CN104649848A - 一种用于修复石油污染盐碱土壤的固体菌肥及制备方法 - Google Patents

Abstract

一种用于修复石油污染的盐碱土壤的固体菌肥，由菌群混合液、高盐牛肉膏蛋白胨原油培养基和固体介质组成，菌群混合液由芽胞杆菌属、类芽胞杆菌属、凝结芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和肠杆菌属混合组成，菌群混合液接种于高盐牛肉膏蛋白胨原油培养基中进行培养和富集；固体介质由高压灭菌的麸皮和锯末组成。本发明的优点是：该固体菌肥制备简单，原料易得；采用固体菌肥进行石油污染盐碱土壤的生物修复，处理成本低、能改良土壤透气性和营养状况和对环境不造成二次污染，可以显著地提高盐碱土壤中石油烃的降解效率；经过60天的修复期后，在土壤盐分含量为6.1g/kg高盐条件下石油降解率可以达到46.0％。

Description

一种用于修复石油污染盐碱土壤的固体菌肥及制备方法

技术领域

本发明涉及石油污染土壤修复，特别是一种用于修复石油污染盐碱土壤的固体菌肥及制备方法。

背景技术

随着我国石油工业的发展，由于石油的大规模勘探、开发、冶炼、运输和使用，污染、遗漏、井喷、输油管道泄漏等事故频发，受石油污染土地的面积不断扩大，其污染程度也日益加重。

石油类物质进入土壤后很难去除，并对土壤中的植物、动物、微生物产生重大影响，并可以通过食物链的最终危害人类的健康。同时，我国很多陆上油田，尤其北方地区油田土壤中含盐量普遍比较高。中原油田污染土壤中全盐量为7.1g·kg^-1，是未污染土壤的6.0倍，胜利油田土壤含盐量可达15.0g·kg^-1。由于石油开发过程中会产生大量的钻井液(含NaCl、NaOH、Na₂CO₃等)，以及石油勘探开采过程中遍地打井、挖埋输油管线、大型机器设备压实等，破坏土体本身结构使区域地面沉降，导致降水不易汇流外泄，只能靠蒸发排泄，从而使盐在地表不断地积累，土地盐碱化的面积逐渐扩大、盐碱程度不断加重。

生物法是目前国际上应用最为广泛的一类土壤石油污染修复的方法，它具有降解效率高、生物利用性强、不造成二次污染、成本低、不破坏土壤结构和组成等优点。微生物降解是修复石油污染土壤的一种有效的方法，也是石油烃类有机污染物去除的主要机制，而通常油田污染物中石油含量高、含盐量高、成分复杂、矿化度高、可生化性差，给微生物处理法带来一定难度，而解决的关键是筛选出能够适应上述条件的高效石油烃降解菌。由于筛选到的液体石油降解菌群在保存、运输和活性保存等方面存在诸多问题，因此，将微生物固定在载体上以获得高效、易于保存的固体菌肥是生物修复的一个很有前景的方向。

近年来，国内外学者不断从环境中分离、筛选出具有降解石油烃类物质高效液体菌群，并将所得到的液体菌群应直接用于石油污染物修复或者制成石油降解生物菌肥用于石油污染物修复的研究中。

1)液体菌群对石油烃类物质降解效率的研究

由于石油污染物本身是一个复杂的化合物，单一菌种可能仅能利用石油中有限的碳源来完成自身的代谢活动。因此，采用微生物菌群对石油污染物进行生物降解，使得石油中不同组分能够更大程度的降解。

2011年，Liu、Yang等从红树林底泥中分离细菌菌群，该菌群中含有53株PAHs降解菌，其中14株菲(Phenanthrene)降解菌株、13株芘(Pyrene)降解菌株、13株苯并[a]芘(Benzao[a]pyrene)降解菌株和13株混合PAHs(Phe+Phr+Bap)。通过液体培养基试验及HPLC测定发现，Phe降解菌群和混合PAHs降解菌群均对菲有较强的降解能力。然而，对于芘和Bap而言，其各自的降解菌群对芘和Bap的降解效果并不理想。试验进行至15-20天时，芘和Bap的降解率出现升高，表明对于大分子量物质生物降解过程需要较长时间。

