CN104745506A

CN104745506A - 一株石油烃降解菌及其应用

Info

Publication number: CN104745506A
Application number: CN201510103987.4A
Authority: CN
Inventors: 张方亮; 姜瑛; 王朝明; 陈俊培; 马晓蕾; 周文; 王瑞龙; 石巍巍; 闫亚宇; 刘晓京
Original assignee: Co Ltd Of Hydrogeological Engineering Geological Mapping Institute Of Henan Province
Current assignee: Co Ltd Of Hydrogeological Engineering Geological Mapping Institute Of Henan Province
Priority date: 2015-03-11
Filing date: 2015-03-11
Publication date: 2015-07-01

Abstract

本发明涉及一株石油烃降解菌及其应用，该石油烃降解菌JK2C，分类名为假单胞菌（Pseudomonas sp.），已于2015年01月19日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.10366。本发明菌株适应油田区的高油污染、高盐和偏碱性的土壤环境，对石油污染土壤有很强的降解能力。

Description

一株石油烃降解菌及其应用

技术领域

本发明属于环境修复技术领域，具体涉及一种石油烃降解菌及其应用。

背景技术

石油是原油和石油制品的总称，是一种由多种烃类及少量非烃化合物和有机金属组成的复杂混合物。据统计，我国每年约有60多万吨的石油及其制品通过各种途径进入环境，污染土壤、地下水、河流、海洋。石油进入土壤后可引起一系列不良反应，如影响土壤的通透性，改变土壤碳氮比和碳磷比，造成土壤肥力下降。作为高分子有机物的石油烃粘着在植物根系上，阻碍了根系的呼吸与水分吸收，甚至引起根系腐烂。石油能够导致土壤微生物种群数量、群落结构、群落组成以及群落多样性的变化，破坏土壤微生态环境。石油类物质在重力、表面张力和毛细现象的作用下向地下渗透和沿地表扩散，使土层沥青化、板结化，破坏土壤结构，严重影响植物的生长。土壤中的石油向下渗漏污染地下水，或者被雨水携带污染地表水体，造成水源地长期污染。石油中某些成分特别是多环芳烃类有机污染物能够在农产品中积累，进入食物链，可能产生“三致”(致畸、致癌、致突变)效应，进而危害人类健康和生态环境安全等。因此，石油污染引起人们的高度关注。

对于土壤中的石油污染，目前有物理、化学和生物方法将其去除。物理和化学方法虽然见效快，但是成本较高，而且容易造成二次污染，因此限制了土壤修复中的应用。而生物法修复本身包括动物修复、植物修复及微生物修复，这三种方法中由于微生物资源丰富、易于培养、对环境的耐受性较强、故微生物修复被认为具有广阔的应用前景。菌株产生生物表面活性剂是其代谢原油的机制之一，生物表面活性剂具有乳化原油能力、可生物降解性的优点，在原油污染土壤的修复中具有很高的应用价值，且采用微生物对石油进行降解的成本较低，不会造成二次污染。

发明内容

本发明的目的一提供石油烃降解菌，石油烃降解菌JK2C，分类名为假单胞菌（Pseudomonas sp.），已于2015年01月19日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101，保藏号为 CGMCC No.10366。

菌株形态为乳白色，圆形，边缘不整齐，半透明，细胞大小为0.8～1.0μm × 1.5～2.5μm，

所述石油烃降解菌的生理生化特性是：革兰氏阴性，短杆状，好氧；氧化酶，过氧化氢酶反应为阳性；M.R试验阳性，VP试验阴性；明胶水解，淀粉水解为阳性，硝酸盐还原阳性。

本发明所述的石油烃降解菌培养时使用的主要氮源包括但不限于、硝酸钾、硝酸铵、硫酸铵、尿素；使用的主要碳源包括但不限于原油、葡萄糖、蔗糖、淀粉；使用的无机组分包括但不限于氯化钾、氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸三钙、二水氯化钙、七水合硫酸镁、七水和硫酸亚铁。本发明的石油烃降解菌发酵可在20~35℃，pH6~9的环境下进行。

