CN105670980A - 一种修复重金属污染土壤的微生物菌株及其应用 - Google Patents

一种修复重金属污染土壤的微生物菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物领域，公开了一种修复重金属污染土壤的微生物菌株及其应用。本发明所述微生物菌株保藏编号为CGMCC？No.10843。本发明从受重金属镉污染的土壤中筛选出一株洋葱伯克霍尔德氏菌，其能够将土壤中的可交换态镉钝化显著降低其含量，对镉具有极强的耐受性，对土壤扰动小，具有较强的生物修复功能，同时能够提高土壤脱氢酶的活性，能够应用于修复重金属污染土壤和提高土壤脱氢酶活性以及相关产品的制备中。

Description

一种修复重金属污染土壤的微生物菌株及其应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体的说是涉及一种修复重金属污染土壤的微生物菌株及其应用。
背景技术
由于长期的矿山开采，金属冶炼以及含磷农药的施用，土壤中富集了大量重金属污染物。重金属污染土壤具有隐蔽性，累积性和滞后性，因此不易引起重视。近年来，我国重金属污染土壤问题日益突出，对耕地土壤质量和民生健康安全造成极大威胁。我国环境保护部和国土资源部对全国土壤污染情况的调查结果显示，我国土壤受镉、砷、铅、铬、镍等重金属污染严重，污染场地面积近2万公顷，约占耕地总面积的1/5，其中全国土壤重金属镉的超标率最高，达到了7％。因此，镉污染的治理成为当前土壤污染领域亟待解决的重要问题之一。
重金属镉作为机体生长发育非必需元素，是对植物、动物及人类毒性最强的重金属元素之一。重金属镉经过食物链产生生物放大作用，在较高级的生物体中富集起来，然后通过食物等渠道进入人体。当重金属镉在人体内积累到一定限度，会造成人体急性或慢性中毒，对人体器官特别是肾脏造成很大的危害。
重金属污染土壤的修复方法可分为物理法、化学法以及生物法。物理方法往往工程量大，能耗大；化学方法大多花费高，易造成二次污染；生物法中的植物修复受到较多研究人员的青睐，但植物生长缓慢，修复周期长。目前比较受关注的修复技术大多处于实验室试验阶段，且实验效果也不够理想，在实地修复中，我国并没有很好的成功案例。因此，寻找一种高效节能，经济环保的修复措施至关重要。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种修复重金属污染土壤的微生物菌株及其应用，使得所述微生物菌株对土壤中重金属镉具有较强的钝化作用以及耐受作用，通过钝化作用将镉固定在污染土壤中，降低镉的生物有效性，减少植物对其吸收利用，从而达到修复污染土壤的目的；
本发明的另一个发明目的在于提供一种修复重金属污染土壤的微生物菌株及其应用，使得所述微生物菌株能够提高土壤中，特别是重金属污染的土壤中的土壤脱氢酶活性，改善土壤微生态环境。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明针对现有治理重金属污染土壤的物理化学方法具有一定局限性，实施成本高，并且对土壤破坏严重，易带来其他污染的问题。通过利用功能性微生物菌株的生物钝化作用来实现对污染土壤的原位修复，具有成本低、效果好、操作方便、对土壤扰动小等特点。
本发明利用液相富集法对镉钝化菌株进行了筛选。
液相富集法：称取适量镉污染土壤样品加入到装有LB液体培养基的三角瓶中，加入适量玻璃珠。将三角瓶在28-30℃，150-170rpm下振荡；将土壤混合液转入离心管，取离心后的上清液作为镉钝化微生物的来源。将上述上清液接种到含有镉的LB液体培养基中，在28-30℃，150-170rpm下振荡培养。用无菌吸管吸取1-2mL，移入另一个富集培养三角瓶中。如此转移三次后，分别在LB固体培养基和无机盐固体培养基上进行平板划线，分离单菌落。
将上清液分别稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8，吸取适量涂布于含有50、100、200、300mg/LCd2+的LB固体培养基上，28～30℃培养3-4d。发现在稀释10-4倍数情况下易于该菌落的单独分离，可在300mg/LCd2+浓度下正常生长，培养后取该条件下菌株划线分离。
通过上述方法，本发明筛选出一株微生物菌株，根据天根细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANampbacteriaDNAkit)步骤提取该菌株的DNA用于菌种鉴定。在比对匹配度最高的结果中，菌种的所测得到的16SrDNA序列部分(SEQIDNO:1所示)与洋葱伯克霍尔德氏菌的16SrDNA序列有100％的同源性。可确定菌种为洋葱伯克霍尔德菌，命名为W-10。
所述微生物菌株已于2015年5月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.10843。
在土壤重金属钝化效果评估中，主要是考察土壤可交换态重金属镉的钝化效果，即如果土壤中可交换态镉的含量越低，则土壤中镉的钝化效果越好，植物可利用度越低。加入本发明微生物菌株的活菌体后土壤可交换态镉在7-15d内由46.04mg/kg降到0.78mg/kg，加入灭活菌体后土壤可交换态镉在7-15d内由46.04mg/kg降到11.09mg/kg。同时，本发明所述菌株能够在Cd2+浓度高达300mg/L的培养基中生长，其活菌体和死菌体在水体中对低浓度的Cd2+的去除率可分别达90％和80％以上，对高浓度的Cd2+的去除率可达40％和30％以上。此外，加入本发明所述微生物菌株，土壤中的脱氢酶活性能够得到显著提高。
