CN103436464A

CN103436464A - 一株耐低温石油降解芽孢杆菌、培养方法及其应用

Info

Publication number: CN103436464A
Application number: CN2013102866663A
Authority: CN
Inventors: 王红旗; 花菲; 赵一村
Original assignee: Beijing Normal University
Current assignee: Beijing Normal University
Priority date: 2013-07-09
Filing date: 2013-07-09
Publication date: 2013-12-11
Anticipated expiration: 2033-07-09
Also published as: CN103436464B

Abstract

本发明涉及耐低温石油降解菌株、培养方法、及其应用。本发明的耐低温菌芽孢杆菌的培养方法包括：将石油污染土样利用生理盐水溶解，摇床振荡后静置分层，将菌悬液接入原油无机盐液体培养基中，摇床培养后取液体培养基中适量下层发酵液，接种至新鲜无机盐液体培养基中继续培养，如此反复进行5次。对所得菌液进行梯度稀释，涂布至原油无机盐固体培养基上培养，观察培养基菌落数量，选择数量适中的培养基，进行划线培养；反复驯化、划线培养，直至得到多株纯菌。本发明的耐低温菌芽孢杆菌优先降解原油组分中的中长链饱和烷烃，该菌可应用于石油烃降解和土壤或水体石油污染的生物修复中，尤其可用于低温环境。

Description

一株耐低温石油降解芽孢杆菌、培养方法及其应用

技术领域

本发明属于环境污染物生物处理技术领域，具体涉及在低温环境下降解石油烃的菌株、其培养方法，以及其在土壤环境污染修复中的应用。

背景技术

石油是一种粘稠易燃的、颜色从黄到黑的气态、液态和固态碳氢化合物的混合物，天然条件下存在于地表之下，含有多种烃类（正烷烃、支链烷烃、芳烃、脂环烃）及少量其他有机物（硫化物、氮化物、环烷酸类等）的复杂混合物。作为目前世界上最重要的一次能源之一，同时也是许多化学工业产品如化肥、杀虫剂、塑料等的原料，石油具有非常重要的战略地位以及庞大的消耗量，世界各国都十分重视石油的开采和使用。目前，世界上石油开采主要分为陆地开采和海洋开采，其中陆地开采产量约占全球开采量的70%以上。我国已经找到的油气田大约500多个，同时已经开发了包括克拉玛依、大庆、胜利、华北、辽河、中原等一系列大的油田。大规模开采的同时也引发了诸多的环境污染问题。石油进入土壤，不但破坏土壤生态系统的结构和功能，降低土壤质量，还可以附着在植物的根系表面，影响作物的根系生长。此外，石油烃污染物可随地面降水渗透到地下水，进而污染浅层地下水环境，影响饮用水的水质。而且石油中所含的多环芳烃物质具有致癌、致畸、致突变等作用，能通过食物链在动植物体内逐级富集，严重威胁到农作物的质量和人类健康。

诸多研究表明，土壤环境中的天然微生物种群对石油烃的降解作用是石油烃类污染物从土壤环境中消除的基本途径之一。与物理、化学等修复技术相比，生物修复技术具有安全、高效、生态友好和经济等特点。微生物利用自我调控机制以及对污染物的综合净化功能处理土壤中的石油烃类污染物，使这些污染物在微生物的新陈代谢过程中得到较为彻底的转化和降解，如转化成毒性较低的物质或CO₂和水，不会产生二次污染，是应用前景最为乐观的土壤石油污染物处理方法。

但是，以往的研究多集中在利用常温或高温微生物进行环境污染生物治理，对于低温环境的研究较少。在高山、高纬地区，尤其是我国北方的油田地区，气候寒冷的条件下微生物存活率较低、自然降解能力较差，严重影响了石油污染地区土壤质量。近年来，低温环境对有机污染物的影响的研究越来越受到环境微生物学者的重视。有研究表明在北极、南极和高山冻土地区的土壤中存在大量耐冷的或嗜冷的土著石油烃降解微生物。此外，在石油污染的盐碱土壤中也存在一些耐盐的石油烃降解菌。这些嗜冷菌、嗜热菌或者耐盐微生物为特殊条件下的石油污染修复提供了种质资源。常见的低温石油降解菌主要有假单胞菌属（Pseudoalteromonas）、诺卡氏菌属（Nocardia）、恶臭假单胞菌属（Pseudomonas putida）、沙门氏菌属（Salmonella）、变形菌门（Proteobacteria）等。这些菌能在低温环境中发挥对石油烃类物质的生物利用。因此，筛选低温环境条件下优势石油降解菌株将为建立适合低温环境石油污染土壤的生物治理技术提供重要技术支撑。

发明内容

本发明的目的是针对上述现有低温条件下利用微生物修复石油烃污染土壤存在的难题，提供能高效降解石油的土壤微生物。

本发明所提供的高效降解菌来源于天津大港油田附近石油污染的土壤，经人工驯化、分离纯化得到。

本发明提供的一种菌株Bacillus sp.DG24，属于革兰氏染色阳性蜡状芽孢杆菌，菌落呈红棕色，不透明，菌落直径大约1.5mm（24h），菌株16SrDNA的GenBank登录号为JN216879，该菌株于2011年7月11日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；邮政编码：100101）保藏，保藏编号为CGMCC No.5051，分类学命名为芽孢杆菌（Bacillus sp.），属于革兰氏染色阳性菌。

本发明还涉及Bacillus sp.DG24的培养方法，即驯化及纯化方法，包括以下步骤：

（1）将石油污染土样利用生理盐水溶解，摇床振荡后静置分层，将菌悬液接入原油无机盐液体培养基中，在10-15℃摇床培养10-15天，后取液体培养基中适量下层发酵液接种至新鲜原油无机盐液体培养基中继续培养10-15 天，如此反复进行3-5次。

（2）吸取定量步骤（1）所得原油无机盐液体培养基中发酵液，进行梯度稀释，分别均匀涂布至原油无机盐固体培养基上，培养8-15天，观察培养基菌落数量，选择数量适中的培养基，进行划线培养。

（3）反复驯化、划线培养，直至得到多株纯菌。

优选地，步骤（1）所用原油无机盐液体培养基，每1000ml培养基液体中含：0.4g Na₂HPO₄，0.15g KH₂PO₄，0.1gNH₄Cl，0.05g MgSO₄·7H₂O，0.0015g CaCl₂，0.1g NaNO₃，0.001g FeSO₄·7H₂O，1mL微量元素，其中微量元素由每100mL纯水中加入0.5mg CuSO₄·5H₂O,1.0mg H₃BO₃,1.0mg MnSO₄·5H₂O,7.0mg ZnSO₄配制得到，其中，1000ml培养基液体还包括0.5～2g灭菌原油，优选1g。

优选地，步骤（2）所用原油无机盐固体培养基由下述方法得到：在每1000ml由0.4g Na₂HPO₄，0.15g KH₂PO₄，0.1gNH₄Cl，0.05g MgSO₄·7H₂O，0.0015g CaCl₂，0.1g NaNO₃，0.001g FeSO₄·7H₂O，1mL微量元素组成的培养基液体中，其中微量元素由每100mL纯水中加入0.5mg CuSO₄·5H₂O,1.0mg H₃BO₃,1.0mg MnSO₄·5H₂O,7.0mg ZnSO₄配制得到，另外加入15～20g琼脂，再在培养基表面均匀涂20～30μl灭菌原油。

优选地，Bacillus sp.DG24的培养方法还包括保存步骤，具体为：将含Bacillus sp.DG24菌体的乳化原油无机盐液体培养基，置于4℃条件下保存，每隔40-50天吸取该乳化原油液体培养基下层水相10-20ml接入新鲜已灭菌且还没有加入降解菌的原油液体培养基中按驯化方法进行操作，10-15天后将发生乳化现象的原油液体培养基置于4℃条件下再次保存；所述乳化原油液体培养基通过下述方法得到：用灭菌接种环挑取反复驯化纯化后在原油无机盐固体培养基中划线培养的Bacillus sp.DG24菌落接入原油无机盐液体培养基中，放于培养箱中10℃培养。

