CN102994431A - 一种用于修复石油污染的盐碱土壤的微生物菌剂及制备 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种石油污染的盐碱土壤的微生物菌剂和制备方法，属资源环境技术领域。依据微生物生态学原理，在高盐碱、高石油污染土壤中提取和筛选微生物菌群，制成微生物菌剂，其中石油专性降解菌为鞘脂杆菌属、丛毛单胞菌属、噬几丁质菌属、芽孢杆菌属。经培养基和土壤环境实验，该微生物菌剂可保证所提取的微生物在含盐量5000mg/kg的土壤中生存，同时对石油含量为10－50g/kg的污染土壤具有高达80%的降解能力。本发明具有工艺简单、微生物丰富、优势菌明显并有较好的稳定性、有利于石油专性降解菌适应新的污染环境、提高和改善土壤的微生态环境质量和对环境不造成二次污染的优点，可显著提高盐碱土壤中石油烃的降解效率。

Description

一种用于修复石油污染的盐碱土壤的微生物菌剂及制备

技术领域

本发明涉及土壤石油污染修复，特别是一种用于修复石油污染的盐碱土壤的微生物菌剂及制备。

背景技术

随着石油工业的迅速发展，石油的开采量和使用量逐年增加，因此，油田开采区、远距离运输和使用石油的过程中对土壤环境造成的污染越来越严重。

当石油污染物进入土壤后，会导致土壤的理化性质改变，如土壤的通透性降低，土壤中有效的导水通路减少，造成植物根系呼吸及从土壤中摄取水分和养分的障碍，进而影响植物的生长发育。同时，由于污染物的影响，使得土壤的碳氮比改变，导致土壤中的微生物群落结构也发生变化，并可以通过食物链的传递作用，最终危害人类的健康安全。因此，从土壤环境中有效去除石油污染物已经成为国内外学者研究的热点问题。

生物法是目前国际上应用最为广泛的一类土壤石油污染修复的方法，它具有降解效率高、生物利用性强、不造成二次污染、成本低、不破坏土壤结构和组成等优点。其中微生物修复和植物—微生物联合修复是最有前途的修复方式。

近年来，国内外学者不断从环境中分离、筛选出具有降解石油烃类物质和PAHs的高效菌株，或者通过生物刺激等手段使得环境中微生物菌群的数量提高，并将所得到的菌株或菌群应用于石油污染物修复研究中。

1）单一菌株对烷烃和PAHs降解效率的研究

烷烃和PAHs由于其自身化学结构的特性，特别是长链烷烃和多环芳烃，其能够长时间存在于土壤中，对人类生存环境带来危害。因此，从环境中分离出能够高效降解这些有毒有害物质的微生物菌株，对修复土壤环境具有重要的意义。

2011年，Liu等在生物反应器中研究红串红球菌NTU-1（Rhodococcuserythropolis NTU-1）对石油和柴油的降解效果发现，四天时反应器中90%的油被去除，其中包括30%生物降解、60%生物吸附。当提高反应器中油含量，四周内降解了87%，其中包括24%生物降解、63%生物吸附。2009年，Binzazdeh、Karimi等在研究红球菌Moj-3449（Rhodococcus sp.Moj-3449)时亦发现，在高浓度长链烷烃和石油条件，能够快速对其进行生物降解。降解速度与碳个数有一定关系，即C₁₄（=C₁₆）>C₁₂>C₁₈。因此，该红球菌均能够有效的应用于石油烃污染修复。

从石油污染环境中分离、提取微生物菌株，并将其应用至PAHs的生物降解研究中，取得了较为显著的成果。中国学者Zhang、Ling等分别从油田污染土壤和炼油厂中分离、提取了绿脓杆菌DQ8（Pseudomonas aeruginosa DQ8)、芽孢杆菌JY3A（Bacillus vallismortis JY3A)和Janibacter anophelis strain JY11。研究表明：DQ8在十二天时，对荧蒽和芘的降解效率分别为40.35%和34.5%；JY3A能够以PAHs作为唯一碳源，十五天能够去除90.5%的芘。值得指出的是，若该株菌与黄孢平革菌（Phanerochaete chrysosporium）共培养，在七天时，芘的降解效率便能达到55.4%；当PAHs初始浓度为500ppm时，在不添加任何共代谢基质和表面活性剂的条件下，JY11能够在五天时分别降解菲98.5%、蒽82.1%和芘97.7%。

2）菌群对石油烃类物质降解效率的研究

由于石油污染物本身是一个复杂的化合物，单一菌种可能仅能利用石油中有限的碳源来完成自身的代谢活动。因此，采用微生物菌群对石油污染物进行生物降解，使得石油中不同组分能够更大程度的降解。

2011年，Liu、Yang等从红树林底泥中分离细菌菌群，该菌群中含有53株PAHs降解菌，其中14株菲（Phenanthrene）降解菌株、13株芘（Pyrene）降解菌株、13株苯并[a]芘（Benzao[a]pyrene）降解菌株和13株混合PAHs（Phe+Phr+Bap）。通过液体培养基试验及HPLC测定发现，Phe降解菌群和混合PAHs降解菌群均对菲有较强的降解能力。然而，对于芘和Bap而言，其各自的降解菌群对芘和Bap的降解效果并不理想。试验进行至15-20天时，芘和Bap的降解率出现升高，表明对于大分子量物质生物降解过程需要较长时间。