2010年，日本学者Bacosa、Suto等利用微生物菌群研究煤油中芳香烃类的降解过程，并关注微生物对等量碳个数(equivalent carbon number,EC)不同芳香烃类的生物降解。通过16S rRNA测序结果表明，该菌群中主要为B-变形菌(Betaproteobacteria)，包括无色杆菌属(Achromobacter)、产碱杆菌属(Alcaligenes)和贪铜杆菌属(Cupriavidus)。研究发现，芳香族EC>7-8和EC>8-10的组分在试验三天后全部降解，而脂肪族EC>6-8和EC>8-10在三天后仅部分降解。芳香族EC>10-12的组分降解率排在第三位，脂肪族EC>10-12和EC>12-16的降解率最低。结果表明，该菌群具有够力利用毒性更大的芳香族化合物的潜力。

2009年，在Kuwait岸边7个采样点，AL-Saleh、Drobiova等分离出272株石油降解菌。经过16S rDNA测序发现，该菌群有6个菌属，分别为假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、考克氏菌属(Kocuria)和微球菌属(Micrococcus)。优势菌占整个石油降解菌群组成的54.2％-89.7％。2010年，Tang、He等研究藻类-细菌菌群亦能够有效降解石油中脂肪族和芳香族化合物。

与单一菌种降解石油和PAHs相比，菌群具有更加明显的优势。当外源菌群加入石油环境后，由于其自身共代谢作用或协同作用，能够同时降解复杂石油组分中的不同物质，这就很大程度避免了单一菌株对可利用碳源的弊端，进而使得复杂污染物质能够在短期内达到较高的生物降解效率。

2008年，Byss、Elhottova等通过加入平菇真菌(Pleurotus ostreatus)和白囊耙齿菌(Irpex lacteus)研究对杂酚油土壤中PAHs降解效果及土壤中细菌微生物菌群组成的影响发现，两种真菌对4-6环PAHs的降解效果明显高于微生物菌群，平菇真菌对PAHs的降解率为55-67％，且能促进土壤中G⁺菌的生长，说明细菌和真菌间有一定的联合作用。

2)石油降解固体菌肥对石油烃类物质降解效率的研究

微生物降解是修复石油污染土壤的一种有效的方法，也是石油烃类有机污染物去除的主要机制；微生物修复主要采用强化土著微生物降解(生物刺激)和投加外源高效降解微生物(生物强化)2种方式促进微生物对土壤中有毒有害物质的降解、转化和去除。而通常油田污染物中石油含量高、含盐量高、成分复杂、矿化度高、可生化性差，给微生物处理法带来一定难度。土著微生物降解石油污染物的潜力很大，但其驯化时间长、生长速度慢、代谢活性较低，因此添加高效外源石油降解菌，能够有效的提高生物修复的效率。由于筛选到的液体石油降解菌群在保存、运输和活性保存等方面存在诸多问题，因此，将微生物固定在载体上以获得高效、易于保存的固体菌肥是生物修复的一个很有前景的方向。

固定化微生物技术是采用物理或化学手段将游离细胞(微生物)固定在载体上使其高度密集并保持其生物活性功能，在适宜的条件下还可以增殖以满足应用需要的生物技术。目前在污染土壤修复研究中，载体结合法和包埋法是主要采用的固定化方法。其中载体结合法，操作简单，微生物细胞活性损失小，某些载体可反复使用，大幅度提高参加反应的微生物浓度，而且固定化后的微生物耐环境冲击性增强，可降低二次污染等，应用较为广泛。