优选地，Bacillus sp.DG24的培养方法的保存步骤之后，还包括富集培养步骤，具体为：吸取上述保存步骤的置于4℃条件下保存的含Bacillus sp.DG24菌体的乳化原油无机盐液体培养基（乳化原油液体培养基）水相液体50-100μl接入LB液体培养基中，于10℃条件下置于摇床中培养，在无菌操作台中将含有DG24菌体的LB液体培养基转移至已灭菌离心管中，离心收集菌体，并用灭菌无机盐液体培养基清洗菌体，将菌体重悬于无机盐液体培养基中置于4℃条件下待用。

本发明还涉及Bacillus sp.DG24菌在降解原油中的应用，优选在10-30℃温度下进行降解;在10℃条件下，降解环境的其他条件优选为：pH6.0-8.0，以NaCl计的盐度为0.5-1.5%，原油和磷元素质量比W(原油):W(P)为10:1～40:1，原油和氮元素质量比W(原油):W(N)为5:1～20:1，原油的浓度为100～2000mg·L^-1，优选100～800mg·L^-1。

Bacillus sp.DG24菌用于降解原油中的石油烃，所述石油烃优选为饱和烷烃，更优选中长链饱和烷烃，碳原子数在十二到二十八范围内的饱和烷烃，更优选中链饱和烷烃，进一步优选正十二烷、正十四烷、正十六烷、正十八烷或正十九烷，最优选正十二烷和正十四烷。

Bacillus sp.DG24菌在降解原油的应用中，原油的浓度为100～2000mg·L^-1时，石油烃的降解速率范围为1.76～20.78mg·L^-1·d^-1。

本发明还涉及Bacillus sp.DG24菌在土壤或水体石油污染的生物修复中的应用，优选地，在10-30℃温度下进行修复。

优选地，在10℃条件下，土壤中石油污染的生物修复的条件为：原油的浓度为3000～30000mg·kg^-1。

优选地，在10℃条件下，土壤中石油污染的生物修复时，原油的浓度为3000～30000mg·kg^-1时，石油烃的降解率可达15.18%～50.52%，降解速率达到0.018～0.055g·kg^-1·d^-1。

Bacillus sp.DG24能利用石油作为唯一碳源和能源生长繁殖，不但可以将石油乳化，而且大量降解其中的饱和烷烃组分。经35天培养，原油培养基中的原油被乳化完全，溶液呈深棕色，且菌液浓稠。同样条件下，常温菌的降解率不足10%，而上述菌的石油烃降解率最高达到50%。

与现有技术相比，本技术发明涉及的Bacillus sp.DG24可以应用于低温及常温环境石油污染土壤中，且有较好的活性及降解性能。在未投加任何表面活性剂的土壤中，10℃低温条件下，经过80天，Bacillus sp.DG24对污染浓度为28.86g·kg^-1土壤中的石油烃的降解率为15.18%。与已有的菌株相比，该菌具有较高的适应能力，范围较宽的生长温度，高效的降解能力，且对于石油烃中的烷烃组分有较的优先生物利用性。从环境保护与修复角度而言，Bacillus sp.DG24对于低温环境中土壤石油污染的治理具有重大价值，为低温环境降解菌的研究工作提供支持。

附图说明

图1-a为试验例4Bacillus sp.DG24在10℃条件下对土壤中石油烃的生物降解率；

图1-b为试验例4Bacillus sp.DG24在25℃条件下对土壤中石油烃的生物降解率；

图2为试验例5Bacillus sp.DG24在10℃条件下优先降解的原油组分的GC-MS图谱；

图3为试验例6Bacillus sp.DG24在10℃条件下对不同饱和烷烃的生物降解率。

具体实施方式

材料准备：

土壤：2010年4月20日花菲、宁少尉采自天津大港油田油井附近受污染土壤。

原油无机盐液体培养基：

无机盐（10×）液体培养基母液（超纯水溶液）：4g Na₂HPO₄，1.5g KH₂PO₄，1gNH₄Cl，0.5g MgSO₄·7H₂O，0.015g CaCl₂，1g NaNO₃，0.01g FeSO₄·7H₂O，超纯水定容至1000ml；

无机盐液体培养基：无机盐液体培养基母液（10×）100ml，另加入微量元素1ml（100ml纯水中加入0.5mg CuSO₄·5H₂O,1.0mg H₃BO₃,1.0mg MnSO₄·5H₂O,7.0mg ZnSO₄配制得到），以超纯水定容至1000ml，利用0.2M氢氧化钠或者0.1M盐酸调节pH=7.0-7.2；

原油无机盐液体培养基：无机盐液体培养基1000ml，加入0.5～2g灭菌原油，优选1g。

原油无机盐固体培养基：

原油无机盐液体培养基1000ml，加入琼脂15～20g，在固体培养基表面均匀涂20～30μl灭菌原油。

试验方法及应用方法：

Bacillus sp.DG24的培养方法：

（1）驯化步骤

传统的菌的培养方法是直接将菌液与液体培养基混合继续培养，本发明的继续培养使用的是下层含有菌体的发酵液，具体的，将石油污染土样利用生理盐水溶解，一般每1g土壤用10ml生理盐水（0.9%NaCl）溶解，摇床振荡后静置分层，将菌悬液接入新配制的原油无机盐液体培养基中，在10-15℃摇床培养10-15天，后取下层含有菌体的发酵液，一般取5-10ml，转移至新配制的原油无机盐液体培养基中继续培养8-15天，如此反复进行3-5次，得到菌液。将最后一次驯化的原油无机盐液体培养基置于4℃保存待用，其水相发酵液中包含能降解原油的混合微生物菌群。

另外，在转接菌悬液或每次转接发酵液之前，在新配制的无机盐液体培养基中加入灭菌原油作为微生物生长的碳源，以制成原油无机盐液体培养基。该灭菌原油的量每次控制在0.5-2g，优选加入1g，即原油无机盐液体培养基的原油浓度控制500-2000mg·L^-1比较有利于菌的生长。在转接过程中使用新配制的原油无机盐液体培养基主要是为了保持环境的无菌性，以及确保培养基的成分稳定。

（2）分离纯化步骤

定量吸取步骤（1）所得发酵液进行梯度稀释，例如，稀释梯度依次为10^-3、10^-6、10^-9，一般取50～100ul，涂布至原油无机盐固体培养基上，在10℃恒温培养箱中培养8-15天后，进行划线培养，待长出菌落后，观察培养基菌落数量，选择菌落数量适中的培养基，用接种环挑取单菌落于原油无机盐固体培养基中划线培养。

（3）反复驯化、划线培养

反复驯化、划线培养，一般驯化3-5次，直至得到多株纯菌。

步骤（3）之后，还可包括保存步骤，具体为：将含Bacillus sp.DG24菌体的乳化原油无机盐液体培养基，置于4℃条件下保存，每隔40-50天吸取乳化原油液体培养基下层水相10-20ml接入新鲜已灭菌且还没有加入降解菌的原油无机盐液体培养基中按驯化方法进行操作，10-15天后将发生乳化现象的原油液体培养基置于4℃条件下再次保存；所述乳化原油液体培养基通过下述方法得到：用灭菌接种环挑取反复驯化纯化后的在原油无机盐固体培养基中划线培养的Bacillus sp.DG24菌落接入原油无机盐液体培养基中，放于培养箱中10℃培养，一般培养15天。

保存步骤之后，还可包括富集培养步骤，具体为：吸取上述保存步骤所得的保存在4℃条件下的乳化原油液体培养基下层水相液体50-100μl接入LB液体培养基中，于10℃条件下置于摇床中培养，摇床条件为150r/min，一般培养2d，这样保证Bacillus sp.DG24进入对数生长期，且生物量达到最大，在无菌操作台中将含有Bacillus sp.DG24菌体的LB液体培养基转移至已灭菌离心管中，离心收集菌体，并用灭菌无机盐液体培养基清洗菌体，将菌体重悬于无机盐液体培养基中，优选菌体密度控制在A₆₀₀为1.5-2.0，置于4℃条件下待用；所述乳化原油液体培养基通过下述方法得到：用灭菌接种环挑取反复驯化纯化后在原油无机盐固体培养基中划线培养的Bacillus sp.DG24菌落接入原油无机盐液体培养基中，放于培养箱中10℃培养，一般培养15天。