2010年，日本学者Bacosa、Suto等利用微生物菌群研究煤油中芳香烃类的降解过程，并关注微生物对等量碳个数（equivalent carbon number,EC）不同芳香烃类的生物降解。通过16S rRNA测序结果表明，该菌群中主要为B-变形菌（Betaproteobacteria），包括无色杆菌属（Achromobacter）、产碱杆菌属（Alcaligenes）和贪铜杆菌属（Cupriavidus）。研究发现，芳香族EC>7-8和EC>8-10的组分在试验三天后全部降解，而脂肪族EC>6-8和EC>8-10在三天后仅部分降解。芳香族EC>10-12的组分降解率排在第三位，脂肪族EC>10-12和EC>12-16的降解率最低。从数据结果表明，该菌群具有够力利用毒性更大的芳香族化合物的潜力。

2009年，在Kuwait岸边7个采样点，AL-Saleh、Drobiova等分离出272株石油降解菌。经过16S rDNA测序发现，该菌群有6个菌属，分别为假单胞菌属（Pseudomonas）、芽孢杆菌属（Bacillus）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、不动杆菌属（Acinetobacter）、考克氏菌属（Kocuria）和微球菌属（Micrococcus）。优势菌占整个石油降解菌群组成的54.2%-89.7%。2010年，Tang、He等研究藻类-细菌菌群亦能够有效降解石油中脂肪族和芳香族化合物。

与单一菌种降解石油和PAHs相比，菌群具有更加明显的优势。当外源菌群加入石油环境后，由于其自身共代谢作用或协同作用，能够同时降解复杂石油组分中的不同物质，这就很大程度避免了单一菌株对可利用碳源的弊端，进而使得复杂污染物质能够在短期内达到较高的生物降解效率。

2008年，Byss、Elhottova等通过加入平菇真菌（Pleurotus ostreatus）和白囊耙齿菌（Irpex lacteus）研究对杂酚油土壤中PAHs降解效果及土壤中细菌微生物菌群组成的影响发现，两种真菌对4-6环PAHs的降解效果明显高于微生物菌群，平菇真菌对PAHs的降解率为55-67%，且能促进土壤中G⁺菌的生长，说明细菌和真菌间有一定的联合作用。

3）植物-单一微生物联合修复石油及PAHs污染土壤

在植物-微生物联合修复石油或PAHs的过程中，根际效应（rhizosphere）在污染物降解过程中发挥了重要的作用。菌根是指高等植物营养根系和周围真菌相互共生的一种结构关系，使土壤根系、真菌之间形成一种动态的活的有机组合，是一种特殊的生物修复方法，其可分为内生菌根、外生菌根和内外兼生菌根。内生菌根又可分为丛枝菌根(Arbuscular Mycorrhiza)、杜鹃类菌根(EricaceousMycorrhiza)和兰科菌根(Orchidaceous Mycorrhiza)。

菌根真菌在侵染植物根系之后，菌丝就会由根部向外延伸，当菌根共生体对于土壤和微生物影响不再局限于根系极狭小的空间时就演变成了菌根根际。2000年，Heinonsalo等提出了菌根根际假说，在自然界木质素较多的腐殖土或石油碳氢化合物污染的土壤中，富碳基质分泌到根际尤其是菌根际，使细菌利用碳源能力加强，促进了微生物对石油类污染物的降解。植物根系和微生物的这种共生关系表现在根际中微生物的活动为土壤中固定的难降解化合物提供了理想的共代谢环境。

国内外的学者对利用根际效应降解石油污染都做了大量的工作，通过实验室盆栽试验研究这种特殊的植物-微生物修复方法对石油烃类物质及PAHs的降解效果，力求找到较为理想的降解途径。

2010年，Soleimani、Afyuni、Hajabbasi等通过内生真菌（Neotyphodiumcoenopbialum和Neotyphodium uncinatum）侵染与未侵染两种羊茅属植物（Festuca arundinacea Schreb.和Festuca pratensis Huds.）来研究陈化石油污染土壤的植物修复作用。经7个月的降解试验发现，对于有内生真菌侵染的条件下与未被侵染的植物相比，植物根系和生物量要明显增加。同时，对于土壤中TPH和PAHs的降解率分别达到了80%-84%和64%-72%。因此，在有内生真菌作用的条件下，石油污染土壤中的TPH能够更为有效的去除。

对多环芳烃类苯并[a]芘，在丛枝菌根真菌存在的条件下，能够缓解其诱导的氧化应激。这一结论已被Debiane、Garcon等在2009年通过菊苣模型验证。结果表明，在有丛植真菌作用的条件下，其根系较长。同时，当暴露在苯并[a]芘中时，能够表现出较低的毒性，说明丛枝菌根真菌能够保护植物根系。相似结论，外国学者在2011年研究柴油污染土壤中白花草木樨（Melilotus albus）与丛枝菌根真菌联合修复中发现，在有AMF存在的条件下，能够减少柴油毒性，并提高植物生物量、养分含量和抗氧化能力。

2009年，王丽萍和郭光霞等选择根系发达的玉米和2种丛枝菌根真菌，摩西球囊霉菌（Glomus mosseae，G.m）和地表球囊霉菌（Glomus versifome，G.v）进行石油污染土壤的修复实验，采用单接种和双接种的方式，实验结果表明在0.2%和2%石油浓度污染条件下，双接种石油降解率均高于单接种，分别为80.53%和77.40%，说明这两种丛枝菌根真菌存在协同效应，可促进石油烃的降解。