在污染土壤修复中主要应用的吸附性载体材料来源于农副产品的有机纤维性材料和无机多孔性岩石，这两种载体的易于菌体的附着，同时可以吸附大量营养物质，大大增加了接种微生物的数量和活性同时也增加了微生物的稳定性，增强了其耐环境冲击的能力；另外，载体还可以起到疏松剂的作用，加快氧气的输送，并能加快氧气的传输，从而为微生物提供了有利的生存场所。选用载体的性质是影响微生物活性、稳定性及污染物去除效果的重要因素。而污染土壤修复中的选用的载体不仅要有利于微生物的附着，同时，载体还可以提供一种良好缓冲体系的微环境，屏蔽土壤不利条件的侵害；载体还必须为外源微生物提供充足的营养，提高土壤微生物的密度和活性，应用于土壤修复中的载体材料应具有一定的可生物降解性。因此，对于固定化微生物技术修复污染土壤选择合适的载体材料至关重要。基于以上理论，以筛选的高效石油降解菌为基础，选择合适固体介质作为固态培养的营养源和载体，研制一种活菌数量高、适合石油污染土壤修复的固体微生物菌肥，可以以此来强化石油污染土壤的生物修复。

目前，石油污染土壤修复的研究大部分集中在石油降解菌株的筛选、石油降解机理以及土壤修复工艺方面，这些研究逐步证实了石油污染土壤微生物修复的可行性。向石油污染土壤中投加高效生物菌剂是一种切实可行的原位修复技术，该技术在国外起步较早，已开发出多种商品生物菌剂，并应用于实际的修复工程中，取得良好的修复效果。Gentili等采用壳质角素和壳聚糖作为载体来固定红球菌属，进行原油污染海水修复，发现固定化细菌对海水污染物的去除比游离菌提高了大约30％。Dzul-Puc等分别以甘蔗渣和松针粉末作为黄袍原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)的生长的载体，并应用于苯并[a]芘污染土壤的修复，结果表明甘蔗渣组苯并[a]芘降解更快。用甘蔗渣固定白腐真菌(phanerochaetechrysosporrium)大大提高了锰过氧化酶的活性和水体蒽的去除率。

虽然生物菌剂在我国处于研发阶段，相关报道较少，但研究表明修复效果较好。张瑞玲等从石油污染土壤中筛选2种优势细菌，并将这2种微生物制成的混合菌液与固体草炭土以0.5:1的比例制备成固体微生物菌剂，投放到辽河油田石油污染土壤中进行了现场原油污染土坡的修复实验，修复2个月后，结果表明，该微生物菌剂对原油降解率为73.5％，高效菌剂发挥了显著作用。

胥九兵等将2种细菌的石油降解菌剂接种到草炭和麸皮的固态培养基中培养，分析温度、接种量、料水比、草炭与麸皮的比例、培养时间对固态培养的影响，并制备的BC-E和BCI-2种菌剂。采用研制的菌剂对石油污染土壤进行修复实验，实验表明，1个月污染土壤中的石油降解率可达到45％。

黄廷林等将高效石油降解菌与锯末混合，培养制成菌剂，应用到石油污染土壤中，结果表明，土壤中石油烃的降解效果与生物菌剂的投加量呈正相关，当生物菌剂投加量为0.6mg/kg时，修复48d的石油烃降解率为87％。黄廷林等从陕北石油污染土壤中分离的优势菌种，并进行室内生物修复实验，实验表明，在供试土壤中添加不同膨松剂后，添加麦皮效果最好，降解率达到87.96％，其次为稻壳，降解率达到71.19％，添加锯末效果最差，降解率仅为38.98％。

