CN104830708A - 一株原油降解菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一株原油降解菌株及其应用，名称为D1，保藏编号为：CGMCC No.10287。本发明降解原油菌株直接从原油中筛选得到，具有分泌鼠李糖脂和降解原油的能力，并且少量甘油的添加能大幅促进原油的降解。本菌株利用30g/L的甘油或菜籽油分别可以获得11.5g/L和18.4g/L鼠李糖脂，菌株在1g/L原油的培养基中培养10d，原油的降解率为35.6％，在原油培养基中添加0.5g/L甘油，将原油降解率提高到了72.5％，本发明的菌株D1可以应用于鼠李糖脂生物表面活性剂的生产以及原油污染的生物修复，弥补了目前物理方法处理石油的不彻底性和化学法处理石油的污染性的缺陷。

Description

一株原油降解菌株及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一株原油降解菌株以及该菌株在生物修复中的应用。
背景技术
在石油的开采、运输和使用中，经常会有石油外泄或排放不当的情况发生。生物修复法是指烃降解微生物能够利用原油为碳源生长，把原油降解成其他低分子量的产物，具有经济、效果显著、环保等优点。
目前已发现具有原油降解能力的微生物菌株70属200余种。自然菌降解原油的效率普遍不高，石油烃污染物的生物可利用性是主要限制因素之一。
研究发现，生物表面活性剂能够显著促进石油的降解效率。生物表面活性剂是指由微生物分泌的同时具有亲水性基团和疏水性基团的化合物，鼠李糖脂是研究最常见的一种糖脂类生物表面活性剂。
一些有毒或难降解的物质很难被微生物直接利用，但添加易被微生物降解的物质如葡萄糖等，即可以促进或启动难降解物质的降解。
发明内容
本发明提供了一株原油降解菌株及其应用，该菌株是一株具有较高的降解原油能力和鼠李糖脂生产能力的铜绿假单胞菌菌株，可应用于原油污染环境的生物修复，本发明还提供了一种从原油中富集和分离微生物的方法。
本发明实现目的的技术方案如下：
一株原油降解菌株，名称为D1，分类名称为Pseudomonas aeruginosa，保藏编号为：CGMCC No.10287，保藏日期：2015年01月07日，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
而且，所述菌株具有鼠李糖脂生产能力和降解原油的能力。
原油降解菌株生产鼠李糖脂的应用。
而且，所述菌株利用甘油或菜籽油生产鼠李糖脂。
原油降解菌株在原油污染的生物修复中的应用。
而且，所述菌株在原油培养基中添加0.5g/L甘油，原油降解率为72.5％。
而且，所述菌株在10d内对原油的降解率为35.6％。
原油降解菌株的筛选方法，具体步骤如下：
⑴首先将原油中的微生物富集：将原油加入到无菌的无机盐培养基中，35℃恒温振荡培养，直到无色的无机盐培养基变的浑浊；
⑵菌株产鼠李糖脂与否的鉴定：将培养液用生理盐水稀释后涂布在CTAB琼脂平板上，菌落周围具有深蓝色晕圈说明菌株可以分泌鼠李糖脂；
⑶挑选一个菌落保存，由于菌株直接从原油中筛选得到，具有一定的原油降解能力。
原油降解菌株降解石油污染的方法，利用补充限量甘油的无机盐培养基培养菌株D1，将培养物直接喷洒在泄露的原油表面，或者与原油污染的土壤混合，或者接种到原油污染的水域即可。
而且，所述无机盐培养基：NaCl 1g/L、KCl 1g/L、NaNO3 6g/L、KH2PO4 3g/L、Na2HPO4g/L 0.3、MgSO4 2.5g/L、CaCl2 1g/L、微量元素溶液1mL/L，培养基的pH为6.8，微量元素溶液配方为：FeCl3 0.16g/L、ZnSO4 1.5g/L、CuSO4 0.15g/L、MnSO4 1.5g/L、H3BO3 1.5g/L。
本发明的取得的优点和有益效果是：