2007年，程国玲和李培军通过盆栽试验研究小叶白蜡（Fraxinus sogdiana）和四种外生菌根真菌，毛边滑锈伞(Hebelomam esophaeusm)、劣味乳菇(Lactarius insulsns)、松塔牛肝菌(Strobilomyces floccopus)和丝膜菌(Cortinarius russus)降解土壤石油烃类，采用单接种、双接种和混合接种（4种等量混合），结果显示单接种降解石油烃的效果均小于双接种，而且混合接种对石油烃的降解效率最高，比空白高出23.6%，说明外生菌根真菌对石油烃具有较强的降解能力，同时真菌之间的协同作用表现的极为明显。

2006年，Kaimi和Mukaidani等研究黑麦草（Ryegrass）和土壤中微生物作用提高了柴油污染土壤的降解效率。采用盆栽试验，通过152d培养后，种植黑麦草的土壤中总石油烃由初始的14157mg·kg^-1降至13mg·kg^-1，比未种植黑麦草的土壤低了55%，同时测定土壤中好氧微生物发现根际土壤中柴油的降解程度和细菌数量呈显著的相关性。

2003年，耿春女和李培军等研究不同丛枝菌根真菌对万寿菊生长及柴油降解的影响，选择20^#重柴油、三种丛枝菌根真菌，G.mosseae,G.geospora和G.constrictum及从沈抚污灌区水田种分离的细菌，采用单接种和混合接种的方式，在污染物浓度为5000mg·kg^-1条件下进行试验，结果表明，单接种G.geospora或混合接种丛枝菌根真菌和细菌均能够提高柴油在土壤中的降解效率。

1996年，Thomas Gunther等研究黑麦草对生物降解土壤中烃类污染物中得出在种植黑麦草的土壤中除了生物量显著高于未种植黑麦草外，其对烃类的降解也是最高的。2008年，Phillips和Germida等研究表明在紫花苜蓿和多年生黑麦草根际土壤中烃类的降解速率比对照组要高得多。2002年，Tesar和Reichenauer等研究利用布莱克白杨（black poplar）、草本植物（herbal plants）和细菌的根际效应降解柴油得到了相似的结论。

多环芳烃由于具有低溶解性、高毒性、易被土壤吸附等特点，使得其一旦进入土壤环境便很难被除去，给生态环境、土壤植物、动物和微生物带来极大危害。菌根生物法修复污染土壤中PAHs是目前研究最多的一种土壤修复方式之一。

2010年，Lefrancois、Quoreshi等研究赤杨-弗兰克氏菌属（alder-Frankia）共生修复、再利用石油污染砂土。经过2季的修复，对比发现，在有弗兰克氏菌属作用的条件下，正十六烷、萘和菲的矿化度显著增加。

2008年，李秋玲研究了丛枝菌根真菌对多环芳烃污染土壤的修复作用，选用5种丛枝菌根真菌对土壤中的菲进行降解，经20-70天后，测定结果表明菲的降解率均在91%以上，其中有3种达到了97%。同时，混合接种的丛枝菌根真菌的降解效果最高达98%。

通过根际修复污染土壤能够提高PAHs的降解和矿化程度已经得到了广泛的证实，高于50%的难降解PAHs，包括B[a]P在内的污染物可以被外生菌根所降解。同时，所有从未污染土壤中分离出来的外生菌根真菌均表现出降解持久性有机污染物的能力。

2008年，Fan和Li等研究紫花苜蓿（alfalfa）根际效应对芘（pyrene）降解，经60天培养后考察芘的剩余含量，结果表明在根际土壤中细菌和真菌含量分别比非根际土壤高5.0-7.5和1.8-2.3倍。同时，在根际土壤中芘的平均去除率比非根际土壤中高6%，证明紫花苜蓿的根能够有效提高芘污染土壤的降解效率。

还有一些学者研究了根际效应对PAHs的降解，如2007年，Chiapusio和Pujol等研究黑麦草和红三叶草对三种人工菲（phenanthrene）污染土壤的降解效果；Joner在2006年证实了混合三叶草和黑麦草修复PAHs过程中菌根真菌的作用，发现接种菌根真菌的植被土壤中苯并[a,h]蒽能够被有效降解；Johnson在2005年用黑麦草和白三叶草组成的植物修复系统研究PAH污染土壤的修复，发现在接种了菌根真菌的根系土壤中PAHs的降解被提高了；2004年，刘世亮和骆永明等通过盆栽试验研究丛枝菌根真菌对苯并[a]芘（B[a]P）污染土壤的降解效果，得到相似的结论。

4）植物-微生物菌群联合修复石油及PAHs污染土壤

利用微生物菌群与植物联合降解环境中石油及PAHs，越来越多的受到人们的重视。目前，在植物-微生物菌群修复过程中主要关注微生物菌群本身的固氮能力，这直接关系到在贫瘠的土壤条件下，微生物是否能够靠自身提供氮源；土壤中基质的添加，对于植物-微生物联合修复的作用；土壤中PAHs在植物-微生物菌群作用下的降解效率等。

N.Dashti和M.Khanafer等在2009年通过研究豆科植物蚕豆（Vicia faba）和羽扇豆（Lupinus albus）根瘤与细菌菌群联合修复石油污染土壤发现，在有根瘤存在条件下其对石油利用的能力要高于非根瘤植物。同时，筛选出11株能够以石油作为唯一碳源的菌株，包括假单胞菌属（Pseudomonas）8株、芽孢杆菌属（Bacillus）2株及诺卡氏菌属（Nocardia）1株。