用于驯化培养Bacillus sp.DG24菌的原油无机盐液体培养基：

本发明涉及的原油无机盐液体培养基，每1000ml培养基液体中含：0.4g Na₂HPO₄，0.15g KH₂PO₄，0.1gNH₄Cl，0.05g MgSO₄·7H₂O，0.0015g CaCl₂，0.1g NaNO₃，0.001g FeSO₄·7H₂O，1mL微量元素，其中微量元素每100mL纯水中加入0.5mg CuSO₄·5H₂O,1.0mg H₃BO₃,1.0mg MnSO₄·5H₂O,7.0mg ZnSO₄配制得到，其中，1000ml培养基液体还包括0.5～2g灭菌原油，优选1g。

用于驯化培养Bacillus sp.DG24菌的原油无机盐固体培养基：

本发明涉及的原油无机盐固体培养基由下述方法得到：在每1000ml由0.4g Na₂HPO₄，0.15g KH₂PO₄，0.1gNH₄Cl，0.05g MgSO₄·7H₂O，0.0015g CaCl₂，0.1g NaNO₃，0.001g FeSO₄·7H₂O，1mL微量元素组成的培养基液体中，其中微量元素由每100mL纯水中加入0.5mg CuSO₄·5H₂O,1.0mg H₃BO₃,1.0mg MnSO₄·5H₂O,7.0mg ZnSO₄配制得到，另外加入15～20g琼脂，再在培养基表面均匀涂20～30μl灭菌原油。

Bacillus sp.DG24菌的保存方法：

本发明提供了高效原油降解菌Bacillus sp.DG24的保存方法。常见的微生物保存方法多将微生物保存在固体或斜面半固体培养基中。此外，大量文献表明石油烃降解菌的降解特性与菌体内质粒上的基因片段有关，在实验中发现长期将Bacillus sp.DG24保存在碳源为非石油烃的培养基中，如LB培养基，该菌体对原油的降解性会大大降低，为保持Bacillus sp.DG24对原油的持续高效降解性，本发明中将Bacillus sp.DG24保存在乳化原油液体培养基中。乳化原油液体培养基为在原油高效降解菌作用下发生乳化现象的原油液体培养基，通过用灭菌接种环挑取反复驯化纯化后在原油固体培养基中划线培养的Bacillus sp.DG24菌落，接入原油无机盐液体培养基中，放于培养箱中10℃培养15天获得。此时培养基水相呈棕色，原油发生乳化现象，并有大小不等的原油油滴分散在水相中，将上述含Bacillus sp.DG24菌体的乳化原油无机盐液体培养基，置于4℃条件下保存，其中下层水相发酵液中含有Bacillus sp.DG24单菌种，进行Bacillus sp.DG24富集培养时可从此原油无机盐液体培养基中吸取适量发酵液作为接种液。

Bacillus sp.DG24的保存方法的具体操作为：将乳化原油无机盐液体培养基（含Bacillus sp.DG24菌体）置于4℃条件下保存，每隔40-50天，优选45天吸取该乳化原油液体培养基下层水相10-20ml接入新鲜已灭菌的原油液体培养基中按驯化方法进行操作，10-15天后将发生乳化现象的原油液体培养基置于4℃条件下再次保存。每次转接过程中Bacillus sp.DG24的保存周期为40-50天，优选45天。这种保存方法操作方便，同时也保证了Bacillus sp.DG24对原油的高效降解性。

Bacillus sp.DG24菌的富集培养方法：

本发明还提供了一种快速便捷的原油降解菌Bacillus sp.DG24的富集培养方法。在实验过程中发现在接种量及其它实验条件相同时，原油液体培养中Bacillus sp.DG24的生物量远低于LB液体培养中该菌的生长量，为满足批量实验对菌体的需求，需要研发一种既能保持Bacillus sp.DG24高效原油降解性又能同时获得大量菌体的富集培养方法。具体操作为：每次实验前吸取4℃ 保存的乳化原油液体培养基或直接从培养好的乳化原油液体培养基下层水相液体50-100μl接入LB液体培养基中，于10℃条件下置于摇床中培养，一般摇床条件设为150r/min，培养2d后，这样保证Bacillus sp.DG24进入对数生长期，且生物量达到最大，离心收集菌体，并用灭菌无机盐液体培养基清洗菌体，一般清洗3-5遍后，将菌体重悬于无机盐液体培养基中，菌体密度控制在A₆₀₀为1.5-2.0，置于4℃条件下待用。

Bacillus sp.DG24菌在降解原油中的应用：

本发明还涉及Bacillus sp.DG24在降解原油中的应用，最佳降解温度为10-30℃；另外，在低温条件下降解原油的应用中，优选在10℃条件下进行降解。

在10℃条件下对原油降解的最佳环境条件为：pH6.0-8.0；盐度（NaCl）0.5-1.5%；原油与磷元素质量比W(原油):W(P)为10:1～40:1；原油与氮元素质量比W(原油):W(N)为5:1～20:1，原油的浓度为100～2000mg·L^-1，优选100～800mg·L^-1。

在降解原油的应用中，原油浓度为100～2000mg·L^-1时，石油烃的降解速率范围可达到为1.76～20.78mg·L^-1·d^-1。

Bacillus sp.DG24在降解原油中的应用，降解原油中的石油烃，优选饱和烷烃组分，优选中长链的饱和烷烃组分，优选碳原子数为十二至二十八范围内的饱和烷烃，例如正十二烷至正二十八烷范围内的饱和烷烃，进一步优选中链饱和烷烃，如正十二烷、正十四烷、正十六烷、正十八烷、正十九烷，最优选正十二烷和正十四烷。

Bacillus sp.DG24菌在石油污染生物修复的应用：

Bacillus sp.DG24对水体或土壤石油污染生物修复中的应用，该修复应用优选在10-30℃条件下，在25℃效果最佳，然而10℃也能达到令人满意的效果。

10℃条件下，在土壤石油污染生物修复中能被降解的原油的浓度为3000～30000mg·kg^-1，此时石油烃降解率为15.18%～50.52%，降解速率达到0018～0.055g·kg^-1·d^-1。

以下结合具体实施例来对本发明做进一步说明。

实施例

实施例1Bacillus sp.DG24的分离与驯化

现场采集天津大港油田油井附近受污染土壤，以原油为唯一碳源，采用无机盐液体培养基母液经无菌水稀释定容，添加原油而成。

无机盐液体培养基：无机盐液体培养基母液（10×）100ml，另加入微量元素1ml（100ml纯水加入0.5mg CuSO₄·5H₂O,1.0mg H₃BO₃,1.0mg MnSO₄·5H₂O,7.0mg ZnSO₄配制得到），以超纯水定容至1000ml，利用0.2M氢氧化钠或者0.1M盐酸调节pH=7.0；

原油无机盐含液体培养基：无机盐液体培养基1000ml，1g灭菌原油。

原油无机盐含油废水固体培养基成分为：原油无机盐液体培养基1000ml，加入琼脂15g，固体培养基表面均匀涂30μl灭菌原油。

本发明专利申请书中“菌液”指驯化过程中，石油污染土样加入到生理盐水中振荡一定时间，静置后的上清液，包含土壤中的微生物。“发酵液”是指将Bacillus sp.DG24加入到原油无机盐液体培养基中，对发生乳化现象的水相液体的称呼。

驯化步骤：在灭菌100ml三角瓶中加入灭菌生理盐水100ml，然后加入1g的石油污染土样，于10℃，在150r/min条件下置于摇床中振荡约4h，取出三角瓶静置分层后，吸取1ml菌悬液接入装有100mL“原油无机盐液体培养基”的250mL锥形瓶中，每种液体培养基做三个重复。10℃，在150r/min条件下置于摇床中培养15d；然后取5ml的上述培养基中的发酵液接入装有100mL相应原油液体培养基的250mL三角瓶中，同等温度条件下继续培养15d，连续重复5次同等实验。