本发明的目的二在于提供石油烃降解菌于高盐环境下在提高石油污染土壤中石油降解率的应用，所述的高盐环境为含盐的质量百分比浓度0.2～2.0%的盐，所述盐包括NaCl 和/或Na₂SO₄。

本发明的目的三在于提供石油烃降解菌于高油土壤中在提高石油污染土壤的石油降解率的应用，所述的高油土壤为土壤中含有质量浓度0.1～2.5%的原油。

本发明的目的四在于提供石油烃降解菌于偏碱性土壤中在提高石油污染土壤的石油降解率的应用，所述偏碱性土壤即土壤的pH值为7.0～9.0。

本发明的目的五在于提供一种石油烃降解菌在提高石油污染土壤的石油烃降解率的应用，使用石油烃降解菌JK2C前，先将营养剂施入石油污染土壤，接着进行扰动处理，然后喷施石油烃降解菌JK2C，石油烃降解菌JK2C的使用量为30～60kg/亩；喷施石油烃降解菌JK2C后再对土壤进行扰动处理使得营养剂和石油烃降解菌JK2C与土壤混匀，其中土壤含水率18～22%，每年7～9月份进行施工。

所述石油烃降解菌在提高石油污染土壤的石油烃降解率的应用，施入营养剂的同时还加入秸秆400～600kg/亩。

所述石油烃降解菌在提高石油污染土壤的石油烃降解率的应用，所述营养剂的使用量：尿素15～20kg/亩、复合肥40～50kg/亩和乳化剂0.3～0.6kg/亩。

所述乳化剂为十二烷基磺酸钠。

所述复合肥中N:P₂O₅:K₂O的质量比为1:（0.5～2）:（0.5～2）。

所述扰动处理为初级耕作措施及次级耕作措施；所述初级耕作措施为翻耕、深松耕和旋耕中一种或一种以上；所述次级耕作措施为耙地、耱地、中耕和镇压中的一种或一种以上。

本发明以石油微生物学为理论依据，综合极端微生物学、环境微生物学和环境工程学的相关理论知识，针对石油降解问题；本发明成功地在石油污染的土壤中筛选出来石油烃降解菌，该菌株适应油田区的高油污染、高盐和偏碱性的土壤环境。通过在室内模拟不同环境条件对菌株降解效果的影响，得出的最适宜的环境条件，为盆栽试验方案的实施提供依据；结合前期室内试验和野外施工的可行性，设计了不同辅助措施，以验证不同辅助措施对该菌降解石油污染土壤降解石油的影响，结果表明合理的辅助措施配合该菌能大幅提高石油污染土壤中的石油降解率，比不施用菌的空白处理降解率可提高213.3%。

附图说明

图1是本发明菌株JK2C的菌落图；

图2是菌株JK2C的系统发育树；

图3表示不同pH值对菌株JK2C降解石油的影响；

图4表示不同石油浓度对菌株JK2C降解石油的影响；

图5表示不同温度对菌株JK2C降解石油的影响；

图6表示不同盐度对菌株JK2C降解石油的影响；

图7表示不同表面活性剂对菌株JK2C降解石油的影响；

图8表示不同碳源对菌株JK2C降解石油的影响；

图9表示不同氮源对菌株JK2C降解石油的影响；

图10表示不同辅助措施配合接种JK2C菌株在60天后的石油污染土壤的降解效果；

图11表示不同辅助措施配合接种JK2C菌株在60天后的石油污染土壤的去毒效果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进一步的描述，但是并不限制本发明的内容。

本发明是由发明人在中原油田长期受石油污染的土壤中筛选得到的，

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

实验中使用到的两种培养基：

固体培养基：K₂HPO₄1.0 g、KH₂PO₄1.0 g、MgSO₄.7H₂O0.5 g、NH₄NO₃1.0 g、CaCl₂0.02 g、FeCl₃0.005g、琼脂18 g、石油10g、水1000mL、pH7.0，121℃灭菌20分钟备用。