1、本发明提供的原油降解菌株降解原油能力强，菌株在以原油为唯一碳源的培养基中生长良好，细菌浓度(cfu/mL)增加到了4.7×109，且通过10d的培养将原油的浓度从0.78g/L降低到了0.60g/L。进而通过向原油培养基中添加少量甘油，结果证明能够大大加快原油降解的效率，原油浓度下降到了0.22g/L。弥补了目前仍采用物理或化学等去除原油的方法，以及自然界的微生物原油降解效率低下的缺陷；同时，由于该原油降解菌株具有较强的鼠李糖脂生产能力，能够应用于鼠李糖脂大规模生产。
2、本发明提供的原油降解菌株的分离方法主要利用在富集培养基和选择性培养基上来富集和分离菌株，通过16S rRNA鉴定菌株，并且通过测定鼠李糖脂浓度和培养基残余原油浓度测定分离菌株的鼠李糖脂生产能力和原油降解能力，工艺相对简单，筛选菌株准确，为微生物法治理原油污染提供了新思路。
附图说明：
图1为本发明筛选方法筛选出的1株菌株在CTAB琼脂平板上的生长情况；
图2为本发明1株分离菌株在不同碳氢化合物培养基中的生长情况；
图3为本发明分离菌株发育树的构建图；
图4为本发明原油浓度测定方法中原油溶液的全波长扫描；
图5为本发明中菌株对原油降解能力；
图6为本发明少量甘油对原油降解的影响，图6-1为添加甘油前后原油降解效果图；图6-2为添加甘油前后菌落数对比图；图6-3为添加甘油前后原油浓度对比图。
具体实施方式：
下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
本发明直接从原油中筛选得到一株细菌，通过鉴定确定筛选菌株为铜绿假单胞菌。此菌株具有分泌鼠李糖脂的能力，和原油降解能力，且在原油降解过程中添加少量的甘油能够有效促进原油降解。
需要说明的是：菌株直接从原油中分离得到，且培养基中只含有原油一种碳源，菌株对原油具有一定的利用能力，即菌株能够一定程度上降解原油。
原油降解菌株的筛选方法，步骤如下：
1、样品来自于天津市渤海石油钻井平台的轻质原油。
2、原油中微生物的富集：量取5mL轻质原油加入盛有60mL无机盐培养基的250mL摇瓶中，黑色原油漂浮在上层，下层为无色透明液体。35℃恒温振荡培养，每天观察摇瓶内培养液。大约一周后，下层无色透明液体变为浑浊的棕色，可看到原油小液滴悬浮在无机盐培养液中，静置后原油液滴即汇集到上层。无色透明培养基变浑浊说明细菌大量生长，由于培养基中只含有原油一种碳源，因此细菌能够利用原油生长；原油变成小液滴，说明细菌可能能够分泌表面活性剂等类似物质，将疏水性的原油包埋在培养基中供细菌利用。
3、菌株是否分泌鼠李糖脂的鉴定：吸取1mL培养一周后的培养液，用生理盐水分别稀释10-2、10-4、10-6，随后吸取100μL稀释液涂布在CTAB琼脂平板上。37℃恒温培养后，平板上生长出了形态均一的菌落，且菌落周围都存在一个深蓝色的晕圈。
4、菌株对不同碳氢化合物利用能力分析：以细菌的增长数量表征分离菌株对碳氢化合物的利用能力。将分离菌D1分别接种到含5g/L不同碳氢化合物(柴 油、正己烷、液体石蜡、原油、菜籽油、甘油)的发酵培养基中，35℃、200r/min振荡培养。每24h取样，用生理盐水稀释合适倍数后涂布在LB平板上培养并计数，计算出发酵液中细菌的浓度(cfu/mL)。
5、原油降解效率的测定：将原油溶解在石油醚(沸程30-60℃)中，其在紫外波长处的吸光度与原油浓度成正比，可以根据其吸光度值定量分析石油的浓度。将分离菌株D1接种在原油培养基中振荡培养，每2d取出样品分析剩余原油浓度。测定方法为在培养基中加入等体积石油醚充分振荡，使原油溶解在石油醚中，测定溶液的吸光度值，根据标准曲线换算出原油浓度。采用此方法测定原油的降解曲线，进一步地，在原油培养基中添加少量甘油，分析甘油对原油降解的作用。
6、分离菌株的菌种鉴定：
(1)DNA提取方法：苯酚-氯仿-异戊醇抽提法。
(2)16S rRNA引物：正向引物：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’(E.coli bases 8to 27)，反向引物：5’-TACCTTGTTACGACTT-3’(E.coli bases 1507to1492)，由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。