于勇勇等将油砂、锯末和发酵后的农家肥混合，堆成长方体，将菌液喷洒在堆体上，进行降解实验，实验表明，经过56d的处理，菌剂强化处理单元最终油去除率达到47.4％。

胡广军等将从污灌区污染土壤中筛选出的对PAHs具有一定降解能力的土著混合菌和农产品副产物和营养物(麦麸、豆粉、蔗糖等)混合培养，制备成4种菌剂类型，用来降解污染土壤中的多环芳烃，结果表明：将液体混合菌剂加入到载体中培养3d后，投加到多环芳烃污染土壤中，42d内对菲、蒽、芘和苯并(a)芘的降解率分别可达到84.32％、85.24％、82.59％和62.25％。但是目前国内关于石油污染盐碱土壤修复的固体菌肥研制、生产的研究很少涉及，需要进一步对其进行研究。

3)展望

微生物修复方法最重要的问题是寻求最适宜的微生物，其中细菌、真菌和放线菌都有相关的研究工作证实了对石油污染土壤的修复作用。

在目前的国内外研究工作中，将液体菌群应用于土壤石油污染修复的研究工作相对较多，而对石油降解固体菌肥研究工作相对较少，特别是针对高盐碱土壤的石油污染修复问题的研究尚未见报道，对于高盐分高石油污染的双重胁迫情况下的微生物的筛选和应用是解决石油污染盐碱土壤的生物修复的关键性工作。

微生物修复土壤石油污染物已成为发展趋势，但在理论和技术层面仍存在诸多问题尚待解决，表现在以下几个方面：

①微生物在利用并降解石油污染物，但是外源菌种的加入是否会对土著微生物本身造成影响，其协同或竞争机制有待进一步查明。

②自然土壤中微生物种类繁多，越来越多的学者开始关注利用菌群降解土壤中的微生物，结果表明，菌群在某种程度上对石油污染物的降解能力要明显高于单一菌种。考虑到应用环境不同，利用菌群来修复石油污染物仍存在一些尚需解决的问题，如菌群修复是否具有可重复性。同时，是否可以人工构建菌群，如何解决菌群间的协同机制，使所构建菌群最大限度的降解石油污染物。

③考虑到不同地区土壤类型的特点，如何筛选高效石油降解菌株或菌群已成为近年来研究的热点问题。在极端条件，如高含盐量、营养元素N、P缺乏或多组分污染物共存(如重金属和石油)条件下，如何构建和培养高效而稳定的微生物降解菌和菌群，并应用于实际环境条件，是目前急需解决的问题。

发明内容

本发明的目的是针对石油污染盐碱土壤急需解决石油和盐碱双重胁迫的污染问题，提供一种用于修复石油污染的盐碱土壤的固体菌肥及制备方法，该固体菌肥可以保证微生物可在含盐量为6.1g/kg的高盐碱化、石油含量为5000mg/kg的土壤中生存，同时对该石油污染盐碱土壤具有高达46.0％的降解能力。

本发明的技术方案：

一种用于修复石油污染的盐碱土壤的固体菌肥，由菌群混合液、高盐牛肉膏蛋白胨原油培养基和固体介质组成，菌群混合液由芽胞杆菌属(Bacillus sp.)、类芽胞杆菌属(Paenibacillus sp.)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)和肠杆菌属(Enterobacter sp.)混合组成，菌群混合液接种于高盐牛肉膏蛋白胨原油培养基中进行培养和富集；固体介质由高压灭菌的麸皮和锯末组成。

所述液体菌群混合液中芽胞杆菌属(Bacillus sp.)、类芽胞杆菌属(Paenibacillus sp.)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)和肠杆菌属(Enterobacter sp.)的质量比为3：3：8：3：3；所述高盐牛肉膏蛋白胨原油培养基为由高盐牛肉膏蛋白胨液体培养基与原油组成的pH为7.0的混合液，其中高盐牛肉膏蛋白胨液体培养基由蛋白胨、牛肉膏、NaCl和蒸馏水组成，蛋白胨、牛肉膏、NaCl和蒸馏水的用量比为10g：3g：12g：1000mL，高盐牛肉膏蛋白胨原油培养基中高盐牛肉膏蛋白胨液体培养基与原油的用量比为1000mL：5g，菌群混合液与高盐牛肉膏蛋白胨原油培养基的用量比为1g：10mL；固体介质中麸皮与锯末的质量比为1：1；菌群混合液与固体介质的质量比为15：100。