液体培养基：K₂HPO₄1.0 g、KH₂PO₄，1.0 g、MgSO₄.7H₂O0.5 g、NH₄NO₃1.0 g、CaCl₂0.02 g、FeCl₃ 0.005g、石油10g、水1000mL、pH7.0，121℃灭菌20分钟备用。

实施例2

菌株的分离：

取1g长期受石油污染的土壤加入到液体培养基中，加入玻璃珠，于30℃、180rpm条件下在摇床中避光培养7 d后，转接于新鲜的液体培养基中继续培养，如此反复5次。取0.1 mL培养液均匀涂布在含固体培养基的平板上，30℃避光培养，每天观察菌落生长情况；待菌落长出，挑选形态不同的菌落转接到新鲜的含有固体培养基的平板上，如此反复数次，直到形成形态单一的菌落，即为纯化的菌株，4℃保存，备用。

菌株生理生化的鉴定：

对分离到的石油烃降解菌JK2C进行形态观察发现菌株形态为乳白色，圆形，边缘不整齐，半透明，如图1所示，细胞大小为0.8～1.0 μm × 1.5～2.5μm，呈杆状。

将纯化后的菌株接种于28℃条件下、无机盐培养基培养7 d，观察形态特征，采用DNA提取试剂盒（TIANGEN公司）提取菌株总DNA；采用引物27F及1492R进行石油烃降解菌的16S rDNA片段的PCR扩增，PCR反应条件为：94℃预变性8 min，94℃变性1 min，52℃退火1 min，72℃延伸1 min，34个循环，最后72℃继续延伸8 min，4℃保存。PCR产物由北京美亿美生物技术有限公司进行测序，测序结果导入CenBank数据库中，通过BLASt进行同源性比较，选择相近的序列与JK2C的序列用MEGA version 3 软件构建JK2C的16SrDNA系统进化树如图2所示。根据该菌株的生理生化特征，鉴定为假单胞菌（Pseudomonas sp.），同源性为97%。

该菌种呈革兰氏阴性、短杆状。菌落较小为乳白色、边缘不整齐，表面光滑湿润。好氧，最适生长温度为35℃。氧化酶，过氧化氢酶反应为阳性；明胶水解，淀粉水解，都为阳性，硝酸盐还原阳性。能够以石油为唯一碳源进行生长。

好氧性试验

把灭过菌的LB培养基倒入3个已灭菌的试管中的2/3处，在无菌操作台上，用接种针挑取斜面培养的所述菌，穿刺接种到上述培养基中，操作过程要求必须穿刺到管底。于30 ℃条件下培养，分别在3天至7天观察结果。在琼脂柱表面上生长者为好氧菌，如沿穿刺线生长者为厌氧菌或兼性厌氧菌。试验结果表现，菌落沿琼脂柱表面生长，穿刺线内无菌落生长，为好氧菌。

过氧化氢酶的测定

在干净载玻片上滴1滴3wt%H₂O_2，取18~24 h的LB斜面培养物1环，在H₂O₂中涂抹，若有气泡产生则为阳性，否则为阴性。试验结果为接触酶阳性。

甲基红试验（M.R试验）

a. 培养基及试剂：蛋白胨5g，葡萄糖5g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，调节 pH7.0~7.2，分装试管，每管装4~5 mL，121℃灭菌20 min。试剂：甲基红0.1g，95 %酒精300 mL，蒸馏水200 mL 。

b. 菌种培养及结果观察接种菌株于上述培养液中，30℃培养 l~2 天。在培养液中加入几滴甲基红试剂，若培养液呈现红色，为甲基红阳性，黄色为阴性；由于甲基红变色范围4.4红色~6.0黄色。