基于上述技术效果，本发明还提出了保藏编号为CGMCCNo.10843的微生物菌株在修复重金属污染土壤和/或制备重金属污染土壤修复剂中的应用。作为优选，所述重金属为镉。
在具体的应用方面，一种用于修复重金属污染土壤和提高土壤脱氢酶活性，将保藏编号为CGMCCNo.10843的微生物菌株接种于LB液体培养基或无机盐培养基中，培养10-18h，收集菌体加入到含有重金属的污染土壤中，或将菌体灭活后加入到含有重金属的污染土壤中，混合均匀。
作为优选，所述LB液体培养基为0.8-1％蛋白胨，0.5-0.8％酵母粉，1-1.5％氯化钠，pH＝6.8～7.0。
作为优选，所述无机盐培养基为0.1-0.2％KH2PO4，0.1-0.2％K2HPO4，0.05-0.1％NH4NO3，0.05-0.1％MgSO4，0.001-0.002％CaCl2，0.01-0.02％FeSO4·7H2O，pH＝6.8～7.2。
作为优选，所述微生物菌株的接种量为0.5-1％。
同时，一种用于修复重金属污染土壤和提高土壤脱氢酶活性的制剂，包含保藏编号为CGMCCNo.10843的微生物菌株或经过灭活的保藏编号为CGMCCNo.10843的微生物菌株。所述微生物菌株在修复剂中的菌株数量为以0.5-1％接种量接种至LB液体培养基或无机盐培养基中，培养10-18h的菌株数量。
由以上技术方案可知，本发明从受重金属镉污染的土壤中筛选出一株洋葱伯克霍尔德氏菌，其能够将土壤中的可交换态镉钝化显著降低其含量，对镉具有极强的耐受性，对土壤扰动小，具有较强的生物修复功能，同时能够提高土壤脱氢酶的活性，能够应用于修复重金属污染土壤和提高土壤脱氢酶活性以及相关产品的制备中。
生物材料保藏信息说明
W-10，分类命名：洋葱伯克霍尔德氏菌，Burkholderiacepacia，于2015年5月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.10843。
附图说明
图1所示为本发明所述菌株死、活菌体对水相不同浓度重金属镉的钝化能力柱形图；黑色柱形代表活菌体，条纹柱形代表死菌体，纵坐标表示去除率，横坐标表示镉的浓度；
图2所示为本发明微生物菌株处理后土壤脱氢酶活性的变化折线图；其中，纵坐标代表脱氢酶活性，横坐标代表时间。
具体实施方式
本发明实施例公开了一种修复重金属污染土壤的微生物菌株及其应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的微生物菌株和相关应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种修复重金属污染土壤的微生物菌株及其应用进行详细说明。
实施例1：本发明所述微生物菌株的筛选
液相富集法：称取适量镉污染土壤样品加入到装有LB液体培养基的三角瓶中，加入适量玻璃珠。将三角瓶在28-30℃，150-170rpm下振荡；将土壤混合液转入离心管，取离心后的上清液作为镉钝化微生物的来源。将上述上清液接种到含有镉的LB液体培养基中，在28-30℃，150-170rpm下振荡培养。用无菌吸管吸取1-2mL，移入另一个富集培养三角瓶中。如此转移三次后，分别在LB固体培养基和无机盐固体培养基上进行平板划线，分离单菌落。
将上清液分别稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8，吸取适量涂布于含有50、100、200、300mg/LCd2+的LB固体培养基上，28～30℃培养3-4d。发现在稀释10-4倍数情况下易于该菌落的单独分离，可在300mg/LCd2+浓度下正常生长，培养后取该条件下菌株划线分离。通过上述方法，本发明筛选出一株微生物菌株。
实施例2：本发明所述微生物菌株的鉴定
根据天根细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANampbacteriaDNAkit)步骤提取该菌株的DNA用于菌种鉴定。在比对匹配度最高的结果中，菌种的所测得到的16SrDNA序列部分与洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderiacepacia)的16SrDNA序列有100％的同源性，可确定菌种为洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderiacepacia)。
实施例3：本发明所述菌株的镉钝化特性
将分离得到的纯培养菌株接种于LB液体培养基，28-30℃，160-170rpm下振荡培养培养18-20h，其中一组菌体细胞先经121℃下进行灭活处理15min，然后6000-8000rpm低温离心15-20min，收集死菌体，作为死细胞钝化剂；另一组菌体细胞直接3000-5000rpm低温离心20-30min，收集活菌体，并用无菌水洗涤2-3次，作为活细胞钝化剂。分别将两组菌体加入到含镉(50-300mg/LCd2+)水溶液中进行吸附实验，结果如图1所示。根据图1结果可以看出，二者均对镉离子均具有较强的去除能力，但活菌体对镉的吸附能强于死菌体。