分离与纯化步骤：第5次驯化后的“原油无机盐液体培养基”水相发酵液进行梯度稀释（10^-3、10^-6、10^-9），分别吸取50ul发酵液涂布至相应的原油固体驯化培养基上，用进口封口膜将培养皿封闭后，培养皿倒置（培养基成分朝上）放于培养箱中10℃培养15天。培养后得到数量不同的菌落平板，选取浓度均匀、可分辨的平板，即稀释梯度为10^-6的平板，用接种环沾取平板上的菌落（多种）溶解于灭菌水中，再吸取适量菌悬液划线至原油无机盐固体培养基中。用进口封口膜将培养皿封闭后，培养皿倒置（培养基成分朝上）放于培养箱中10℃培养15天后，得到多种单一纯菌落。

分别将得到的多种单一纯菌落再经过5代原油无机盐液体培养基驯化，在原油无机盐固体培养基中划线培养，得到多株纯菌，将纯菌经接种至原油无机盐液体培养基中验证其降解石油的能力。最终得到了一株高效石油降解菌，Bacillus sp.DG24，该菌属于蜡状芽孢杆菌。

本实施例表明分离所得的Bacillus sp.DG24可在低温环境下利用石油作为唯一碳源和能源进行生长繁殖。

实施例2Bacillus sp.DG24的保存及富集培养方法

试验例2-1原油降解菌Bacillus sp.DG24的保存方法

原油无机盐液体培养基组分：每1000ml含0.4g Na₂HPO₄，0.15g KH₂PO₄，0.1gNH₄Cl，0.05g MgSO₄·7H₂O，0.0015g CaCl₂，0.1g NaNO₃，0.001g FeSO₄·7H₂O，微量元素1ml（100ml纯水中加入0.5mg CuSO₄·5H₂O,1.0mg H₃BO₃,1.0mg MnSO₄·5H₂O,7.0mg ZnSO₄配制得到），超纯水定容至1000ml，用2mol·L^-1HCl或2mol·L^-1NaOH调节无机盐液体培养基的pH为7.0，1g灭菌原油。

乳化原油液体培养基：用灭菌接种环挑取纯化又反复驯化5次的在原油无机盐固体培养基中划线培养的Bacillus sp.DG24菌落接入原油无机盐液体培养基中，放于培养箱中10℃培养15天，此时培养基水相呈棕色，原油发生乳化现象，并有大小不等的原油油滴分散在水相中，将发生乳化现象的原油液体培养基称之为乳化原油液体培养基。

将上述已发生乳化现象的原油液体培养基（含Bacillus sp.DG24菌体）置于4℃条件下保存，每隔45天吸取乳化原油液体培养基下层水相10ml接入新鲜已灭菌且还没有加入降解菌的原油液体培养基中按驯化方法进行操作，15天后将发生乳化现象的原油液体培养基置于4℃条件下再次保存。

试验例2-2原油降解菌Bacillus sp.DG24的富集培养方法

LB液体培养基：酵母浸粉5g，蛋白胨10g，NaCl5g，蒸馏水定容至1000ml，pH7.0。

吸取在上述保存步骤中保存在4℃条件下的乳化原油液体培养基下层水相液体50μl接入LB液体培养基中，于10℃、150r/min条件下置于摇床中培养2d。之后，在无菌操作台中将含有DG24菌体的LB液体培养基转移至已灭菌离心管中，离心收集菌体，并用灭菌无机盐液体培养基清洗菌体5遍后，将菌体重悬于无机盐液体培养基中，菌体密度控制在A₆₀₀为1.6，置于4℃条件下待用。

实施例3Bacillus sp.DG24对原油降解的最适环境条件

通过设置不同盐度、不同pH、不同的温度，确定Bacillus sp.DG24降解原油的最适环境条件。

试验例3-1盐度对Bacillus sp.DG24降解原油的影响

LB液体培养基：酵母浸粉5g，蛋白胨10g，NaCl5g，蒸馏水定容至1000ml，pH7.0～7.2。

原油储备液（20000mg·L^-1）：在150ml磨口三角瓶中加入2g原油，之后定量加入100ml色谱级二氯甲烷，并用封口膜密封瓶口，缓慢摇匀后置于4℃冰箱待用。

NaCl标准储备液（30%NaCl）：在盛有100ml无菌水的250ml三角瓶中加入30g NaCl，用玻璃棒搅拌均匀后待用。

无机盐液体培养基成分：0.4g Na₂HPO₄，0.15g KH₂PO₄，0.1gNH₄Cl，0.05g MgSO₄·7H₂O，0.0015g CaCl₂，0.1g NaNO₃，0.001g FeSO₄·7H₂O，微量元素1ml（100ml纯水加入0.5mg CuSO₄·5H₂O,1.0mg H₃BO₃,1.0mg MnSO₄·5H₂O,7.0mg ZnSO₄配得），超纯水定容至1000ml，用2mol·L^-1HCl或2mol·L^-1NaOH调节无机盐液体培养基的pH为7.0。

从乳化原油液体培养基中吸取10ml下层水相液体（含Bacillus sp.DG24菌体）接入灭菌的含250mlLB培养基的500ml三角瓶中，于10℃，在150r/min条件下置于摇床中培养48h后，Bacillus sp.DG24的生长进入对数生长期。在无菌操作台中将含有Bacillus sp.DG24菌体的LB培养基转移至灭菌离心管中离心分离收集菌体，用灭菌无机盐培养基清洗菌体3遍后，将菌体重悬于灭菌无机盐液体培养基中，菌体密度控制在A₆₀₀为1.6，置于4℃冰箱待用。

分别在一系列250mL三角瓶中加入0、2.5、5、12.5、25mLNaCl标准储备液，用无机盐液体培养基定容至150ml，控制培养基盐度分别为0%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、5%。121℃高温灭菌30min，冷却后在含有150mL无机盐液体培养基的三角瓶中加入用微孔滤膜过滤的原油标准储备液，初始原油浓度控制在2000mg·L^-1。待二氯甲烷挥发后，按照5%(v/v)的接种量加入前述灭菌无机盐液体培养基重悬的菌体DG24，初始菌体密度A₆₀₀为0.13。将培养基于10℃，在150r/min条件下置于摇床中培养35d后，用二氯甲烷:丙酮为3:1的有机溶剂萃取原油，并用重量法分析石油烃降解率。

石油烃降解率的测定方法采用重量法，具体而言，石油烃的测量方法为：用二氯甲烷:丙酮为3:1的有机溶剂萃取溶液中的石油烃，多次萃取且每次加入50ml萃取剂，萃取液置于已知重量的恒重烧杯，吹干后重量法测定总石油烃（TPH）含量（G总），石油烃降解率即（G_空白-G_总）/G_空。

如表1所示，本试验例表明，培养基盐度分别为0%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、5%时，Bacillus sp.DG24对石油烃的生物降解率分别为20.58±2.72%、33.63±3.28%、45.55±2.58%、42.75±4.25%、21.24±3.82%、12.57±2.64%、6.36±4.11%和0%。Bacillus sp.DG24在低盐度条件下可发挥对原油的生物利用作用，而在高盐度环境中，其对石油烃类物质的生物利用作用受到限制，最适盐度条件为0.5-1.5%。

表1不同盐度下Bacillus sp.DG24对石油烃的降解率

试验例3-2pH对Bacillus sp.DG24降解原油的影响

无机盐液体培养基成分：0.4g Na₂HPO₄，0.15g KH₂PO₄，0.1gNH₄Cl，0.05g MgSO₄·7H₂O，0.0015g CaCl₂，0.1g NaNO₃，0.001g FeSO₄·7H₂O，微量元素1ml（100ml纯水中加入0.5mg CuSO₄·5H₂O,1.0mg H₃BO₃,1.0mg MnSO₄·5H₂O,7.0mg ZnSO₄配制得到），超纯水定容至1000ml。