试验结果为M.R阳性。

乙酞甲基甲醇试验（V.P试验）

a. 培养基培养基同甲基红试验。 b. 菌种培养及结果观察接种与培养同甲基红试验。做 VP 试验时，取培养液2mL和等量的40 %NaOH 相混合，加少量肌酸，充分振荡2~5 min后，若培养液出现红色，即为VP 阳性。

试验结果为VP阴性。

淀粉水解试验

a. 培养基及试剂在肉汤蛋白胨琼脂中添加0.2%的可溶性淀粉，分装三角瓶，121℃灭菌20min备用。路哥氏碘液：碘片1g，碘化钾2g，先用3~5mL蒸馏水溶解碘化钾，现加入碘片，待碘完全溶解后，加水稀释至300mL。

b. 菌种培养及结果观察取菌种点接于平板上，30℃培养2~4天，形成菌落后，在平板上滴加路哥氏碘液，以铺满菌落周围为度，平板呈蓝色，而菌落周围如有无色透明圈出现，说明淀粉已被水解。透明圈的大小一般说明水解淀粉能力的大小。

试验结果为淀粉水解阳性。

明胶水解试验

a. 培养基及试剂蛋白胨5g，明胶120g，蒸馏水1000mL。调节pH7.2~7.4，分装试管，培养基高度约为4~5cm，121℃灭菌20min。

b. 菌种培养及结果观察用穿刺法接种在试管中央。在30℃温箱中培养一个月，观察明胶是否液化。

试验结果为明胶水解阳性。

硝酸盐还原试验

a. 培养基及试剂蛋白胨10g，KNO₃1g，蒸馏水1000mL，pH7.0~7.4。格里斯氏（Gries）试剂：A液：对氨基苯磺酸0.5g、稀醋酸10wt%左右150mL；B液：蔡胺0.1g、蒸馏水20mL、稀醋酸10wt%150mL；二苯胺试剂：二苯胺0.5g溶于l00mL浓硫酸中，用20mL蒸馏水稀释。

b. 菌种培养及结果观察将试验菌接种于硝酸盐液体培养基中，30℃培养1、3、5天。在白色瓷盘小孔中倒入少许培养液，然后在其中分别滴1滴试剂A和B液，当培养液变为粉红色、玫瑰红色、橙色或棕色等时，表示有亚硝酸盐存在，为硝酸盐还原阳性，否则为阴性。

试验结果为硝酸盐还原阳性。

实施例3

为了进一步验证实施例2得到的石油烃降解菌JK2C的降解能力和最适条件，下面针对不同pH、不同石油浓度、不同温度、不同盐度、不同表面活性剂、不同碳源、不同氮源探索对石油降解率的影响。

取1 mL菌液（OD₆₀₀=0.8）接种于100 mL液体培养基中，建立降解体系并进行于30℃、180rpm条件下在摇床中避光培养10 d后分析降解体系中石油含量，以不接菌的处理作为对照。

采用重量法分析石油含量。具体方法为：在石油降解体系中加入20 mL石油醚，萃取培养基中的石油，重复操作3次；合并上层液，转至分液漏斗，剧烈震荡5 min，静置，待分层后进行分离。用石油醚洗涤三角瓶3次，再合并上层液。将其在58℃条件下蒸发，待石油醚完全蒸发，残留石油组分置于干燥器中冷却至恒重，称量。计算石油的降解率：

降解率=(m1-m2)／m × 100％

m—培养体系中初始石油质量(g)；

m1—对照组的残油质量(g)；

m2—样品的残油质量(g)。

将含有1%原油并以原油为唯一碳源的培养基分别调节到不同的pH6.5、7.5、8.5，取100mL装于250mL的三角瓶中，按1%（v/v）接种量接种（OD₆₀₀=0.8），建立降解体系并进行于30℃、180rpm条件下在摇床中避光培养10 d，10 d后分析降解体系中石油含量，以不接菌的处理作为对照。结果如图3所示，发现在pH6.5～8.5的范围内（此pH为北方土壤常见的pH），随着pH的升高，降解率呈现先增加后降低的趋势。当pH为6.5时，降解率只有10.8%，当pH为7.5时，降解率最大，达到50.3%，之后当pH继续升高，降解率开始下降，当pH为8.5时，降解仅为37.6%。表明该菌株对pH较为敏感，过高过低的pH均会抑制对石油的降解，最适的pH为7.5。