Al-Mailem、Sorkhoh等在2010年研究阿拉伯湾高耐盐植物应用于石油修复，结果表明耐盐植物Halonemum strobilaceum能够自然生长在阿拉伯湾高盐岸边。同时，根际微生物数量是没有植被地区的14-38倍。根际中常见的菌属为古细菌嗜盐杆菌属（Archaea Halobacterium sp.）、嗜盐球菌属（Halococcussp.）、

Brevibacillus borstenlensis、变形菌属（proteobacteriaPseudoalteromonas ruthenica）和盐单胞菌属（Halomonas sinaensis），以上菌种均可以在1-4M NaCl中生长。对于根际微生物菌群而言，在含氮与不含氮培养基中均可以减少石油含量。

通过加入基质，刺激土壤中微生物菌群的生长，进而能够达到较为理想的植物-微生物联合修复效果。Agamuthua,Abioyea和Azizb在2010年研究了麻疯树（Jatropha curcas）对润滑油污染的植物修复。结果表明，在有机废物（香蕉皮、酿酒谷物残渣和真菌堆肥）作用的条件下，含油量25000mg/kg和10000mg/kg土壤中去除率分别达到了56.6%和67.3%。同时，经研究发现，植物根部并没有积累碳氢化合物，而是通过根际降解的途径对油类进行降解。在测定添加不同有机废物土壤中微生物数量发现，在酿酒谷物残渣中微生物数量显著高于其余条件，并且该条件下对油类的降解率亦最高，达到89.6%和96.6%（含油量2.5%和1%）。

微生物菌群和植物联合修复石油污染土壤的研究受到人们的普遍性。通过研究牵牛花（Pharbitis nil L.）和土壤微生物菌群联合修复土壤中石油污染物，Zhang和Zhou等人2010年发现在有植被作用的条件下其对石油的降解效果为27.63%-67.42%，要比没有植被作用时的10.20%-35.61%显著增加。同时，当土壤中石油浓度大于10000mg/kg时，微生物菌群数量开始出现急剧下降。当石油浓度小于10000mg/kg时，微生物可以通过调节自身的代谢和酶系统，使自身适应石油环境。研究亦发现，在有植物作用的条件下，植物渗出液能够为微生物提供各种营养物质和充足的能量，为微生物繁殖提供可能。

2010年，Mohsenzadeh,Nasseri,Mesdaghinia等研究了蓼科首乌属植物（Polygonum aviculare L.）与根系周围真菌对于石油污染土壤的生物修复。研究表明，来自石油污染地区植被根系周围的微生物多样性要比非污染区域高。同时，通过含油培养培养发现，镰刀菌属微生物具有高耐油的特点（10%v/v），可以用于重石油污染区。研究亦表明，真菌在整个降解过程中起到了主要作用，植物的根系加速了这一过程。

2010年，Lu、Teng等研究真桦鬼针草（Bidens maximowicziana）对于提高芘污染土壤去除效果研究发现，经50d修复后，芘含量降低了79%。多环芳烃降解的主要途径是植物提高了土壤中微生物菌群的降解能力。

相似的结论Cheema、Khan等2009年在研究牛毛草(Festuca arundinacea)根际对提高菲和芘降解效果时亦有所体现。同时，Cheema、Khan等在2010年通过研究牛毛草、黑麦草、苜蓿和油菜籽对PAHs降解发现，进行PAHs降解过程中，复合植物修复对菲和芘的降解率能够分别达到98.3%-99.2%和79.8%-86.0%，比单一植物修复的降解率有所提高。Mikkonen、Kondo等在2011年研究山黄麻（Galega orientalis）对燃油根际修复时亦得到了类似结论。

5）土壤中石油和重金属污染物同时修复效果研究

有机污染物和重金属通常同时存在与工业废水和矿区污染土壤中。由于作用方式和处理方法不同，同时修复土壤中有机污染物石油、杀虫剂等和重金属是一个复杂的问题。因此，各国学者开始将能够沉淀重金属的微生物和降解石油的微生物联合培养，研究其对体系中重金属和石油同时去除的能力。

Péreza和Cabrera等在2010年采用厌氧反应器（anaerobic stirred tankreactor）研究硫酸盐还原菌硫弧菌（Desulfovibrio sp）对Cr（III）、Cu（II）、Mn（II）和Zn（II）的沉降效果，经24小时后，95%的重金属被沉降。同时，利用能够降解石油物质的绿脓杆菌AT18（Pseudomonas aeruginosa AT18)在有重金属溶液存在的条件下，降解石油污染物2%（v/v），结果表明，石油物质降解率达到60%，Cr（III）、Cu（II）、Mn（II）和Zn（II）的去除率分别为99%、93%、88%和46%。在以上两个反应器试验基础上，可以将该两个反应过程整合成一个体系，以期得到更为理想的重金属和石油联合去除的目的。

Sorkhoh、Al-Awadhi和Al-Mailem等在2010年进行了重金属汞和石油污染土壤中植物修复，研究植物和根际细菌的作用。从豆科植物蚕豆的根际细菌中筛选出具有利用石油和耐受重金属汞的潜力的微生物，通过16SrRNA测序表明，分别为Citrobacter freundii、Enterobacter aerogenes、Exiquobacteriumaurantiacum、Pseudomonas veronii、Micrococcus luteus、Brevibacillusbrevis、Arthrobacter sp.和Flavobacterium psychrophilum。所有这些菌种均具有固氮能力，可以在贫瘠的土壤中应用。研究表明，当土壤中HgCl₂的含量达到40mg/L时，根际细菌对石油的能力会受到抑制，然后，当HgCl₂浓度高于40mg/L时，降油能力仍可以保持原有降油水平的50%。同时，对植物和根系细菌而言，其具有相同的去除土壤中Hg的能力。