从乳化原油液体培养基中吸取10ml下层水相液体（含Bacillus sp.DG24菌体）接入灭菌的含250mlLB培养基的500ml三角瓶中，于10℃，在150r/min条件下置于摇床中培养48h后，Bacillus sp.DG24的生长进入对数生长期。在无菌操作台中将含有Bacillus sp.DG24菌体的LB培养基转移至灭菌离心管中离心分离收集菌体，用灭菌无机盐液体培养基清洗菌体3遍后，将菌体重悬于灭菌无机盐液体培养基中，菌体密度控制在A₆₀₀为1.6，置于4℃冰箱待用。

分别在一系列250mL三角瓶中加入150ml无机盐液体培养基，分别用2mol·L^-1HCl和2mol·L^-1NaOH调节无机盐液体培养基的pH分别为4、5、6、7、8、9、10，并于121℃高温灭菌30min，冷却后在含有150mL无机盐液体培养基的三角瓶中加入用微孔滤膜过滤的原油标准储备液，初始原油浓度控制在2000mg·L^-1。待二氯甲烷挥发后，按照5%(v/v)的接种量加入前述灭菌无机盐液体培养基重悬的菌体DG24，初始菌体密度A₆₀₀为0.15。将培养基于10℃，在150r/min条件下置于摇床中培养35d后，用二氯甲烷:丙酮为3:1的有机溶剂萃取原油，并用重量法分析石油烃降解率。

如表2所示，本试验例表明，培养基盐度pH分别为4、5、6、7、8、9、10时，Bacillus sp.DG24对石油烃的生物降解率分别为12.22±2.15%、23.73±3.86%、44.64±4.54%、53.58±4.36%、58.17±6.21%、26.46±2.67%和7.36±2.15%。Bacillus sp.DG24对石油烃类物质的生物利用最适pH条件为6-8。

表2不同pH下Bacillus sp.DG24对石油烃的降解率

试验例3-3温度对Bacillus sp.DG24降解原油的影响

无机盐液体培养基成分：0.4g Na₂HPO₄，0.15g KH₂PO₄，0.1gNH₄Cl，0.05g MgSO₄·7H₂O，0.0015g CaCl₂，0.1g NaNO₃，0.001g FeSO₄·7H₂O，微量元素1ml（100ml纯水中加入0.5mg CuSO₄·5H₂O,1.0mg H₃BO₃,1.0mg MnSO₄·5H₂O,7.0mg ZnSO₄配制得到），超纯水定容至1000ml，用2mol·L^-1HCl或2mol·L^-1NaOH调节无机盐液体培养基的pH为7.0-7.2。

从乳化原油液体培养基中吸取10ml下层水相发酵液（含Bacillus sp.DG24菌体）接入灭菌的含250mlLB培养基的500ml三角瓶中，于10℃，在150r/min条件下置于摇床中培养48h后，Bacillus sp.DG24的生长进入对数生长期。在无菌操作台中将含有Bacillus sp.DG24菌体的LB培养基转移至灭菌离心管中离心分离收集菌体，用灭菌无机盐培养基清洗菌体3遍后，将菌体重悬于灭菌无机盐液体培养基中，菌体密度控制在A₆₀₀为1.6，置于4℃冰箱待用。

分别在一系列250mL三角瓶中加入150ml无机盐液体培养基，并于121℃高温灭菌30min，冷却后在含有150mL无机盐液体培养基的三角瓶中加入用微孔滤膜过滤的原油标准储备液，初始原油浓度控制在2000mg·L^-1。待二氯甲烷挥发后，按照5%(v/v)的接种量加入前述灭菌无机盐液体培养基重悬的菌体DG24，初始菌体密度A₆₀₀为0.15。分别调节摇床温度为5℃、10℃、15℃、25℃、30℃、40℃，在150r/min条件下培养35d后，用二氯甲烷:丙酮为3:1的有机溶剂萃取原油，并用重量法分析石油烃降解率。

如表3所示，本试验例表明，培养温度分别为5℃、10℃、15℃、25℃、30℃、40℃时，Bacillus sp.DG24对石油烃的生物降解率分别为15.65±2.47%、33.48±4.73%、40.86±4.58%、48.49±4.11%、43.35±5.22%和27.66±5.38%。Bacillus sp.DG24对石油烃类物质的生物利用有较宽的温度适应范围，且最适降解温度为10℃-30℃，且在温度为25℃的条件下，该菌对石油烃的降解率最高。

表3不同温度下Bacillus sp.DG24对石油烃的降解率

试验例3-4：营养元素对Bacillus sp.DG24降解原油的影响

在石油烃污染土壤中，通常有机碳含量较高,石油能够提供生物较易利用的有机碳，而营养元素N和P相对缺乏。此外，微生物在利用石油烃进行新陈代谢的过程中，其自身生物量的增加也需要元素N和P。因此，在石油烃的生物降解过程中，石油中碳完全转化时所需的N和P的量可以根据细胞质材料中的C:N:P比例计算。C:N:P比例达不到细菌代谢所需的比例，就会限制细菌的代谢速度，从而制约油污染物的降解。通常，微生物自身C:N比在5:1到10:1，这取决于不同的微生物种类。因此，在石油烃污染土壤的生物修复技术中，控制C:N:P比在100:10:1。由于微生物不同，在降解石油烃过程中对营养元素的需求量也不尽相同，因此有必要研究Bacillus sp.DG24在降解原油过程中对营养元素N和P的需求情况。

实验过程中，由于原油组分复杂，无法精确C元素质量，所以以原油质量进行质量比的设计。需在固定无机盐液体培养基中元素P质量的情况下，设定不同原油和氮元素质量比W(原油):W(N)，以及固定无机盐液体培养基中元素N质量的情况下，设定不同原油和磷氮元素质量比W(原油):W(P)。为便于计算和控制不同质量W(原油):W(N)和W(原油):W(P)，在配制无机盐液体培养基时，其含磷元素的化合物只选择K₂HPO₄，含氮元素的化合物只选择NH₄Cl。

（1）不同原油:N（质量比）下Bacillus sp.DG24对原油的降解

NH₄Cl储备液（38.98mg/1mL）：向10ml灭菌无机盐培养基中加入389.8mgNH₄Cl，于4℃冰箱保存待用。

无机盐液体培养基成分：0.07484g K₂HPO₄，0.05g MgSO₄·7H₂O，0.0015g CaCl₂，0.001g FeSO₄·7H₂O，微量元素1ml（100ml纯水中加入0.5mg CuSO₄·5H₂O,1.0mg H₃BO₃,1.0mg MnSO₄·5H₂O,7.0mg ZnSO₄配制得到），超纯水定容至1000ml，用2mol·L^-1HCl或2mol·L^-1NaOH调节无机盐液体培养基的pH为7.0。

分别在一系列250mL三角瓶中加入150ml无机盐液体培养基，固定含磷量为2mg，分别在培养基中加入2.97、7.43、14.86、29.72、59.44、118.89mg NH₄Cl，控制培养基中原油和氮元素质量比W(原油):W(N)分别为200:1、80:1、40:1、20:1、10:1、5:1，并于121℃高温灭菌30min，冷却后在含有150mL无机盐液体培养基的三角瓶中加入用微孔滤膜过滤的原油标准储备液，初始原油浓度控制在2000mg·L^-1。待二氯甲烷挥发后，按照5%(v/v)的接种量加入前述灭菌无机盐液体培养基重悬的菌体DG24，初始菌体密度A₆₀₀为0.13。在10℃、150r/min条件下摇床培养35d后，用二氯甲烷:丙酮为3:1的有机溶剂萃取原油，并用重量法分析石油烃降解率。

如表4所示，本试验例表明，培养中W(原油):W(N)分别为200:1、80:1、40:1、20:1、10:1、5:1时，Bacillus sp.DG24对石油烃的生物降解率分别为0%、3.14±1.22%、19.53±2.66%、27.66±3.17%、38.54±3.63%和42.85±4.15%。即当含N量较高时，即当W(原油):W(N)为20:1～5:1时，Bacillus sp.DG24对石油烃的降解率较高，且在W(原油):W(N)为5:1时，石油烃降解率达到最大值。