将液体培养基加入原油并以原油为唯一碳源，调节原油到不同的浓度0.5%（w/v）、1.0%（w/v）、1.5%（w/v）、2.0%（w/v）、2.5%（w/v），取100mL装于250mL的三角瓶中，按1%（v/v）接种量接种（OD₆₀₀=0.8），建立降解体系并进行培养于30℃、180rpm条件下在摇床中避光培养10 d，10 d后分析降解体系中石油含量，以不接菌的处理作为对照。结果如图4所示，在0.5～2.5%范围内，随着石油浓度的增加，降解率逐渐降低。石油浓度为0.5%时降解率最高，为56.7%，由此可见，菌株HNS-2具有较强的石油降解能力，有望用于石油污染的修复。

以含有1%原油并以原油为唯一碳源的培养基，取100mL装于250mL的三角瓶中，按1%（v/v）接种量接种（OD₆₀₀=0.8），建立降解体系，并在25℃、30℃和35℃、180rpm条件下在摇床中避光培养10 d，10 d后分析降解体系中石油含量，以不接菌的处理作为对照。结果如图5所示，发现随着温度的升高（温度在25～35℃之间），菌株对石油的降解率呈逐渐增加趋势，其中，温度达到35℃时，降解率最高，达到55.2%，而温度为25℃时，石油降解率最低，只有17.0%，表明该菌株最适温度为35℃，而当温度过低，降解率会急剧降低，因此该菌株不适合低温环境下对石油的修复。

将含有1%原油并以原油为唯一碳源的培养基，分别加入0.5%（w/v）、1.0%（w/v）、1.5%（w/v）、2.0%（w/v）NaCl，取100mL装于250mL的三角瓶中，按1%（v/v）接种量接种（OD₆₀₀=0.8），建立降解体系并进行培养于温度30℃、180rpm条件下在摇床中避光培养10 d，10 d后分析降解体系中石油含量，以不接菌的处理作为对照。结果如图6所示，随着培养基中盐度的增加，菌株对石油的降解率呈现先增加后降低的趋势，当培养基盐度为0时，菌株对石油的降解率最低，仅为35.5%时，当盐度增加到0.5%时，菌株对石油的降解率达到最大值77.4%，其后随着盐度的增加，菌株对石油的降解率稍有降低，维持在62.5～67.2%之间。表明适当的盐度有利于菌株对石油的降解，以0.5%为宜。这可能与微生物的长期生存环境有关，该菌株从中原油田附近土壤分离得到，该地区不仅受到石油污染，同时土壤中还有较高的盐分，微生物可能已经适应了高盐的生存环境。在油井周围的石油污染常伴随着高盐环境，这就要求降解菌不仅具有高效的石油降解能力，还需要有较强的耐盐能力。该菌株JK2C在0.5～2.0%的含盐范围内石油降解率均可达60%以上，因此尤其适合高盐石油污染土壤的修复。

将含有1%原油并以原油为唯一碳源的培养基，分别加入0.5%（w/v）的表面活性剂，表面活性剂有曲拉通X-100（TX-100）、十二烷基硫酸钠和吐温-80，取100mL装于250mL的三角瓶中，按1%（v/v）接种量接种（OD₆₀₀=0.8），建立降解体系并进行培养于温度30℃、180rpm条件下在摇床中避光培养10 d，10 d后分析降解体系中石油含量，以不接菌的处理作为对照。结果如图7所示，不添加表面活性剂菌株对石油的降解率为34.6%，添加TX-100（曲拉通X-100）和十二烷基硫酸钠均显著提高了菌株对石油的降解率，分别达到63.6%和67.3%，而添加Tween-80显著抑制了菌株对石油的降解，降解率仅为16.8%。

