养至最高分蘖期。
8.根据权利要求7所述的一种促生水稻与降镉的微生物菌剂的用途，其特征在于：将所述微生物菌剂菌体浓度调整至1×108cfu/mL后使用。
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