实施例4：本发明所述菌株的死、活菌体对土壤中镉形态的影响
将分离得到的纯培养菌株接种于LB液体培养基，28-30℃，160-170rpm下振荡培养培养18-20h，其中一组菌体细胞先经121℃下进行灭活处理15min，然后6000-8000rpm低温离心15-20min，收集死菌体，作为死细胞钝化剂；另一组菌体细胞直接3000-5000rpm低温离心20-30min，收集活菌体，并用无菌水洗涤2-3次，作为活细胞钝化剂。分别将两种钝化剂加入到含重金属镉的过筛风干土壤中，搅拌均匀，20-24℃下放置7-15d，期间保持含水量为20-30％。钝化完成后，用BCR连续提取法提取土壤中各形态的重金属镉，步骤如下：
1.可交换态：准确称取通过100目筛的风干土壤样品1g，加40mL0.1mol/L的HAc，放在恒温振荡器中24±1℃下连续振荡16h，然后3000-5000rpm下离心15-20min。取上清液，用ICP-AES测定Cd2+含量。加入无菌水清洗残余物，振荡20-30min，离心，弃去清洗液。
2.可还原态：向1的残渣中加入40mL0.5mol/L的盐酸羟胺，放在恒温振荡器中22-24℃下连续振荡15-16h，然后3000-5000rpm下离心15-20min。其余步骤同1。
3.可氧化态：向2的残渣中加入10mLH2O2，搅拌均匀，室温下静置1h左右后用水浴加热保持80-85℃1h左右，再加入10mLH2O2，在恒温水浴箱中加热保持80-85℃1h左右。冷却后，加入50mL1mol/L的NH4Ac，放在恒温振动器中22-24℃下连续震荡16h，然后3000-5000rpm下离心15-20min。其余步骤同1。
4.残渣态：向3的残渣中加入10mLHNO3，使酸和样品充分混合均匀。进行微波消解。重金属镉各形态的含量见表1。
表1.经死、活菌剂处理后的土壤中重金属镉形态变化
表1给出了经死、活菌剂处理后的土壤中重金属镉形态变化，可以看出死、活钝化剂均能够有效地将可交换态的镉转化成为更稳定的可还原态、可氧化态和残渣态。并且，活细胞钝化剂的效果优于死细胞钝化剂，这与水相钝化结果相一致。
实施例5：本发明所述菌株对土壤脱氢酶活性的影响
将分离得到的纯培养菌株接种于LB液体培养基，28-30℃，160-170rpm下振荡培养培养18-20h，取5-10ml新鲜菌液加入到含有重金属镉的土壤中，混合均匀，监测1-10d土壤脱氢酶活性的变化。称取1g经菌株处理过的镉污染土壤样品于15mL离心管中，向离心管中加入2mL0.1mol/L葡萄糖溶液和2mL0.5％的TTC溶液，混合均匀后于37℃，100rpm条件下避光培养16h。然后加入1mL甲醛终止反应再加入5mL丙酮，充分震荡，使附着在土壤颗粒上的产物TPF洗脱下来。最后静置3min，使用有机滤膜过滤上清液，在485nm下测量滤液的吸光度值，作为脱氢酶活的评价。土壤脱氢酶活性见图2。
图2为本发明所述菌株对土壤脱氢酶活性的影响，经菌株处理后的土壤脱氢酶活性与空白对照组相比有显著的提高，说明所述微生物菌株能够对土壤微生态起到良好的促进作用。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (9)

1.一种修复重金属污染土壤的微生物菌株，其特征在于，保藏编号为CGMCCNo.10843。
2.保藏编号为CGMCCNo.10843的微生物菌株在修复重金属污染土壤和/或制备重金属污染土壤修复剂中的应用。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述重金属为重金属镉。
4.保藏编号为CGMCCNo.10843的微生物菌株在提高土壤中脱氢酶活性和/或制备提高土壤脱氢酶活性制剂中的应用。
5.一种用于修复重金属污染土壤和提高土壤脱氢酶活性，其特征在于，将保藏编号为CGMCCNo.10843的微生物菌株接种于LB液体培养基或无机盐培养基中，培养10-18h，收集菌体加入到含有重金属的污染土壤中，或将菌体灭活后加入到含有重金属的污染土壤中，混合均匀。
6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述LB液体培养基为0.8-1％蛋白胨，0.5-0.8％酵母粉，1-1.5％氯化钠，pH＝6.8～7.0。
7.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述无机盐培养基为0.1-0.2％KH2PO4，0.1-0.2％K2HPO4，0.05-0.1％NH4NO3，0.05-0.1％MgSO4，0.001-0.002％CaCl2，0.01-0.02％FeSO4·7H2O，pH＝6.8～7.2。
8.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述微生物菌株的接种量为0.5％-1％。
9.一种用于修复重金属污染土壤和提高土壤脱氢酶活性的制剂，其特征在于，包含保藏编号为CGMCCNo.10843的微生物菌株或经过灭活的保藏编号为CGMCCNo.10843的微生物菌株。
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