表4不同原油:N（质量比）下Bacillus sp.DG24对石油烃的降解率

（2）不同原油:P（质量比）下Bacillus sp.DG24对原油的降解

KH₂PO₄储备液（21.83mg/1mL）：向10ml灭菌无机盐培养基中加入218.3mg KH₂PO₄，于4℃冰箱保存待用。

无机盐液体培养基成分：0.051gNH₄Cl，0.05g MgSO₄·7H₂O，0.0015g CaCl₂，0.1g NaNO₃，0.001g FeSO₄·7H₂O，微量元素1ml（100ml纯水中加入0.5mg CuSO₄·5H₂O,1.0mg H₃BO₃,1.0mg MnSO₄·5H₂O,7.0mg ZnSO₄配制得到），超纯水定容至1000ml，用2mol·L^-1HCl或2mol·L^-1NaOH调节无机盐液体培养基的pH为7.0。

分别在一系列250mL三角瓶中加入150ml无机盐液体培养基，固定含氮量为2mg，分别在培养基中加入4.28、5.71、8.56、17.13、34.25、68.5mg KH₂PO₄，控制培养基中原油和磷元素质量比W(原油):W(P)分别为200:1、150:1、100:1、40:1、20:1、10:1，并于121℃高温灭菌30min，冷却后在含有150mL无机盐液体培养基的三角瓶中加入用微孔滤膜过滤的原油标准储备液，初始原油浓度控制在2000mg·L^-1。待二氯甲烷挥发后，按照5%(v/v)的接种量加入前述灭菌无机盐液体培养基重悬的菌体DG24，初始菌体密度A₆₀₀为0.13。在10℃、150r/min条件下摇床培养35d后，用二氯甲烷:丙酮为3:1的有机溶剂萃取原油，并用重量法分析石油烃降解率。

如表5所示，本试验例表明，培养中W(原油):W(P)分别为200:1、150:1、100:1、40:1、20:1、10:1时，Bacillus sp.DG24对石油烃的生物降解率分别为0%、5.27±2.06%、13.85±2.11%、28.82±3.16%、35.58±3.46%和44.66±2.53%。可见当含N量较高时，即当W(原油):W(P)为40:1～10:1时，Bacillus sp.DG24对石油烃的降解率较高，且在W(原油):W(P)为10:1时，石油烃降解率达到最大值。

表5不同原油:P（质量比）下Bacillus sp.DG24对石油烃的降解率

试验例3-5：Bacillus sp.DG24对不同浓度石油烃的降解率

无机盐液体培养基成分：0.4g Na₂HPO₄，0.15g KH₂PO₄，0.1gNH₄Cl，0.05g MgSO₄·7H₂O，0.0015g CaCl₂，0.1g NaNO₃，0.001g FeSO₄·7H₂O，微量元素1ml（100ml纯水中加入0.5mg CuSO₄·5H₂O,1.0mg H₃BO₃,1.0mg MnSO₄·5H₂O,7.0mg ZnSO₄配制得到），超纯水定容至1000ml，用2mol·L^-1HCl或2mol·L^-1NaOH调节无机盐液体培养基的pH为7.0。

分别在一系列250mL三角瓶中加入150ml无机盐液体培养基，并于121℃高温灭菌30min，冷却后分别在含有150mL无机盐液体培养基的三角瓶中加入用微孔滤膜过滤的原油标准储备液，控制培养基中原油浓度分别为100、200、500、800、1000、2000mg·L^-1。待二氯甲烷挥发后，按照5%(v/v)的接种量加入前述灭菌无机盐液体培养基重悬的菌体DG24，初始菌体密度A₆₀₀为0.13。在10℃、150r/min条件下摇床培养35d后，用二氯甲烷:丙酮为3:1的有机溶剂萃取原油，并用重量法分析石油烃降解率，最后结果取3份平行样平均值。

如表6所示，本试验例表明，培养中原油分别为100、200、500、800、1000、2000mg·L^-1时，Bacillus sp.DG24对石油烃的生物降解率分别为61.47±5.14%、54.38±3.64%、56.26±6.21%、52.58±5.12%、45.55±3.85%和36.37±4.18%。可见，在此浓度范围条件下，石油烃的降解率均比较令人满意，石油烃的降解速率为1.76-20.78mg·L^-1·d^-1，其中在浓度范围为100～800mg·L^-1时，石油烃降解率较高，超过50%。

表6Bacillus sp.DG24对不同浓度石油烃的降解率

实施例4原状石油污染土壤中，Bacillus sp.DG24对原油的降解性能

模拟在自然条件下的石油降解环境，将Bacillus sp.DG24投加到原状石油污染土壤中，探究其在自然条件下的降解性能。

原油储备液（20000mg·L^-1）：在150ml磨口三角瓶中加入2g原油，之后定量加入100ml色谱级二氯甲烷，并用封口膜密封瓶口，缓慢摇匀后置于4℃ 冰箱待用。

石油烃降解率的测定方法采用重量法，具体而言，试验例中涉及的土壤中石油烃含量测定方法为：土样冻干取5-7g溶于20-25ml二氯甲烷，超声10min，4000转离心10min，将土壤残渣取出，重复上述操作，合并上清液于已知重量的恒重烧杯，吹干后重量法测定总石油烃含量（G总），石油烃降解率即（G_空白-G_总）/G_空白。

从乳化原油液体培养基中吸取10ml下层水相液体（含Bacillus sp.DG24菌体）接入与灭菌的含250mlLB培养基的500ml三角瓶中，于10℃，在150r/min条件下置于摇床中培养48h后，Bacillus sp.DG24的生长进入对数生长期。在无菌操作台中将含有Bacillus sp.DG24菌体的LB培养基转移至灭菌离心管中离心分离收集菌体，用灭菌无机盐培养基清洗菌体3遍后，将菌体重悬于灭菌无机盐液体培养基中，菌体密度控制在A₆₀₀为1.6，置于4℃冰箱待用。

DG24对土壤中原油的降解实验在100ml灭菌三角瓶中进行，通过人为向土壤中投加原油，充分混合后，石油烃初始浓度分别控制在0.3%、1%、3%，即10g土中总石油烃（TPH）含量分别为0.03g、0.1g、0.3g，土壤中初始石油烃浓度分别为3000、10000、30000mg·kg^-1，静置14天后测得土壤中总石油烃含量分别为2.87g·kg^-1、10.48g·kg^-1、28.86g·kg^-1。然后，将混匀后的污染土壤10g放入灭菌三角瓶中，再将已生长至对数生长期用无机盐液体培养基重悬的Bacillus sp.DG24接种至三角瓶中，不投加任何表面活性剂，控制土水比为2:1，分别在10℃低温和25℃常温、pH=7条件下培养80d。期间，定期取土样分析总石油烃含量。

如图1-a和图1-b所示，结果表明，在10℃（图1-a）低温条件下，经过80天降解后，初始浓度分别为0.03g、0.1g、0.3g的土壤中总石油烃含量分别降至1.42g·kg^-1、6.24g·kg^-1、24.48g·kg^-1，分别减少了50.52%、40.46%、15.18%，石油烃降解速率分别为0.018g·kg^-1·d^-1、0.053g·kg^-1·d^-1、0.055g·kg^-1·d^-1；在25℃（图1-b）常温条件下，经过80天降解后，初始浓度分别为0.03g、0.1g、0.3g的土壤中总石油烃含量分别降至1.26g·kg^-1、5.46g·kg^-1、22.36g·kg^-1，分别减少了56.10%、47.90%、22.52%，石油烃降解速率分别为0.020g·kg^-1·d^-1、0.063g·kg^-1·d^-1、0.081g·kg^-1·d^-1。可见，10℃条件下，土壤石油污染生物修复的石油烃降解速率可达0.018～0.055g·kg^-1·d^-1，石油烃降解率可达15.18%～50.52%。