一种所述用于修复石油污染的盐碱土壤的固体菌肥的制备方法，步骤如下：

1)将芽胞杆菌属(Bacillus sp.)、类芽胞杆菌属(Paenibacillus sp.)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)和肠杆菌属混合后接种于高盐牛肉膏蛋白胨原油培养基中，置于恒温水浴摇床，在140rpm、30℃条件下，连续培养5天，获得微生物菌液；

2)将上述微生物菌液重新接种在新制备的牛肉膏蛋白胨原油培养基中，连续富集3－4个周期，富集培养条件为温度30℃、140rpm/min恒温水浴摇床，使微生物总量达到10¹⁰-10¹²cfu/mL并稳定，制得微生物液体菌剂；

3)将高盐牛肉膏蛋白胨液体培养基在一个大气压下灭菌20min，冷却至室温后在无菌室中接种微生物液体菌剂，再置于水浴摇床上，于30℃、140rpm/min条件下培养2天，然后加入固体介质中并混合均匀，加入高盐牛肉膏蛋白胨液体培养基以使含水率为60％，于37℃恒温培养3天，得到固体菌肥并在4℃条件下密封保存。

本发明的优点是：

该固体菌肥由耐盐石油降解细菌菌群组成，固体介质易获得，制备简单；采用固体菌肥进行石油污染盐碱土壤的生物修复，具有处理成本低、能改良土壤透气性和营养状况和对环境不造成二次污染的优点，可以显著地提高盐碱土壤中石油烃的降解效率。在石油污染的盐碱土壤中施加该固体菌肥，经过60天的修复期后，在土壤盐分含量为6.1g/kg高盐条件下石油降解率可以达到46.0％。

附图说明

图1为石油浓度为5000mg/L条件下将培养好的固体菌肥直接施加到2种盐分含量分别为2.2g/kg、6.1g/kg的石油污染土壤中石油降解率变化过程图。

图2为耐盐固体菌肥在4℃保存下的pH和微生物数量变化过程图。

图3为石油浓度为5000mg/L条件下将不同保存时间的固体菌肥直接施加到2种盐分含量分别为2.2g/kg、6.1g/kg的石油污染土壤中石油降解率变化过程图。

具体实施方式

实施例：

一种用于修复石油污染的盐碱土壤的固体菌肥，由菌群混合液、高盐牛肉膏蛋白胨原油培养基和固体介质组成，菌群混合液由15g芽胞杆菌属(Bacillus sp.)、15g类芽胞杆菌属(Paenibacillus sp.)、40g凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、15g地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)和15g肠杆菌属(Enterobacter sp.)混合组成，菌群混合液接种于1000mL高盐牛肉膏蛋白胨原油培养基中，所述高盐牛肉膏蛋白胨原油培养基为由高盐牛肉膏蛋白胨液体培养基与原油组成的pH为7.0的混合液，其中高盐牛肉膏蛋白胨液体培养基由10g蛋白胨、3g牛肉膏、12g NaCl和1000mL蒸馏水组成，高盐牛肉膏蛋白胨液体培养基与原油的用量比为1000mL：5g；固体介质由高压灭菌的麸皮和锯末组成；菌群混合液与固体介质的质量比为15：100。

一种所述用于修复石油污染的盐碱土壤的固体菌肥的制备方法，步骤如下：

1)将芽胞杆菌属(Bacillus sp.)、类芽胞杆菌属(Paenibacillus sp.)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)和肠杆菌属按比例混合后接种于高盐牛肉膏蛋白胨原油培养基中，置于恒温水浴摇床，在140rpm、30℃条件下，连续培养5天，获得微生物菌液；