对于多组分污染物质同时采用生物法进行修复，目前仍处于起步阶段。虽然，通过试验已经表明微生物在一定程度上能够在降解石油物质的同时通过沉降或者吸附等作用去除重金属，但其作用的机理及起作用的原因还需要进一步查明。

6）展望

生物修复方法最重要的问题是寻求最适宜的植物和微生物，其中微生物中，细菌、真菌和放线菌都有相关的研究工作证实了对石油污染土壤的修复作用。

在目前的国内外研究工作中，以提取单一菌种并应用于土壤石油污染修复的研究工作相对较多，而对菌群的研究工作相对较少，特别是针对高盐碱土壤的石油污染修复问题的研究尚未见报道，对于高盐分高石油污染的双重胁迫情况下的微生物的筛选和应用是解决石油污染盐碱土壤的生物修复的关键性工作。

植物-微生物修复土壤石油污染物已成为发展趋势，但在理论和技术层面仍存在诸多问题尚待解决，表现在以下几个方面：

①微生物在利用并降解石油污染物，但是外源菌种的加入是否会对土著微生物本身造成影响，其协同或竞争机制有待进一步查明。

②自然土壤中微生物种类繁多，越来越多的学者开始关注利用菌群降解土壤中的微生物，结果表明，菌群在某种程度上对石油污染物的降解能力要明显高于单一菌种。考虑到应用环境不同，利用菌群来修复石油污染物仍存在一些尚需解决的问题，如菌群修复是否具有可重复性。同时，是否可以人工构建菌群，如何解决菌群间的协同机制，使所构建菌群最大限度的降解石油污染物。

③考虑到不同地区土壤类型的特点，如何筛选高效石油降解菌株或菌群已成为近年来研究的热点问题。在极端条件，如高含盐量、营养元素N、P缺乏或多组分污染物共存（如重金属和石油）条件下，如何构建和培养高效而稳定的微生物降解菌和菌群，并应用于实际环境条件，是目前急需解决的问题。

发明内容：

本发明的目的是针对石油污染盐碱土壤急需解决石油和盐碱双重胁迫的污染问题，提供一种用于修复石油污染的盐碱土壤的微生物菌剂及制备方法，该微生物菌剂可以保证所提取的微生物可在高盐碱化为5000mg/kg的土壤中生存，同时对石油含量为10000-50000mg/kg的污染土壤具有高达80%的降解能力。

本发明的技术方案：

一种用于修复石油污染的盐碱土壤的微生物菌剂，由无机盐原油培养基和将有石油污染的自然盐碱土壤样品接种于该无机盐原油培养基中提取的细菌菌群组成，其中无机盐原油培养基由基础无机盐溶液和原油组成，细菌菌群中的石油专性降解菌为鞘脂杆菌属、丛毛单胞菌属、噬几丁质菌属、芽孢杆菌属。

所述基础无机盐溶液的组成为：1g NaCl、0.1g(NH₄)₂SO₄、0.025g MgSO₄·7H₂O、0.2g NaNO₃、0.4g KH₂PO₄、1.0g K₂HPO₄·3H₂O和100mL蒸馏水，无机盐石油培养基为上述100mL基础无机盐溶液与2g原油混合、pH为7.0的混合液。

一种所述用于修复石油污染的盐碱土壤的微生物菌剂的制备，步骤如下：

1）细菌菌群的提取

将10g有石油污染的自然盐碱土壤样品接种于100mL无机盐原油培养基中，置于恒温水浴摇床，在140rpm、30℃条件下，连续培养7天，即可以将样品中的细菌菌群提取出来，该细菌菌群对盐分和石油具有一定的耐受力，将其制成微生物菌液；

2）细菌菌群的富集培养

将上述微生物菌液重新接种在新制备的原油培养基中，连续富集3-4个周期，富集培养条件为温度30℃、140rpm/min恒温水浴摇床，使微生物总量达到10¹⁰-10¹²cfu/mL并稳定，制得微生物菌剂；

3）微生物菌剂保存和使用

微生物菌剂采用两种方式保存：一是冷冻保存，即将制备好的微生物存放在-18℃冰箱中保存，保存时间不超过150天，使用时快速放入30℃恒温水浴摇床中急剧解冻，然后放入新制备的无机盐石油培养基中培养；二是低温保存，即将制备好的液体制剂存放在4℃冰箱中保存，保存时间不超过45天，使用时可直接放入新制备的无机盐石油培养基中并在30℃恒温水浴摇床中培养。

本发明的优点是：

该微生物菌剂制备简单具有微生物丰富、优势菌明显并有较好的稳定性、制备工艺简单；采用本微生物菌剂处理石油污染物盐碱土壤的处理成本低、有利于石油专性降解菌适应新的污染环境、提高和改善土壤的微生态环境质量和对环境不造成二次污染的优点，可以显著地提高盐碱土壤中石油烃的降解效率，同时也可适用于有一定含盐量的石油污染水体的修复。在土壤环境和液体环境下，一次施加该微生物菌剂的原油的降解率可以达到70%，二次施加原油的降解率可以达到92％以上。