本实施例表明，Bacillus sp.DG24菌投加到原状污染土壤中，对于土壤中的石油烃具有较好的降解能力，DG24虽然是在低温条件（10℃）下筛选的降解菌，属于耐低温菌，然而常温条件同样会发挥对土壤中石油烃类物质的生物降解，是可以野外场地实验的菌株，具有在较宽温度范围内适应土壤环境的潜力。对于低温土壤环境，尤其是我国北方地区具有较好的应用前景。

实施例5Bacillus sp.DG24优先降解的原油组分分析

分别在一系列250mL三角瓶中加入150ml无机盐液体培养基，并于121℃高温灭菌30min，冷却后分别在含有150mL无机盐液体培养基的三角瓶中加入用微孔滤膜过滤的原油标准储备液，控制培养基中原油浓度分别为100、200、500、800、1000、2000mg·L^-1。待二氯甲烷挥发后，按照5%(v/v)的接种量加入前述灭菌无机盐液体培养基重悬的菌体DG24，初始菌体密度A₆₀₀为0.13。在10℃、150r/min条件下摇床培养35d后，将三角瓶取出，静置0.5h后，吸取50mL水相溶液到100mL分液漏斗中，然后加入萃取剂色谱纯二氯甲烷:丙酮为3:1的有机溶剂100mL于分液漏斗中，萃取2次，每次摇振3min，加入无水硫酸钠去除水分后，将溶剂通过0.22μm的微孔滤膜去除杂质后，于通风厨中自然挥发有机溶剂，最后用二氯甲烷将原油组分定容在2mL棕色安捷伦小瓶中，待GC-MS分析。

GC-MS条件:采用德国Bruker公司气质联用仪（450GC-320MS）进样口温度250℃，EI源温度200℃，传输线温度250℃，初始温度60℃，保留5min，之后以10℃/min的升温速度上升到290℃，并保留15min，毛细管柱VF-5(2.5mm×0.25mm×30m)，进样量为10μL，分流比10:1，质谱分子量扫描范围40-650。C₁₀-C₃₀烷烃标准样品购自Sigma（美国）公司。

原油降解35天后，Bacillus sp.DG24对原油都有很好的乳化作用，下层培养液由澄清到浑浊到出现大小不等的油滴，下图2为Bacillus sp.DG24水相中原油组分的GC-MS扫描结果，说明部分原油组分在Bacillus sp.DG24的作用下进入水相，进而更快地被微生物降解。

表7中逐一列出各个组分。从中可以看出，Bacillus sp.DG24对中长链饱和烷烃有很好的乳化和生物降解效果，9.604min出现了Dodecane（正十二烷），16.05,3min出现了Heptadecane（正十七烷），17.138min出现了Octadecane（正十八烷），22.711min出现了Tetracosane（二十四烷），25.821min出现了Octacosane（正二十八烷）。这几种烷烃物质的含量占水相中原油组分的比例较大。此外，一些烷烃降解中产物醇类物质如16.503min出现了1-Decanol，2-hexyl（2-己基-1-葵醇）。另有单环苯的同分异构体出现，如8.418min出现了Benzene,1-ethyl-2,3-dimethyl（1-乙基-2,3-二甲基苯），8.475min出现了Benzene,1,2,4,5-tetramethyl（1,2,4,5-四甲基苯），8.978min出现了Benzene, 1,2,3,4-tetramethyl（1,2,3,4-四甲基苯），11.456min出现了Naphthalene,1-methyl（1-甲基萘）。

本实施例表明，所用Bacillus sp.DG24菌种能先将原油组分中的饱和烷烃类物质乳化，尤其是中长链烷烃，例如碳原子数为十二至二十八范围内的饱和烷烃，使这些物质优先进入水相中，这样增加了Bacillus sp.DG24菌与饱和烷烃类物质的接触几率，继而被生物利用。因此，Bacillus sp.DG24可优先利用原油组分中的饱和烷烃类物质作为碳源进行新陈代谢。

表7Bacillus sp.DG24作用下培养基中假增溶的原油组分

实施例6Bacillus sp.DG24菌对石油烃组分中饱和烷烃的降解性能

石油烃组分复杂，而烷烃是其主要成分，故单独考察Bacillus sp.DG24对中长链饱和烷烃的降解能力。

本试验例中所使用的无机盐液体培养基，将pH调至最适为7.0，为重点研究Bacillus sp.DG24在低温条件下对不同烷烃组分的生物降解效果，将温度调至10℃。

正十二烷标准储备液（1000mg·L^-1）：正十二烷密度为0.75g·mL^-1，用移液器准确吸取133.33μl正十二烷标准试剂，迅速加入到盛有20ml色谱级正己烷的100ml棕色容量瓶中，并用正己烷定容至100ml，得到浓度为1000mg·L^-1的标准储备液，于4℃保存待用。

正十四烷标准储备液（1000mg·L^-1）：正十四烷密度为0.767g·mL^-1，用移液器准确吸取130.38μl正十四烷标准试剂，迅速加入到盛有20ml色谱级正己烷的100ml棕色容量瓶中，并用正己烷定容至100ml，得到浓度为1000mg·L^-1的标准储备液，于4℃保存待用。

正十六烷标准储备液（1000mg·L^-1）：正十六烷密度为0.7734g·mL^-1，用移液器准确吸取129.30μl正十六烷标准试剂，迅速加入到盛有20ml色谱级正己烷的100ml棕色容量瓶中，并用正己烷定容至100ml，得到浓度为1000mg·L^-1的标准储备液，于4℃保存待用。

正十八烷标准储备液（1000mg·L^-1）：用20ml色谱级正己烷溶解100mg晶体状正十八烷，迅速加入到盛有20ml色谱级正己烷的100ml棕色容量瓶中，用色谱级正己烷多次清洗原包装瓶，尽量将所有晶体状正十八烷溶解并转移至棕色容量瓶中，最后用色谱级正己烷定容至100ml，得到浓度为1000mg·L^-1的标准储备液，于4℃保存待用。

正十九烷标准储备液（1000mg·L^-1）：用20ml色谱级正己烷溶解100mg晶体状正十九烷，迅速加入到盛有20ml色谱级正己烷的100ml棕色容量瓶中，用色谱级正己烷多次清洗原包装瓶，尽量将所有晶体状正十九烷溶解并转移至棕色容量瓶中，最后用色谱级正己烷定容至100ml，得到浓度为1000mg·L^-1的标准储备液，于4℃保存待用。

正二十二烷标准储备液（1000mg·L^-1）：用20ml乙醚溶解10g包装的晶体状正二十二烷，迅速加入到盛有20ml乙醚的100ml棕色容量瓶中，用乙醚多次清洗原包装瓶，尽量将所有晶体状正二十二烷溶解并转移至棕色容量瓶中，最后用乙醚定容至100ml，得到浓度为100000mg·L^-1的标准储备液。再吸取1ml浓度为100000mg·L^-1的正二十二烷标准储备液加入盛有20ml乙醚的100ml棕色容量瓶中，并用乙醚定容至100ml，得到于4℃保存待用。

正二十六烷标准储备液（1000mg·L^-1）：用20ml乙醚溶解10g包装的晶体状正二十六烷，迅速加入到盛有的100ml棕色容量瓶中，用乙醚多次清洗原包装瓶，尽量将所有晶体状正二十六烷溶解并转移至棕色容量瓶中，最后用乙醚定容至100ml，得到浓度为100000mg·L^-1的标准储备液。再吸取1ml浓度为100000mg·L^-1的正二十六烷标准储备液加入盛有20ml乙醚的100ml棕色容量瓶中，并用乙醚定容至100ml，得到于4℃保存待用。

正二十八烷标准储备液（1000mg·L^-1）：用20ml乙醚溶解10g包装的晶体状正二十八烷，迅速加入到盛有的100ml棕色容量瓶中，用乙醚多次清洗原包装瓶，尽量将所有晶体状正二十八烷溶解并转移至棕色容量瓶中，最后用乙醚定容至100ml，得到浓度为100000mg·L^-1的标准储备液。再吸取1ml浓度为100000mg·L^-1的正二十八烷标准储备液加入盛有20ml乙醚的100ml棕色容量瓶中，并用乙醚定容至100ml，得到于4℃保存待用。