2)将上述微生物菌液重新接种在新制备的牛肉膏蛋白胨原油培养基中，连续富集3个周期，富集培养条件为温度30℃、140rpm/min恒温水浴摇床，使微生物总量达到10¹⁰cfu/mL并稳定，制得微生物液体菌剂；

3)将高盐牛肉膏蛋白胨液体培养基在一个大气压下灭菌20min，冷却至室温后在无菌室中接种微生物液体菌剂，再置于水浴摇床上，于30℃、140rpm/min条件下培养2天，然后加入固体介质中并混合均匀，加入高盐牛肉膏蛋白胨液体培养基以使含水率为60％，于37℃恒温培养3天，得到固体菌肥并在4℃条件下密封保存。

该耐盐固体菌肥的石油降解实验分析：

在土壤环境中施加固体菌肥，对比分析本发明的固体菌肥在土壤环境下的石油降解效果和对不同含盐量的耐受能力。

1.将培养好的固体菌肥直接施入石油污染土壤中石油降解效果分析

本发明将石油污染土壤置于15×20cm的塑料盆中，本实例投加10％的固体菌肥，水分维持在20％，在室温条件下修复60天，研究其石油降解效果。

试验组I为空白对照组：采用空白未灭活(有土著微生物)土壤作为空白组，将土壤的石油浓度配制为5000mg/kg；土壤的含盐量分别为低盐2200mg/kg，高盐6100mg/kg。

试验组II为微生物修复土壤：应用外源微生物，即本发明的固体菌肥，对盆中石油污染土壤进行修复，石油浓度为5000mg/kg；土壤的含盐量分别为低盐2200mg/kg，高盐6100mg/kg。

微生物修复过程中石油降解率如图1所示。从图1可以看到，在60d的修复期结束后，在低盐土中，石油降解率达到31.5％，比不添加固体菌肥的高20.2％；在高盐土中，石油降解率达到46.0％，比不添加固体菌肥的高37.9％；该固体菌肥在高盐土中的降解效果优于低盐土中，比低盐土中高14.5％，说明该固体菌肥适用于盐碱的石油污染土壤。

2.将不同保存时间固体菌肥施入石油污染土壤中石油降解效果分析

1)保存过程中固体菌肥特性分析

图2为不同保存时间固体菌肥微生物pH及微生物数量随时间的变化。从图2可以发现，在4℃保存过程种，固体菌肥的pH值随着时间的增加有先升高后下降的趋势。固体菌肥在保存35d时，pH值达到最大值8.13，之后开始下降。固体菌肥保存过程中pH的变化幅度不大，有趋向碱性的趋势，主要原因可能是固体介质本身的缓冲性致使pH波动较小；微生物适宜碱性环境，使环境条件利于自身生存的条件发展。

在4℃保存过程中，固体菌肥随着时间的增加，微生物数量都有下降的趋势，固体菌肥在35d时，微生物数量下降到1.06×10⁸cfu/mL；固体菌肥在50d时，微生物数量下降到10⁷cfu/mL。根据微生物肥料行业标准有效微生物数量≥10⁸cfu/mL时固体菌肥是合格的，固体菌肥在4℃条件下可以保存大约35d。

2)保存过程中石油降解能力分析

本发明将石油污染土壤置于15×20cm的塑料盆中，本实例投加10％的固体菌肥，水分维持在20％，在室温条件下修复35d，研究其石油降解效果。

试验组I为空白对照组：采用空白未灭活(有土著微生物)土壤作为空白组，将土壤的石油浓度配制为5000mg/kg；土壤的含盐量分别为低盐2200mg/kg，高盐6100mg/kg。

试验组II为微生物修复土壤：将不同保存时间的耐盐固体菌肥添加到土壤中，对盆中石油污染土壤进行修复，石油浓度为5000mg/kg；土壤的含盐量分别为低盐2200mg/kg，高盐6100mg/kg。

