CN102533601A - 一株简单芽孢杆菌及其培养方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株简单芽孢杆菌（Bacillussimplex）YM8CGMCCNo.5242及其培养方法与应用。简单芽孢杆菌YM8的培养方法是先将菌种接种于种子培养基中，35℃或55℃、120转/分摇床中培养至菌体浓度达108～109个/mL，然后接种5mL菌液至发酵培养基中，35℃或55℃、120转/分摇床培养。本发明提供的简单芽胞杆菌YM8，可应用于油田的环境治理，具有很好的降解原油的作用，具有较高的研究、应用及市场价值；此外，该菌培养方法简单易操作，生长繁殖迅速，具有扩大化生产的可行性。
Description
技术领域
本发明涉及一株菌种及其培养方法与应用，具体涉及一株简单芽孢杆菌及其培养方法与应用。
背景技术
石油开采、运输、加工及利用过程中往往会产生污染，甚至是大面积的污染。利用生物修复技术（也称生物整治、生物恢复、生态修复或生态恢复，是指利用处理系统中的生物，主要是微生物的代谢活动来减少污染现场污染物的浓度或使其无害化的过程）可以广泛地应用于原油污染环境进行治理。微生物治理原油污染是微生物对一些难降解的原油组分的降解，是通过一系列氧化酶的催化作用完成的。在自然界中这一过程通常由多种微生物的协同作用来完成，速度比较缓慢。利用其它芽孢杆菌降解原油的案例很多，但是利用简单芽孢杆菌降解原油研究目前还是空白。
发明内容
本发明的目的是提供能降解原油组分、应用于现场微生物油田环境治理的简单芽孢杆菌及其培养方法与应用。
本发明所采用的技术方案是：
一株简单芽孢杆菌（Bacillus simplex）YM8 CGMCC No.5242，其16S rDNA基因序列为：
TTAGCGGCTGGCTCCATGAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGGCTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGAGAATGGCTTTATGGGATTCGCTTACCTTCGCAGGTTTGCAGCCCTTTGTACCATCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGTCCCCCGAAGGGGAAAGCCCTATCTCTAGGGTTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAAGGGCGGAAACCCTCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGTGTCAGTTACAGACCAGAAAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCAAATCTCTACGCATTTCACCGCTACACTTGGAATTCCACTTTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCACGGTTGAGCCGTGGGCTTTCACATCAGACTTAAGGAACCACCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTACCAGCAGTTACTCTGGTACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAACTTTACGACCCGAAGGCCTTCTTCGTTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTCGCCTTGGTGAGCCATTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGCCCATCTATAAGTGACAGCGTAAACCGTCTTTCCATCTTCTCTCATGCGAGAAAAGAACGTATCCGGTATTAGCTCCGGTTTCCCGAAGTTATCCCAGTCTTATAGGCAGGTTGCCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAATCTCAGGGAGCAAGCTCCCATCGATTCGCTCGACTGCATTATAGCCCC
上述16S rDNA基因序列的长度为1431个核苷酸。
一株简单芽孢杆菌（Bacillus simplex）YM8 CGMCC No.5242的培养方法，是先将简单芽孢杆菌（Bacillus simplex）YM8 CGMCC No.5242接种于种子培养基中，35℃或55℃、120转/分摇床中培养至菌体浓度达108～109个/mL，然后接种5mL菌液至发酵培养基中，35℃或55℃、120转/分摇床培养；
所述的种子培养基的配方为：
葡萄糖2.0g、玉米浆 0.8g、磷酸氢二钠 0.1g、磷酸二氢钾 0.05g、硝酸钠 0.2g、硫酸镁 0.05g、氯化钠 0.1g、氯化钙 0.005g、水100mL、PH 7.2-7.4；
所述的发酵培养基的配方为：
原油20g、玉米浆 1.6g、磷酸氢二钠 0.15g、磷酸二氢钾 0.1g、硝酸钠 0.3g、硫酸镁 0.05g、氯化钠 0.1g、氯化钙 0.005g 、水100mL、PH 7.2-7.4。
所述的一株简单芽孢杆菌（Bacillus simplex）YM8 CGMCC No.5242在降解原油组分中的应用。
所述的一株简单芽孢杆菌（Bacillus simplex）YM8 CGMCC No.5242在治理原油污染中的应用。
本发明具有以下优点：
本发明提供的简单芽胞杆菌YM8，可应用于油田的环境治理。该石油烃降解菌具有很好的降解原油的作用，即使在矿化度1×105mg/l条件下也同样适用。其可将原油中的非烃含量从9.01%降至6.18%，将沥青质含量从6.58%降至5.15%，同时芳烃含量从13.86%增加到15.98%，饱和烃含量从70.02%增加到70.79%，原油黏度从49mPa??s降到24mPa??s，降粘率达到51.5%。借此开发的生物制剂，用于油田或环境的污染治理与清洁，具有较高的研究、应用及市场价值；此外，该菌培养方法简单易操作，生长繁殖迅速，具有扩大化生产的可行性。
附图说明
图1为简单芽孢杆菌YM8作用前后原油色谱分析图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细的说明。
本发明所涉及的简单芽孢杆菌（Bacillus simplex）YM8，已于2011年9月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5242。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂。