附图说明

图1（a）、（b）为含油量10000mg/L、30000mg/L和50000mg/L条件下修复33d细菌菌群的DGGE图谱及分析图。

图2为石油浓度分别为10000mg/L、30000mg/L和50000mg/L条件下的细菌菌群对石油的降解率过程图。

图3（a）、（b）分别为空白未灭活和灭活土壤中石油降解率随时间的变化曲线。

图4为石油浓度为5000mg/kg、10000mg/kg和15000mg/kg的非根系土壤和空白灭活土壤中石油降解率变化过程。

图5（a）、（b）、（c）分别为三种含盐量、三种石油污染浓度土壤在植物—微生物联合作用（P-M）和微生物独立作用（非根系）条件下的盆栽土壤中石油降解率的变化过程。

具体实施方式

实施例：

一种用于修复石油污染的盐碱土壤的微生物菌剂，由无机盐原油培养基和将有石油污染的自然盐碱土壤样品接种于该无机盐原油培养基中提取的细菌菌群组成，其中无机盐原油培养基由基础无机盐溶液和原油组成；所述基础无机盐溶液的组成为：1g NaCl、0.1g(NH₄)₂SO₄、0.025gMgSO₄·7H₂O、0.2g NaNO₃、0.4gKH₂PO₄、1.0g K₂HPO₄·3H₂O和100mL蒸馏水，无机盐石油培养基为上述100mL基础无机盐溶液与2g原油混合、pH为7.0的混合液。

一种所述用于修复石油污染的盐碱土壤的微生物菌剂的制备，步骤如下：

1）细菌菌群的提取

取天津市大港区油田附近土壤样本和泥浆样本三种，石油污染物取自采油井，基本情况见表1。

表1天津市大港区油田附近所采样品性状描述

以10g的接种量将采集的土壤和泥浆样品分别接种于100mL无机盐原油培养基中，置于恒温水浴摇床，在140rpm、30℃条件下，连续培养7天，即可以将样品中的细菌菌群提取出来，该细菌菌群对盐分和石油具有一定的耐受力，将其制成微生物菌液；

2）细菌菌群的富集培养

将上述微生物菌液重新接种在新制备的原油培养基中，连续富集3-4个周期，富集培养条件为温度30℃、140rpm/min恒温水浴摇床，使细菌计数为10¹²cfu/mL并稳定，制得微生物菌剂；

3）微生物菌剂保存和使用

采用低温保存，即将制备好的液体制剂存放在4℃冰箱中保存，保存时间不超过45天，使用时可直接放入新制备的无机盐石油培养基中并在30℃恒温水浴摇床中培养。

该微生物菌剂的实验分析：

（一）微生物菌剂中微生物种类

1）石油专性降解菌的筛选、分离、纯化和鉴定

取微生物液体菌剂，以10%的接种量接入以石油作为唯一碳源的培养基中，在140rpm，30℃条件下培养7天，对培养后的菌液进行平板培养，分别挑取菌落形态结构不同的微生物进行平板划线，重复划线3-4次，以纯化微生物菌株；对分离的微生物菌株进行形态学结构分析和菌种鉴定。

形态学结构分析：采用平板法从盆栽土壤中分离不同形态结构的菌落，然后对菌落进行纯化3-4次，无菌操作挑取平皿中单一菌落，分别进行革兰氏染色、芽孢染色、鞭毛染色和荚膜染色，将结果与《伯杰细菌手册》进行对照，初步鉴定微生物所在的种属。

菌种鉴定：提取菌群中各优势菌的DNA并进行PCR扩增，然后将PCR未纯化产物进行测序，最后通过Gene Bank对所测得序列进行比对，以确定石油降解菌的具体名称。

2）PCR-DGGE对比分析不同菌群中微生物多样性

图1（a）、（b）为不同条件下细菌菌群DGGE电泳成像图和经过Quantity One处理后的相似度分析。

从图1（a）和（b）中均可以看出，细菌菌群均存在较为明显的优势条带7、8、9、11。含油量10000mg/L（第1泳道）存在两条较为明显的优势条带7、8；随着含油量的增加，细菌菌群中优势条带亦变得相对清晰，含油量30000mg/L（第2泳道）和50000mg/L（第3泳道）条件下有三条优势带6、7和8，条带颜色明显加深，说明此两条带在菌群中含量较高且菌群中优势微生物较含油量10000mg/L条件下发生明显变化，对比三种石油浓度的菌群条带可见，含油量30000mg/L条件下，微生物条带最为丰富，当达到含油量50000mg/L时，虽然优势条带颜色加深，但其他条带相对减少。

表2为细菌菌群的优势菌属。

表2细菌菌群的DGGE（16SrDNA）图谱对应条带的序列比对分析

（二）该微生物制剂在不同环境条件下的应用效果

将本发明制备的微生物液体制剂分别应用于液体环境和土壤环境。对照分析施加该制剂和无施加制剂条件下，不同含盐量、不同石油含量条件下的石油污染物的降解能力和微生物状况。

1）液体环境

在液体环境下，针对含盐量为7000mg/L的高盐条件，通过摇瓶试验研究外源菌群（细菌）对含油量10000mg/L、30000mg/L和50000mg/L条件下石油的降解效果试验研究。

采用重量法测定石油含量，结果见表3。

表3LB培养基中施加微生物菌剂的石油降解率变化过程

图2表示细菌液体培养基中细菌菌群对含油量10000、30000和50000mg/L的降解效率。

在5d时，摇瓶中均出现了较明显的降解过程，分别降解了37.38%、40.33%和20.84%。随着时间推移，各条件下石油的降解率继续升高，19d时，含油量30000mg/L摇瓶中的石油降解率达到61.47%，并趋于稳定，保持在60%左右。含油量10000mg/L时，降解率在19d后继续升高，但变化幅度要明显减小，在33d时，石油降解率已趋于平稳，达到65.69%。高含油条件下（50000mg/L），细菌菌群在初期对石油的降解率明显低于较低含油条件。这主要是因为高含油条件对微生物生长初期会有一定的抑制作用，但能够较快适应石油环境，并能够在短期内利用石油作为碳源提供自身生长，显示在石油降解率上会出现明显升高过程。三种含油量条件下石油降解效率的顺序为：含油量30000mg/L>10000mg/L>50000mg/L。