3)在微生物修复过程中石油降解率的分析：

图3为在石油污染土壤中添加不同保存时间的固体菌肥进行生物修复35d后(从上述实验发现，添加固体菌肥后，在35d内石油降解率变化较大，35-60石油降解率趋向平稳，因此用35d降解率衡量其降解能力)石油降解率变化。

从图3可以发现，随着固体菌肥保存时间的延长，施加到土壤中后，石油降解率有一定程度的下降；在低盐条件下的石油降解率高于高盐条件。刚培养好的固体菌肥施加到土壤中，修复效果最好，修复35d后，两种盐分条件下的石油降解率分别为38.6％、25.6％；保存到35d时，石油降解率分别下降到31.3％、21.0％；保存到50d时，石油降解率分别下降到25.6％、16.7％。说明该固体适合修复盐碱石油污染土壤，在保存到35d时，在高盐土中有较好的降解效果，可以达到31.3％，到50d时，已经下降到21.6％，降解率较低，选择固体菌肥保存35d。

通过该固体菌肥保存过程中特性分析和不同保存时间的修复效果综合分析，固体菌肥合适的保存时间为35d；在35d内该菌肥的石油降解菌的数量较多，降解效果较好。

Claims (3)

1.一种用于修复石油污染的盐碱土壤的固体菌肥，其特征在于：由菌群混合液、高盐牛肉膏蛋白胨原油培养基和固体介质组成，菌群混合液由芽胞杆菌属(Bacillus sp.)、类芽胞杆菌属(Paenibacillus sp.)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)和肠杆菌属(Enterobacter sp.)混合组成，菌群混合液接种于高盐牛肉膏蛋白胨原油培养基中进行培养和富集；固体介质由高压灭菌的麸皮和锯末组成。

2.根据权利要求1所述用于修复石油污染的盐碱土壤的固体菌肥，其特征在于：所述液体菌群混合液中芽胞杆菌属(Bacillus sp.)、类芽胞杆菌属(Paenibacillussp.)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)和肠杆菌属(Enterobacter sp.)的质量比为3：3：8：3：3；所述高盐牛肉膏蛋白胨原油培养基为由高盐牛肉膏蛋白胨液体培养基与原油组成的pH为7.0的混合液，其中高盐牛肉膏蛋白胨液体培养基由蛋白胨、牛肉膏、NaCl和蒸馏水组成，蛋白胨、牛肉膏、NaCl和蒸馏水的用量比为10g：3g：12g：1000mL，高盐牛肉膏蛋白胨原油培养基中高盐牛肉膏蛋白胨液体培养基与原油的用量比为1000mL：5g，菌群混合液与高盐牛肉膏蛋白胨原油培养基的用量比为1g：10mL；固体介质中麸皮与锯末的质量比为1：1；菌群混合液与固体介质的质量比为15：100。

3.一种如权利要求1所述用于修复石油污染的盐碱土壤的固体菌肥的制备方法，其特征在于步骤如下：

1)将芽胞杆菌属(Bacillus sp.)、类芽胞杆菌属(Paenibacillus sp.)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)和肠杆菌属(Enterobacter sp.)混合后接种于高盐牛肉膏蛋白胨原油培养基中，置于恒温水浴摇床，在140rpm、30℃条件下，连续培养5天，获得微生物菌液；

2)将上述微生物菌液重新接种在新制备的牛肉膏蛋白胨原油培养基中，连续富集3－4个周期，富集培养条件为温度30℃、140rpm/min恒温水浴摇床，使微生物总量达到10¹⁰-10¹²cfu/mL并稳定，制得微生物液体菌剂；

3)将高盐牛肉膏蛋白胨液体培养基在一个大气压下灭菌20min，冷却至室温后在无菌室中接种微生物液体菌剂，再置于水浴摇床上，于30℃、140rpm/min条件下培养2天，然后加入固体介质中并混合均匀，加入高盐牛肉膏蛋白胨液体培养基以使含水率为60％，于37℃恒温培养3天，得到固体菌肥并在4℃条件下密封保存。