(3)PCR反应体系：10×Reaction Buffer 5.0μL，dNTP(2.5mmol/L)4.0μL，正向引物(10μmol/L)1.0μL，反向引物(10μmol/L)1.0μL，Taq聚合酶(5U/μL)0.8μL，DMSO 1μL，模版DNA(50ng/μL)2.0μL，补加重蒸水至50μL。
(4)PCR扩增程序：94℃ 5min；94℃ 1min，51℃ 1min，72℃ 1.5min，30个循环；72℃ 10min；4℃ 2h。
(5)数据处理：纯化PCR产物并测序，使用NCBI Blast分析分离菌株的同源性，并使用MEGA5.0作菌株的系统发育进化树。
本发明通过该方法从原油中直接筛选到一株细菌P.aeruginosa D1，具有分泌鼠李糖脂和降解原油能力。其中，利用30g/L甘油和菜籽油发酵能得到11.5g/L和18.4g/L鼠李糖脂。菌株D1具有利用原油和柴油生长的能力，经过5d的培养，细菌的浓度分别增加到了4.7×109和4.0×109cfu/mL。将P.aeruginosa D1接种到1.0g/L的原油培养基中培养10d，原油浓度下降到了0.60g/L，在原油培养基中添加0.5g/L的甘油，将原油浓度下降到了0.22g/L。所筛选到的P.aeruginosa D1在生物修复方面具有较好的应用潜力，且限量甘油的添加能显著提高石油降 解效率。
采用上述方法筛选保藏编号为CGMCC No.10287的原油降解菌株，步骤中用到的相关培养基、设备和方法叙述如下：
一、降解原油菌株的富集和分离
所用试剂均为市售分析纯或生化试剂；
所使用的仪器主要包括：恒温摇床，恒温培养箱；
所用培养基： 
无机盐培养基：NaCl 1g/L、KCl 1g/L、NaNO3 6g/L、KH2PO4 3g/L、Na2HPO4g/L 0.3、MgSO4 2.5g/L、CaCl2 1g/L、微量元素溶液1mL/L，培养基的pH为6.8，微量元素溶液配方为：FeCl3 0.16g/L、ZnSO4 1.5g/L、CuSO4 0.15g/L、MnSO4 1.5g/L、H3BO3 1.5g/L；
CTAB琼脂平板培养基：KH2PO4 0.7g/L、Na2HPO4 0.9g/L、NaNO3 2g/L、MgSO4 0.4g/L、CaCl2 0.1g/L、甘油20g/L、CTAB 0.2g/L、亚甲基蓝0.005g/L、微量元素母液1mL/L、琼脂粉15g/L；
LB培养基：NaCl 10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，pH 7.0，1×105Pa、121℃，灭菌20min。
富集和分离步骤如下：
向无菌无机盐培养基中添加5mL原油，37℃摇床培养。待摇瓶内培养基变浑浊后取样用生理盐水(0.9％NaCl)稀释后涂布在CTAB-亚甲基蓝琼脂平板上，37℃培养。选择在CTAB琼脂平板上菌落周围出现深蓝色晕圈最大的菌株，三区划线纯化后保存，命名为D1。
结果：
大约一周后，下层无色透明液体变为浑浊的棕色，可看到原油小液滴悬浮在无机盐培养液中，静置后原油液滴即汇集到上层。吸取1mL培养一周后的培养液，用生理盐水分别稀释10-2、10-4、10-6，随后吸取100μL稀释液涂布在CTAB琼脂平板上。37℃恒温培养后，平板上生长出了形态均一的菌落，且菌落周围都存在一个深蓝色的晕圈。图1为10-6稀释液在平板上的形态。挑选一个菌落三区划线纯化并保存，命名为D1，分类名称为Pseudomonas aeruginosa，保藏编号为：CGMCC No.10287，保藏日期：2015年01月07日，北京市朝阳区北辰西 路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