以下实施例中所涉及的培养基为：蛋白胨、牛肉膏、NaCl 、琼脂、葡萄糖、玉米桨、硝酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钙、硫酸镁、香柏油、二甲苯、结晶紫、草酸铵。
一、简单芽孢杆菌（Bacillus simplex）YM8 CGMCC No.5242的分离纯化、筛选与培养：
1、菌种的分离纯化
将采自延长油田采油厂两个实验区的样品通过常规倍比稀释制备成稀释液后分别接种于基础培养基（蛋白胨 1.0g、牛肉膏0.3g、NaCl 0.5g、琼脂2.0g、100mL水、pH值7.2-7.4）和葡萄糖培养基（葡萄糖2.0g、玉米桨0.4g、硝酸钠 0.2g、磷酸氢二钠 0.05g、磷酸二氢钾 0.05g、氯化钙 0.005g、硫酸镁 0.05g、琼脂 2.0g、100mL水、pH值 7.2）平板上，于35℃和50℃分别培养1～2天，挑取单菌落接种于新的培养基平板培养2～3天，生物显微镜观察是否为单一菌种，若有杂菌，则需再次分离、纯化，直到获得纯培养。经分离培养后共获得17个微生物纯培养。
2、菌种筛选和培养
对分离出的17株微生物株菌进行降烃能力的研究。
先将菌株接种于种子培养基（葡萄糖2.0g、玉米浆 0.8g、磷酸氢二钠 0.1g、磷酸二氢钾 0.05g、硝酸钠 0.2g、硫酸镁 0.05g、氯化钠 0.1g、氯化钙 0.005g、水100mL、PH 7.2-7.4）中，35℃或55℃、120转/分摇床培养至菌体浓度达108～109个/mL，接种5mL至发酵培养基（原油20g、玉米浆 1.6g、磷酸氢二钠 0.15g、磷酸二氢钾 0.1g、硝酸钠 0.3g、硫酸镁 0.05g、氯化钠 0.1g、氯化钙 0.005g 、水100mL、PH 7.2-7.4）中，35℃或55℃、120转/分摇床培养。
二、简单芽孢杆菌YM8的鉴定。
1、菌落特征：乳白色边缘不规则的小菌落。
2、细胞形态及生理生化特性：
表1 简单芽孢杆菌YM8的细胞形态及生理生化特性表
3、16S rRNA基因序列测定结果：
TTAGCGGCTGGCTCCATGAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGGCTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGAGAATGGCTTTATGGGATTCGCTTACCTTCGCAGGTTTGCAGCCCTTTGTACCATCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGTCCCCCGAAGGGGAAAGCCCTATCTCTAGGGTTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAAGGGCGGAAACCCTCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGTGTCAGTTACAGACCAGAAAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCAAATCTCTACGCATTTCACCGCTACACTTGGAATTCCACTTTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCACGGTTGAGCCGTGGGCTTTCACATCAGACTTAAGGAACCACCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTACCAGCAGTTACTCTGGTACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAACTTTACGACCCGAAGGCCTTCTTCGTTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTCGCCTTGGTGAGCCATTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGCCCATCTATAAGTGACAGCGTAAACCGTCTTTCCATCTTCTCTCATGCGAGAAAAGAACGTATCCGGTATTAGCTCCGGTTTCCCGAAGTTATCCCAGTCTTATAGGCAGGTTGCCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAATCTCAGGGAGCAAGCTCCCATCGATTCGCTCGACTGCATTATAGCCCC
三、简单芽孢杆菌YM8降解原油能力。
简单芽孢杆菌YM8对微生物作用后原油性质的改变情况，对简单芽孢杆菌YM8作用后原油组分进行了色谱分析，结果见表1，图1。从表中可以看出，经简单芽孢杆菌YM8作用后原油组分中沥青质、非烃及芳烃类含量均发生变化。
通过矿化度在1×105mg/L的条件下，不同给养量对简单芽孢杆菌YM8的生长影响，及其对原油粘度、凝点的改变情况的检测结果显示，简单芽孢杆菌YM8可作为石油烃降解菌，接种至斜面保存。
表2 简单芽孢杆菌YM8作用前后原油组分变化
四、简单芽孢杆菌YM8对原油粘度、凝点的改变情况。
表3 转速120转/分条件下原油粘度、凝点测定结果
表4 转速80转/分条件下原油粘度、凝点测定结果
结果显示，简单芽孢杆菌YM8能降低原油凝点及原油粘度，有利于原油的清理。
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<120> 一株简单芽孢杆菌及其培养方法与应用
<130> 2012-1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1431
<212> DNA
<213> 简单芽孢杆菌（Bacillus simplex）
<400> 1
ttagcggctg gctccatgaa ggttacctca ccgacttcgg gtgttacaaa ctctcgtggt 60
gtgacgggcg gtgtgtacaa ggcccgggaa cgtattcacc gcggcatgct gatccgcgat 120
tactagcgat tccggcttca tgcaggcgag ttgcagcctg caatccgaac tgagaatggc 180
tttatgggat tcgcttacct tcgcaggttt gcagcccttt gtaccatcca ttgtagcacg 240
tgtgtagccc aggtcataag gggcatgatg atttgacgtc atccccacct tcctccggtt 300