将含有1%原油并以原油为唯一碳源的培养基，分别加入1.0%（w/v）的碳源，碳源有葡萄糖、蔗糖、淀粉，取100mL装于250mL的三角瓶中，按1%（v/v）接种量接种（OD₆₀₀=0.8），建立降解体系并进行培养（30℃、180 rpm），10 d后分析降解体系中石油含量，以不接菌的处理作为对照。结果如图8所示，不加外源碳源菌株对石油的降解率为48.7%，而在培养基中添加葡萄糖、蔗糖和淀粉时，均不同程度抑制了菌株对石油的降解。其中，葡萄糖的抑制作用最大，降解率仅为9.7%；其次为蔗糖和淀粉，降解率为24.7%和36.%，这可能与不同碳源的生物可利用性有关，石油属疏水性物质，不易被微生物利用，而三种外源碳源均较石油容易被微生物利用，当这些碳源耗尽时，石油才可被进一步利用，从而被降解。三种外加碳源之中，葡萄糖为最容易利用，因此对石油的降解抑制作用最大。该现象提示当采用该菌用于降解石油时，应避免存在其它容易利用的碳源，否则会降低菌株对石油的降解率。

将含有1%原油并以原油为唯一碳源的培养基，分别加入1.0%（w/v）的氮源，氮源有硝酸铵、尿素、硝酸钾、硫酸铵、蛋白胨，取100mL装于250mL的三角瓶中，按1%（v/v）接种量接种（OD₆₀₀=0.8），建立降解体系并进行培养于30℃、180rpm条件下在摇床中避光培养10 d，10 d后分析降解体系中石油含量，以不接菌的处理作为对照。结果如图9所示，发现尿素作为氮源时，菌株对石油的降解率最高，达到54.9%，其次为硝酸钾、硝酸铵、硫酸铵和蛋白胨，降解率分别为31.4%、30.7%、24.7%和18.0%。

实施例4

本发明对石油污染土壤中石油的降解作用，下面通过盆栽试验进行说明。

采集自然条件下中原油田区含盐量较高的潮土0~20cm土层的新鲜土壤（经检测全盐含量为12571mg/kg、pH值为8.58)，采用等量添加法制备石油污染土壤，即先取等重的土壤与石油混合，再取2倍重量的土壤混合，直到石油含量为1%，老化30 d。取200g污染土壤装入玻璃杯中，按照表1进行处理，维持田间最大持水量的60%，自然培养即温度20℃～30℃条件下培养60d，取样分析石油含量。每个处理设4个重复。

采用重量法分析石油含量。具体方法为：称取5.00 g风干土样于50 mL离心管中，加入20 mL三氯甲烷，密封，超声提取15 min，离心处理，转速4000 r/min离心时间10 min，将上清液倒入烘至恒重的烧瓶中，重复萃取，如此反复3次，将上清液全部倒入烧瓶中，54℃旋转蒸发至干，在通风橱内挥发至恒重，称重测量。

取30 g 处理后的土壤平铺于培养皿，播种20粒水萝卜种子，表层敷上2～3 mm 厚土壤，维持最大田间持水量的60%，在恒温培养箱内培养，光照时间为8 h，温度25℃。培养第10d 统计种子发芽数，并计算发芽率。

试验中秸秆以粉碎的形式加入；菌株接种于以石油为唯一碳源的液体培养基，于30℃、180rpm条件下在摇床中避光培养7 d，即为菌剂；营养剂由KH2PO4 2 .0g、尿素 1.5 g和蒸馏水1 L配制而成；处理6中在培养第30 d第2次添加菌剂；处理8中扰动处理即每周翻土1次；SDS为十二烷基硫酸钠；TX-100为曲拉通X-100。