二、筛选菌株D1鼠李糖脂生产能力分析
所用试剂均为市售分析纯或生化试剂；
所使用的仪器主要包括：恒温摇床，恒温培养箱；
所用培养基：LB培养基：NaCl 10g/L，蛋白胨10g/L,，酵母粉5g/L，pH 7.0，1×105Pa、121℃，灭菌20min。
发酵培养基：菜籽油或甘油30g/L、NaCl 1g/L、KCl 1g/L、NaNO36g/L、KH2PO4 3g/L、Na2HPO4g/L 0.3、MgSO4 2.5g/L、CaCl2 1g/L、微量元素溶液1mL/L，培养基的pH为6.8，微量元素溶液配方为：FeCl3 0.16g/L、ZnSO4 1.5g/L、CuSO4 0.15g/L、MnSO4 1.5g/L、H3BO3 1.5g/L；
鼠李糖脂生产能力分析步骤如下：
将所筛选到菌接D1到5mL LB培养基中置于37℃过夜培养，然后将每株菌按3％的接种量分别接种到两种发酵培养基中，35℃、200r/min振荡培养72h。将发酵液12000r/min离心10min，上清液稀释合适的倍数后取1.25mL稀释液与2.5mL蒽酮硫酸溶液于冰浴中混合，并沸水浴15min使反应完全，待温度降到室温左右测定反应液在625nm下的吸光度值。测定反应液的吸光度值(OD625)，代入标准曲线公式后计算出鼠李糖的浓度并乘以换算指数3.4算出鼠李糖脂含量。
观察结果： 
在摇瓶水平分别以甘油和菜籽油为碳源对菌株D1进行发酵产鼠李糖脂分析。将菌株D1分别接种到含30g/L菜籽油或甘油的无机盐培养基中，37℃发酵72h后分别测定鼠李糖脂产量。以甘油为碳源发酵后得到了11.5g/L鼠李糖脂，而以菜籽油为碳源发酵后获得了18.4g/L鼠李糖脂，将产量提高了60.0％。
三、筛选菌株D1对碳氢化合物利用能力分析
所用试剂均为市售分析纯或生化试剂；
所使用的仪器主要包括：恒温摇床，恒温培养箱；
所用培养基： 
LB培养基：NaCl 10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，pH 7.0，1×105Pa、121℃，灭菌20min；
无机盐培养基：NaCl 1g/L、KCl 1g/L、NaNO3 6g/L、KH2PO4 3g/L、Na2HPO4g/L 0.3、MgSO4 2.5g/L、CaCl2 1g/L、微量元素溶液1mL/L，培养基的pH为6.8，微量元素溶液配方为：FeCl3 0.16g/L、ZnSO4 1.5g/L、CuSO4 0.15g/L、MnSO4 1.5g/L、H3BO3 1.5g/L；
细菌对碳氢化合物利用能力分析步骤如下：
实验以细菌的增长数量表征分离菌株对碳氢化合物的利用能力。将分离菌D1分别接种到含5g/L不同碳氢化合物(柴油、正己烷、液体石蜡、原油、菜籽油、甘油)的发酵培养基中，35℃、200r/min振荡培养。每24h取样，用生理盐水稀释合适倍数后涂布在LB平板上培养并计数，计算出发酵液中细菌的浓度(cfu/mL)。
实验结果： 
将过夜培养的P.aeruginosa D1种子液接种到含不同碳氢化合物的液体培养基中，35℃振荡培养5d。每天取样稀释后涂布LB平板，通过菌落计数法计算培养液中细菌的浓度。以细菌数(cfu/mL)为纵坐标，时间为横坐标做细菌生长曲线，如图5。由图可以看出，P.aeruginosa D1对原油、柴油具有较强的利用能力，经过5d的培养，细菌数分别增加到了原来的39.2倍和33.9倍。
四、原油降解效率的测定
所用试剂均为市售分析纯或生化试剂；
所使用的仪器主要包括：恒温摇床，恒温培养箱；
所用培养基： 
原油培养基：原油1g/L、NaCl 1g/L、KCl 1g/L、NaNO3 6g/L、KH2PO4 3g/L、Na2HPO4g/L 0.3、MgSO4 2.5g/L、CaCl2 1g/L、微量元素溶液1mL/L，培养基的pH为6.8，微量元素溶液配方为：FeCl3 0.16g/L、ZnSO4 1.5g/L、CuSO4 0.15g/L、MnSO4 1.5g/L、H3BO3 1.5g/L；