总之，在液体环境下，该微生物菌剂对石油污染物的降解过程表现为，石油降解率随着时间的推移逐渐增加，在20d左右，石油降解率变化开始趋于平稳。造成这一现象的主要原因是因为在有限的生长空间内，微生物菌群在适合的条件下会大量繁殖，一旦环境中营养物质和空间限制或不利于微生物生长，微生物菌群就会受到一定程度的抑制，导致对石油的利用能力降低，造成降解率降低。此外，对于高含油量50000mg/L条件下，其降解率要明显低于其余两个条件，这是由于在高油条件下对微生物菌群生长造成一定程度胁迫，进而抑制了微生物对石油的利用能力。

2）土壤环境（盆栽实验）

在土壤环境中，分别对土壤、微生物、植物三种条件进行了应用性实验，对比分析本发明的微生物制剂在土壤环境下的石油降解效果和对高含盐量的耐受能力。

试验组I为空白对照组：采用空白灭活（高压灭菌，121℃下，持续2h，表示无土著微生物）和空白未灭活（有土著微生物）土壤作为空白组，将土壤的石油浓度配制为5000mg/kg、10000mg/kg和15000mg/kg。

试验组II为微生物修复（无根系）土壤：应用外源微生物，即本发明的微生物制剂，对盆栽土壤中石油污染物进行修复，菌液量为100mL，石油浓度为5000mg/kg、10000mg/kg和15000mg/kg。土壤的含盐量分别为2490mg/kg（低盐）、3960mg/kg（中盐）和4666.7mg/kg（高盐）。

试验组III为植物-微生物联合修复（plantmicrobe group,简称P-M）：每盆中种植紫花苜蓿种子82粒，均匀分布在盆中，添加菌液100mL，将土壤盐分分别调至2490mg/kg（低盐）、3960mg/kg（中盐）和4666.7mg/kg（高盐），石油浓度为为5000mg/kg、10000mg/kg和15000mg/kg。

①空白对照组中石油含量分析

图3（a）、（b）分别表示了空白未灭活和灭活土壤中石油降解率的变化。由图显示，空白未灭活和灭活土壤中石油污染物都具有一定的降解效果。

未灭活条件下，不同的土壤石油污染条件下，经120d可达到15%-20%，并以含油量15000mg/kg的降解率为最大。而5000mg/kg和10000mg/kg土壤则相当。这说明土壤中的土著微生物表现出一定的耐受石油污染的能力。

灭活条件下，不同石油含量的土壤的石油降解率相当，虽然随着时间的延续，石油含量有一定的降低，但是降低幅度明显低于未灭活条件（10-15%）。这说明在无生物条件下，土著微生物对石油降解作用消失，但在自然环境中，石油污染物中易挥发或易分解的有机物质会随着时间的推移逐渐减少，导致土壤中总的石油烃含量（TPC）略有降低，但整个作用小于有着土著微生物的土壤的石油污染物的自净作用。

②土壤中加入微生物菌剂的石油降解率分析

图4为施加微生物菌剂但无植物（以下简称为非根系），与灭活土壤条件的石油含量的变化曲线。图4表明，非根系土壤中加入微生物制剂后，不同的石油污染土壤，石油降解率都呈现快速增加段和平稳段的一致变化特点。本研究条件下，30d左右降解率可达到稳定期，由于施加微生物菌液量相同，因此，对低污染浓度土壤表现了较好的降解率。含油量5000、10000、15000mg/kg土壤的120d降解率分别达到53.4%、46.8%及45.6%。

对比空白灭活土壤中不同石油含量的降解率，发现在有无微生物存在的条件下，各个浓度石油的降解效率有着很大的不同。从图中均能够很明显的看出加入菌液后，微生物对石油污染土壤修复起到的巨大作用。从16d开始，含油量5000mg/kg土壤的石油降解率分别是空白灭活土壤的10.5、12、10和9.2倍，其他石油污染土壤也表现相同的规律。这说明，在有外源微生物情况下，土壤中石油污染物能够在一定程度上被微生物所分解，这与微生物在分解代谢的过程对石油物质作为碳源的利用能力及土壤中不同种属的微生物之间的相互作用有很大的关系。

这说明适当增加施用微生物量有助于增高石油降解率，外源微生物菌群起作用的时间大约在26d-35d左右，并在加入菌群初期，微生物菌群能够直接或间接利用盆栽土壤中石油污染物质及掺混的营养物质，由于各种微生物间形成了共生或协同作用，维持盆栽土壤中微生物生长。在30d左右，石油降解率趋于稳定。若进一步提高修复效率，可以采用多次施加微生物菌剂的措施，使土壤微生物群落结构发生另一个稳定的改变。

③植物-微生物联合修复盆栽石油污染盐碱土壤效果分析

图5（a）、（b）、（c）为不同石油含量的土壤在不同含盐量条件下，非根系和植物（苜蓿）—微生物（施加微生物菌剂）联合修复（P-M）条件的盆栽土壤中石油修复效果对比。