无机盐液体培养基成分：0.4g Na₂HPO₄，0.15g KH₂PO₄，0.1gNH₄Cl，0.05g MgSO₄·7H₂O，0.0015g CaCl₂，0.1g NaNO₃，0.001g FeSO₄·7H₂O，1mL微量元素(每100mL纯水中加入含0.5mg CuSO₄·5H₂O,1.0mg H₃BO₃,1.0mgMnSO₄·5H₂O,7.0mg ZnSO₄配制得到)，超纯水定容至1000ml，用2mol·L^-1HCl或2mol·L^-1NaOH调节无机盐液体培养基的pH为7.0。

从乳化原油液体培养基中吸取10ml下层水相液体（含Bacillus sp.DG24菌体）接入灭菌的含250mlLB培养基的500ml三角瓶中，于10℃，在150r/min条件下置于摇床中培养48h后，Bacillus sp.DG24的生长进入对数生长期。在无菌操作台中将含有Bacillus sp.DG24菌体的LB培养基转移至灭菌离心管中离心分离收集菌体，用灭菌无机盐培养基清洗菌体3遍后，将菌体重悬于灭菌无机盐液体培养基中，菌体密度控制在A₆₀₀为1.8，置于4℃冰箱待用。

分别在含有150mL灭菌无机盐液体培养基的250ml三角瓶中加入0.2微米微孔滤膜过滤的烷烃储备液1.2mL，待溶剂挥发后，按5%（V:V）向三角瓶中加入无机盐液体培养基重悬的Bacillus sp.DG24菌体，控制初始菌密度A₆₀₀为0.145。初始烷烃浓度为400mg·L^-1。另外设置空白培养基，即不加入Bacillus sp.DG24菌体，作为对照。将三角瓶在10℃、150r/min条件下摇床培养8d后，将三角瓶取出，静置0.5h后，离心去除菌体。上清液转入分液漏斗中，然后加入有机溶剂（正己烷或乙醚）萃取上清液中的不同烷烃组分。有机相超声破碎3次后转入旋转蒸发仪中挥发溶剂。最后用2mL有机溶剂定容并用GC-MS分析不同烷烃组分浓度变化。

如下图3所示，在10℃、150r/min条件下摇床培养8d后，Bacillus sp.DG24对正十二烷、正十四烷、正十六烷、正十八烷、正十九烷、正二十二烷、正二十六烷、正二十八烷的降解率分别为53.27%、48.51%、30.64%、34.28%、36.55%、25.16%、22.48%和14.75%。

本实施例表明Bacillus sp.DG24菌对中链烷烃，如正十二烷、正十四烷、正十六烷、正十八烷和正十九烷有较好的降解能力，且对正十二烷和正十四烷的降解效果最好；对长链烷烃如正二十六烷也有一定生物降解性，进一步表明该菌对石油烃组分中的中长链烷烃有较佳的降解潜力。

Claims

1.一株耐低温石油降解菌，Bacillus sp.DG24菌，属于芽孢杆菌属，保藏编号为CGMCC No.5051。

2.Bacillus sp.DG24菌的培养方法，包括以下步骤：

（1）驯化步骤

将石油污染土样利用生理盐水溶解，摇床振荡后静置分层，将菌悬液接入原油无机盐液体培养基中，在10℃摇床培养10-15天，后取下层含有菌体的发酵液转接至原油无机盐液体培养基中继续培养10-15天，如此反复进行3-5次；

（2）分离及纯化步骤

吸取定量步骤（1）继续培养所得原油无机盐液体培养基中的发酵液，进行梯度稀释，涂布至原油无机盐固体培养基上，培养8-15天后，观察培养基菌落数量，选择数量适中的培养基，进行划线培养；

（3）反复驯化、划线培养

反复驯化、划线培养，直至得到多株纯菌。

3.如权利要求2所述的菌的培养方法，步骤（1）所用原油无机盐液体培养基，每1000ml培养基液体中含：0.4g Na₂HPO₄，0.15g KH₂PO₄，0.1gNH₄Cl，0.05g MgSO₄·7H₂O，0.0015g CaCl₂，0.1g NaNO₃，0.001g FeSO₄·7H₂O，1mL微量元素，其中微量元素由每100mL纯水中加入0.5mg CuSO₄·5H₂O,1.0mgH₃BO₃,1.0mg MnSO₄·5H₂O,7.0mg ZnSO₄配制得到，其中，1000ml培养基液体还包括0.5～2g灭菌原油，优选1g。

4.如权利要求2或3所述的菌的培养方法，步骤（2）所用原油无机盐固体培养基由下述方法得到：在每1000ml由0.4g Na₂HPO₄，0.15g KH₂PO₄，0.1gNH₄Cl，0.05g MgSO₄·7H₂O，0.0015g CaCl₂，0.1g NaNO₃，0.001gFeSO₄·7H₂O，1mL微量元素组成的培养基液体中，其中微量元素由每100mL纯水中加入0.5mg CuSO₄·5H₂O,1.0mg H₃BO₃,1.0mg MnSO₄·5H₂O,7.0mgZnSO₄配制得到，另外加入15～20g琼脂，再在培养基表面均匀涂20～30μl灭菌原油。

5.如权利要求4所述的菌的培养方法，其特征在于，步骤（3）之后，还包括保存步骤，具体为：将含Bacillus sp.DG24菌体的乳化原油无机盐液体培养基，置于4℃条件下保存，每隔40-50天吸取该乳化原油液体培养基下层水相10-20ml接入新鲜已灭菌且还没有加入降解菌的原油无机盐液体培养基中按驯化方法进行操作，10-15天后将发生乳化现象的原油液体培养基置于4℃条件下再次保存；所述乳化原油液体培养基通过下述方法得到：用灭菌接种环挑取反复纯化驯化后在原油无机盐固体培养基中划线培养的Bacillus sp.DG24菌落接入原油无机盐液体培养基中，放于培养箱中10℃培养。

6.如权利要求5所述的菌的培养方法，其特征在于，保存步骤之后，还包括富集培养步骤，具体为：吸取保存步骤所得的保存在4℃的乳化原油液体培养基下层水相液体50-100μl接入LB液体培养基中，于10℃条件下置于摇床中培养，在无菌操作台中将含有Bacillus sp.DG24菌体的LB液体培养基转移至已灭菌离心管中，离心收集菌体，并用灭菌无机盐液体培养基清洗菌体，将菌体重悬于无机盐液体培养基中置于4℃条件下待用。

7.Bacillus sp.DG24菌在降解原油中的应用，在10-30℃温度下进行；在10℃条件下，降解环境的pH优选为6.0-8.0，以NaCl计的盐度优选为0.5-1.5%，原油和磷元素质量比W(原油):W(P)优选为10:1～40:1，原油和氮元素质量比W(原油):W(N)优选为5:1～20:1，原油的浓度优选为100～2000mg·L^-1，更优选100～800mg·L^-1。

8.如权利要求7所述的应用，降解所述原油中的石油烃，优选降解饱和烷烃，更优选中长链饱和烷烃，优选碳原子数在十二到二十八范围内的饱和烷烃，更优选中链饱和烷烃，进一步优选正十二烷烃、正十四烷、正十六烷、正十八烷或正十九烷，最优选正十二烷和正十四烷。

9.如权利要求8所述的应用，原油的浓度为100～2000mg·L^-1时，石油烃的降解速率为1.76～20.78mg·L^-1·d^-1。

10.Bacillus sp.DG24菌在土壤或水体石油污染的生物修复中的应用，其中，在10-30℃温度下进行修复。

11.如权利要求10所述的应用，在10℃条件下，土壤中的石油污染的生物修复中的条件为：原油的浓度为3000～30000mg·kg^-1。

12.如权利要求11所述的应用，原油的浓度为3000～30000mg·kg^-1时，石油烃降解率为15.18%～50.52%，降解速率达到0018～0.055g·kg^-1·d^-1。