原油降解效率分析方法：
将原油溶解在石油醚(沸程30-60℃)中，其在紫外波长处的吸光度与原油浓度成正比，可以根据其吸光度值定量分析石油的浓度。将分离菌株D1接种在原油培养基中振荡培养，每2d取出样品分析剩余原油浓度。测定方法为在培养基中加入等体积石油醚充分振荡，使原油溶解在石油醚中，测定溶液的吸光度值， 根据标准曲线换算出原油浓度。采用此方法测定原油的降解曲线，进一步地，在原油培养基中添加少量甘油，分析甘油对原油降解的作用。
结果：
将P.aeruginosa D1接种到含原油1g/L的无机盐培养中，35℃，200r/min培养。每2d取样测定培养基原油浓度。以原油浓度为纵坐标，分解时间为横坐标作得图。结果显示，经过12d的培养，培养基中的原油浓度从0.78g/L下降到了0.6g/L。
配制两种原油培养基，一种含有1g/L的原油，一种除1g/L的原油外，另添加0.5g/L的甘油，每种培养基做三个平行测定。与上述相同，接种P.aeruginosa D1后，每24h取样涂板计数。由图6可见，图6-1图中添加甘油的培养基明显更加浑浊，只有原油的培养基中黑色原油被包成小团，可能不能充分利用。而图6-2图看出，添加甘油后，细菌生长速度明显提高，且最终细菌浓度也高于以原油为唯一碳源的组。
添加限量甘油对P.aeruginosa D1的生长有很强的促进作用，进一步地，对其进行原油降解效率的分析。同样将P.aeruginosa D1接种到两种原油培养基中，35℃，200r/min振荡培养，每隔2d测定原油含量。结果如图6-3所示，添加限量甘油后原油降解的效率大幅增加。
五、筛选菌株D1的菌种鉴定： 
所用试剂均为市售分析纯或生化试剂；
所使用的仪器主要包括：恒温振荡器，PCR仪；
所用的培养基为LB培养基：NaCl 10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，调pH 7.0后，121℃，灭菌20min。
菌种鉴定步骤如下：
将分离出来的部分高耐受高强度降解仲丁醇的菌株接种在LB培养基上，过夜培养，待用。
按如下操作进行：
(1)按照苯酚-氯仿-异戊醇抽提法提取菌体DNA。
(2)苯酚-氯仿-异戊醇抽提法步骤如下：
a.、取1.5mL过夜培养的菌液，离心8000rpm 5min后，弃上清；
b、沉淀中加入0.5mL TE缓冲液，10uL溶菌酶，室温放置10min；
c、加入10ul 20％的SDS和50ul蛋白酶K，震荡混匀，于60℃水浴2h；
d、加入0.6mL抽提液(苯酚：氯仿：异戊醇＝25:24:1)充分混匀，10000rpm离心10min；
e、吸取上清，重复抽提至无蛋白膜，加等体积氯仿混匀，离心10000rpm 10min；
f、吸取上清于新EP管加10％上清体积的3Mol/LNaAc和2倍上清体积的95％冷乙醇，震荡混匀，10000rpm离心10min；
g.沉淀中加600uL 70％乙醇，10000rpm离心5min弃上清后室温干燥，加100uL ddH2O，冰箱保存。
(3)16S rRNA引物：正向引物：5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3＇(E.coli bases 8to 27)，反向引物：5＇-TACCTTGTTACGACTT-3＇(E.coli bases 1507to1492)。
(4)PCR反应体系：10×Reaction Buffer 5.0μL，dNTP(2.5mmol/L)4.0μL，正向引物(10uMol/L)1.0μL，反向引物(10μMol/L)1.0μL，Taq聚合酶(5U/μL)0.8μL，DMSO 1μL，模版DNA(50ng/μL)2.0μL，补加重蒸水至50μL。
(5)PCR扩增程序：94℃ 5min；94℃ 40s；51℃ 2min；72℃ 3min 30个循环；72℃ 15min；4℃ 2h。PCR结果如图4所示。