通过微宇宙实验研究了菌株JK2C对石油污染土壤的修复效果，以及不同强化措施对该过程的影响见图10。结果表明处理1即对照中有21.1%的石油被去除，这有可能是土著微生物的降解作用造成的。处理3石油降解率显著高于对照，达到46.3%，表明添加菌剂显著提高了石油的降解率，菌株JK2C具有降解土壤中石油的能力。处理4石油降解率为52.5%，高于处理3，表明添加营养剂一定程度上提高了菌株的石油降解率，有可能是营养剂中的氮和磷营养刺激了微生物代谢活性造成的。多个研究表明，在微生物修复石油污染土壤过程中，合适的C:N:P比非常重要，以100:10:0.3左右为宜，而对于多数老化石油污染土壤，碳元素含量过高，而氮和磷容易亏缺，由此可见适当的补充氮磷营养是一种重要的石油污染土壤修复措施。同时发现菌剂与营养剂的联合作用处理4的降解率大于单加营养剂处理2的降解率40.2%，提示菌株JK2C在石油污染土壤修复中发挥了重要作用。处理5的降解率56.3%高于处理4的降解率，表明添加秸秆一定程度上提高了石油的降解率，可能是由于秸秆增加了土壤的通气度，从而提高了微生物的代谢活性造成的。处理6的降解率50.5%低于处理5的降解率，而处理8的降解率66.1%显著高于处理5的降解率，表面投菌量对修复效果的影响较大，连续投菌有利于石油降解。处理7的降解率60.2%高于处理5的降解率，表明扰动可提高石油的降解率，与杨金凤等.2012的研究结果相似。事实上，翻耕土壤是一种常用辅助修复措施，其原理是通过增加土壤中氧气含量提高修复效率，这一现象在本研究中得到进一步验证。处理9的降解率61.5%高于处理5的降解率，而处理10的降解率52.5%低于处理5的降解率，SDS的效果优于TX-100。石油属于疏水性污染物，为了增加石油的生物可利用性，人们常常通过添加表面活性剂提高石油的降解率，本研究结果表面并非每种表面活性剂均可促进石油降解，有可能与表面活性剂本身毒性有关。

由此可知，采用菌株JK2C修复石油污染土壤是有效的，其修复效果与投菌量有较大关系，连续投菌有助于石油的降解；添加营养剂、SDS和秸秆，以及对土壤进行扰动，均可在一定程度上强化降解效果。

土壤中石油的降解并不一定意味着毒性的去除，石油的中间代谢产物仍可能存在毒性，如作为石油主要成分的多环芳烃，被降解后其产物仍具毒性，因此在实际修复过程中应对石油污染土壤做毒性评价，以确定不同修复措施的去毒效果。通过萝卜种子发芽试验评价了使用JK2C修复及其强化措施对土壤的去毒效果见图11，发现石油降解率与种子发芽率基本相符，即降解率越高，种子发芽率也越高，其中以“菌剂+营养剂+秸秆+扰动”的联合去毒效果最佳。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 河南省水文地质工程地质勘察院有限公司

<120> 一株石油降解菌及其应用

<130> 2015

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1179

<212> DNA

<213> 假单孢菌（Pseudomonas sp.）

<400> 1

gagaggatga tcagtcacac tggaactgag acacggtcca gactcctacg ggaggcagca 60

gtggggaata ttggacaatg ggcgaaagcc tgatccagcc atgccgcgtg tgtgaagaag 120

gtcttcggat tgtaaagcac tttaagttgg gaggaagggc agtaagttaa taccttgctg 180

ttttgacgtt accaacagaa taagcaccgg ctaacttcgt gccagcagcc gcggtaatac 240

gaagggtgca agcgttaatc ggaattactg ggcgtaaagc gcgcgtaggt ggttcagcaa 300

gttggatgtg aaatccccgg gctcaacctg ggaactgcat ccaaaactac tgagctagag 360

tacggtagag ggtggtggaa tttcctgtgt agcggtgaaa tgcgtagata taggaaggaa 420

caccagtggc gaaggcgacc acctggactg atactgacac tgaggtgcga aagcgtgggg 480

agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgtcgac tagccgttgg 540

gatccttgag atcttagtgg cgcagctaac gcgataagtc gaccgcctgg ggagtacggc 600

cgcaaggtta aaactcaaat gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt 660