考虑到植物从栽种、发芽至生长需要一定的时间，且根系在修复过程中将起到较为重要的作用，因此，将首次测定的时间选在35d左右（苜蓿已形成根系）。实验研究中发现，不同石油浓度的降解率均无明显减少，到了78d，植物对土壤中石油污染物才表现明显的修复作用，说明植物对污染物产生降解效果需要较长时间。

分析发现，不同含盐量土壤，在相同石油污染程度下，土壤的石油降解率表现出相似的变化规律，基本都在35d左右达到稳定的降解率。但含盐量越高，相对石油降解率减小。

在相同含盐量的土壤中，不同石油污染土壤的降解率表现为污染越严重，达到稳定的降解率的时间延长，稳定的降解率值略有降低。由于施用菌剂的量是相同的，所以在实际中，可以通过增加菌剂施用量，来达到提高降解率的作用。

对比不同石油污染条件下，不同含盐量土壤，微生物独立作用和P-M作用可以发现，在非根系土壤和P-M土壤中加入微生物菌剂7d后，P-M联合修复石油污染土壤中石油的降解率要明显高于非根系土壤中微生物的单独作用。主要原因是，有根系的土壤环境有利于外源微生物存活，且能够使得其在较短的时间内适应土壤环境并发挥降解石油污染物的作用。有相关文献表明，在根系土壤中，植物的根系可以和土壤中的微生物形成根系效应（rhizosphere effect），其根系分泌的酶提供适合微生物存活的土壤环境，同时微生物在分解有机物的代谢产物可以为植物提供营养，被植物所利用。

在整个降解过程中，P-M的降解效率始终高于非根系土壤的降解效率。在含油量5000、10000和15000mg/kg条件下，P-M对石油物质的降解率均不同程度的高于非根系土壤中微生物的单独作用。虽然在降解过程中7d-16d非根系土壤中三个浓度石油含量均有较为明显的降低过程，但降解率仍然是P-M高于非根系中微生物的单独作用。50d后，土壤中石油降解率趋于平稳。

总之，对于含油量5000mg/kg盆栽土壤而言石油降解率：植物修复<非根系土壤<P-M联合修复；对于含油量10000mg/kg及15000mg/kg盆栽土壤中石油降解率：植物修复≈非根系土壤<P-M联合修复。

对比分析土壤含盐量对石油降解效率的影响，发现，土壤中加入菌液7d后，低盐（2493.3mg/kg）的不同石油浓度在修复初期的降解率均高于其他含盐量土壤。说明在盐份和石油双重胁迫条件下，含盐量是初期影响石油降解率的主要因素。表现为盐分胁迫延长了微生物和植物适应环境的时间，在16d左右石油的降解效率才出现了较为明显的突越。

尽管初期低盐下3个油浓度均具有比中、高盐份条件高的降解效率，但随着微生物和植物对环境适应能力的增加，特别是高盐（4666.67mg/kg）条件下，不同石油浓度均可看见滞后于低盐条件下石油降解率的突越，一般出现在16d左右。而后高盐条件下不同浓度的石油降解率呈现持续增加的趋势，在50d时降解率趋于平稳，即石油降解率升高的程度不明显。120d的石油含量波动不大。

综合以上实施方案的实验研究，本发明的微生物制剂具有较高的石油降解能力，同时，对环境的盐分胁迫具有相当的耐受力，适用于修复盐碱土壤的石油污染问题。

Claims (3)

1.一种用于修复石油污染的盐碱土壤的微生物菌剂，其特征在于：由无机盐原油培养基和将有石油污染的自然盐碱土壤样品接种于该无机盐原油培养基中提取的细菌菌群组成，其中无机盐原油培养基由基础无机盐溶液和原油组成，细菌菌群中的石油专性降解菌为鞘脂杆菌属、丛毛单胞菌属、噬几丁质菌属、芽孢杆菌属。

2.根据权利要求1所述用于修复石油污染的盐碱土壤的微生物菌剂，其特征在于：所述基础无机盐溶液的组成为：1g NaCl、0.1g(NH₄)₂SO₄、0.025gMgSO₄·7H₂O、0.2g NaNO₃、0.4g KH₂PO₄、1.0g K₂HPO₄·3H₂O和100mL蒸馏水，无机盐石油培养基为上述100mL基础无机盐溶液与2g原油混合、pH为7.0的混合液。

3.一种如权利要求1所述用于修复石油污染的盐碱土壤的微生物菌剂的制备，其特征在于步骤如下：

1）细菌菌群的提取

将10g有石油污染的自然盐碱土壤样品接种于100mL无机盐原油培养基中，置于恒温水浴摇床，在140rpm、30℃条件下，连续培养7天，即可以将样品中的细菌菌群提取出来，该细菌菌群对盐分和石油具有一定的耐受力，将其制成微生物菌液；

2）细菌菌群的富集培养

将上述微生物菌液重新接种在新制备的原油培养基中，连续富集3-4个周期，富集培养条件为温度30℃、140rpm/min恒温水浴摇床，使微生物总量达到10¹⁰-10¹²cfu/mL并稳定，制得微生物菌剂；

3）微生物菌剂保存和使用

微生物菌剂采用两种方式保存：一是冷冻保存，即将制备好的微生物存放在-18℃冰箱中保存，保存时间不超过150天，使用时快速放入30℃恒温水浴摇床中急剧解冻，然后放入新制备的无机盐石油培养基中培养；二是低温保存，即将制备好的液体制剂存放在4℃冰箱中保存，保存时间不超过45天，使用时可直接放入新制备的无机盐石油培养基中并在30℃恒温水浴摇床中培养。

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