(6)数据处理：凝胶纯化PCR，使用NCBI Blast分析分离菌株的同源性，并使用MEGA5.0软件作菌株的系统发育进化树。
结果：
以菌株的基因组DNA为模板，27F和1492R为引物对16S rRNA基因进行扩增并测序。将获得的16S rRNA基因序列使用NCBI网站数据库中的blastn工具进行比对，发现其与Pseudomonas aeruginosa GF 16S ribosomal RNAgene(KJ754135)的相似度达到100％。采用MEGA5软件构建系统发育树，如图2。由图中确定本分离菌为铜绿假单胞菌，命名为P.aeruginosa D1，将其16S rRNA基因序列提交到Genbank网站上，获得登录号KP222279.1。
六、应用实施例
利用补充限量甘油的无机盐培养基培养菌株D1，将培养物直接喷洒在泄露的原油表面，或者与原油污染的土壤混合，或者接种到原油污染的水域，同时根 据实际情况，补充必要的营养，保证菌株D1在各种环境中的生物量的增加和鼠李糖脂的合成，并最终完成原油的快速降解。
无机盐培养基：NaCl 1g/L、KCl 1g/L、NaNO3 6g/L、KH2PO4 3g/L、Na2HPO4g/L 0.3、MgSO4 2.5g/L、CaCl2 1g/L、微量元素溶液1mL/L，培养基的pH为6.8，微量元素溶液配方为：FeCl3 0.16g/L、ZnSO4 1.5g/L、CuSO4 0.15g/L、MnSO4 1.5g/L、H3BO31.5g/L；
本发明的P.aeruginosa D1的16S rRNA序列如下：

Claims (10)

1.一株原油降解菌株，其特征在于：名称为D1，分类名称为Pseudomonasaeruginosa，保藏编号为：CGMCC No.10287，保藏日期：2015年01月07日，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.根据权利要求1所述的原油降解菌株，其特征在于：所述菌株具有鼠李糖脂生产能力和降解原油的能力。
3.如权利要求1所述的原油降解菌株生产鼠李糖脂的应用。
4.根据权利要求3所述原油降解菌株生产鼠李糖脂的应用，其特征在于：所述菌株利用甘油或菜籽油生产鼠李糖脂。
5.如权利要求1所述的原油降解菌株在原油污染的生物修复中的应用。
6.根据权利要求5所述原油降解菌株在原油污染的生物修复中的应用，其特征在于：所述菌株在原油培养基中添加0.5g/L甘油，原油降解率为72.5％。
7.根据权利要求5所述的原油降解菌株在原油污染的生物修复中的应用，其特征在于：所述菌株在10d内对原油的降解率为35.6％。
8.权利要求1中原油降解菌株的筛选方法，其特征在于：具体步骤如下：
⑴首先将原油中的微生物富集：将原油加入到无菌的无机盐培养基中，35℃恒温振荡培养，直到无色的无机盐培养基变的浑浊；
⑵菌株产鼠李糖脂与否的鉴定：将培养液用生理盐水稀释后涂布在CTAB琼脂平板上，菌落周围具有深蓝色晕圈说明菌株可以分泌鼠李糖脂；
⑶挑选一个菌落保存，由于菌株直接从原油中筛选得到，具有一定的原油降解能力。
9.利用权利要求1所述的原油降解菌株降解石油污染的方法，其特征在于：利用补充限量甘油的无机盐培养基培养菌株D1，将培养物直接喷洒在泄露的原油表面，或者与原油污染的土壤混合，或者接种到原油污染的水域即可。
10.根据权利要求9所述的原油降解菌株降解石油污染的方法，其特征在于：所述无机盐培养基：NaCl 1g/L、KCl 1g/L、NaNO36g/L、KH2PO43g/L、Na2HPO4g/L 0.3、MgSO42.5g/L、CaCl21g/L、微量元素溶液1mL/L，培养基的pH为6.8，微量元素溶液配方为：FeCl30.16g/L、ZnSO41.5g/L、CuSO40.15g/L、MnSO41.5g/L、H3BO31.5g/L。
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