taattcgaag caacgcgaag aaccttacct ggccttgaca tgctgagaac tttccagaga 720

tggattggtg ccttcgggaa ctcagacaca ggtgctgcat ggctgtcgtc agctcgtgtc 780

gtgagatgtt gggttaagtc ccgtaacgag cgcaaccctt gtccttagtt accagcacct 840

cgggtgggca ctctaaggag actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca 900

agtcatcatg gcccttacgg ccagggctac acacgtgcta caatggtcgg tacaaagggt 960

tgccaagccg cgaggtggag ctaatcccat aaaaccgatc gtagtccgga tcgcagtctg 1020

caactcgact gcgtgaagtc ggaatcgcta gtaatcgtga atcagaatgt cacggtgaat 1080

acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccatgg gagtgggttg ctccagaagt 1140

agctagtcta accgcaaggg ggacggtacc acggagggt 1179

Claims

1.一株石油烃降解菌，其特征在于：石油烃降解菌JK2C，分类名为假单胞菌（Pseudomonas sp.），已于2015年01月19日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为 CGMCC No.10366。

2.根据权利要求1所述石油烃降解菌于高盐环境下在提高石油污染土壤中石油降解率的应用，其特征在于：所述的高盐环境为含盐的质量百分比浓度0.2～2.0%的盐，所述盐包括NaCl 和/或Na₂SO₄。

3.根据权利要求1所述石油烃降解菌于高油土壤中在提高石油污染土壤的石油降解率的应用，其特征在于：所述的高油土壤为土壤中含有质量浓度0.1～2.5%的原油。

4.根据权利要求1所述石油烃降解菌于偏碱性土壤中在提高石油污染土壤的石油降解率的应用，其特征在于：所述偏碱性土壤即土壤的pH值为7.0～9.0。

5.根据权利要求1所述石油烃降解菌在提高石油污染土壤的石油烃降解率的应用，其特征在于：使用石油烃降解菌JK2C前，先将营养剂施入石油污染土壤，接着进行扰动处理，然后喷施石油烃降解菌JK2C，石油烃降解菌JK2C的使用量为30～60kg/亩；喷施石油烃降解菌JK2C后再对土壤进行扰动处理使得营养剂和石油烃降解菌JK2C与土壤混匀，其中土壤含水率18～22%，每年7～9月份进行施工。

6.根据权利要求5所述石油烃降解菌在提高石油污染土壤的石油烃降解率的应用，其特征在于施入营养剂的同时还加入秸秆400～600kg/亩。

7.根据权利要求5所述石油烃降解菌在提高石油污染土壤的石油烃降解率的应用，其特征在于所述营养剂的使用量：尿素15～20kg/亩、复合肥40～50kg/亩和乳化剂0.3～0.6kg/亩。

8.根据权利要求7所述石油烃降解菌在提高石油污染土壤的石油烃降解率的应用，其特征在于：所述乳化剂为十二烷基磺酸钠。

9.根据权利要求7所述石油烃降解菌在提高石油污染土壤的石油烃降解率的应用，其特征在于：所述复合肥中N:P₂O₅:K₂O的质量比为1:（0.5～2）:（0.5～2）。

10.根据权利要求5～9任一项所述石油烃降解菌在提高石油污染土壤的石油烃降解率的应用，其特征在于：所述扰动处理为初级耕作措施及次级耕作措施；所述初级耕作措施为翻耕、深松耕和旋耕中一种或一种以上；所述次级耕作措施为耙地、耱地、中耕和镇压中的一种或一种以上。