tgtcaccggc agtcacctta gagtgcccaa ctgaatgctg gcaactaaga tcaagggttg 360
cgctcgttgc gggacttaac ccaacatctc acgacacgag ctgacgacaa ccatgcacca 420
cctgtcactc tgtcccccga aggggaaagc cctatctcta gggttgtcag aggatgtcaa 480
gacctggtaa ggttcttcgc gttgcttcga attaaaccac atgctccacc gcttgtgcgg 540
gcccccgtca attcctttga gtttcagcct tgcggccgta ctccccaggc ggagtgctta 600
atgcgttagc tgcagcacta aagggcggaa accctctaac acttagcact catcgtttac 660
ggcgtggact accagggtat ctaatcctgt ttgctcccca cgctttcgcg cctcagtgtc 720
agttacagac cagaaagtcg ccttcgccac tggtgttcct ccaaatctct acgcatttca 780
ccgctacact tggaattcca ctttcctctt ctgcactcaa gttccccagt ttccaatgac 840
cctccacggt tgagccgtgg gctttcacat cagacttaag gaaccacctg cgcgcgcttt 900
acgcccaata attccggaca acgcttgcca cctacgtatt accgcggctg ctggcacgta 960
gttagccgtg gctttctggt taggtaccgt caaggtacca gcagttactc tggtacttgt 1020
tcttccctaa caacagaact ttacgacccg aaggccttct tcgttcacgc ggcgttgctc 1080
cgtcagactt tcgtccattg cggaagattc cctactgctg cctcccgtag gagtctgggc 1140
cgtgtctcag tcccagtgtg gccgatcacc ctctcaggtc ggctacgcat cgtcgccttg 1200
gtgagccatt acctcaccaa ctagctaatg cgccgcgggc ccatctataa gtgacagcgt 1260
aaaccgtctt tccatcttct ctcatgcgag aaaagaacgt atccggtatt agctccggtt 1320
tcccgaagtt atcccagtct tataggcagg ttgcccacgt gttactcacc cgtccgccgc 1380
taatctcagg gagcaagctc ccatcgattc gctcgactgc attatagccc c 1431
Claims (4)
1.一株简单芽孢杆菌（Bacillus simplex）YM8 CGMCC No.5242，其16S rDNA基因序列为：
TTAGCGGCTGGCTCCATGAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGGCTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGAGAATGGCTTTATGGGATTCGCTTACCTTCGCAGGTTTGCAGCCCTTTGTACCATCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGTCCCCCGAAGGGGAAAGCCCTATCTCTAGGGTTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAAGGGCGGAAACCCTCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGTGTCAGTTACAGACCAGAAAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCAAATCTCTACGCATTTCACCGCTACACTTGGAATTCCACTTTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCACGGTTGAGCCGTGGGCTTTCACATCAGACTTAAGGAACCACCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTACCAGCAGTTACTCTGGTACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAACTTTACGACCCGAAGGCCTTCTTCGTTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTCGCCTTGGTGAGCCATTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGCCCATCTATAAGTGACAGCGTAAACCGTCTTTCCATCTTCTCTCATGCGAGAAAAGAACGTATCCGGTATTAGCTCCGGTTTCCCGAAGTTATCCCAGTCTTATAGGCAGGTTGCCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAATCTCAGGGAGCAAGCTCCCATCGATTCGCTCGACTGCATTATAGCCCC
上述16S rDNA基因序列的长度为1431个核苷酸。
2.一株简单芽孢杆菌（Bacillus simplex）YM8 CGMCC No.5242的培养方法，是先将简单芽孢杆菌（Bacillus simplex）YM8 CGMCC No.5242接种于种子培养基中，35℃或55℃、120转/分摇床中培养至菌体浓度达108～109个/mL，然后接种5mL菌液至发酵培养基中，35℃或55℃、120转/分摇床培养；
所述的种子培养基的配方为：
葡萄糖2.0g、玉米浆 0.8g、磷酸氢二钠 0.1g、磷酸二氢钾 0.05g、硝酸钠 0.2g、硫酸镁 0.05g、氯化钠 0.1g、氯化钙 0.005g、水100mL、PH 7.2-7.4；
所述的发酵培养基的配方为：
原油20g、玉米浆 1.6g、磷酸氢二钠 0.15g、磷酸二氢钾 0.1g、硝酸钠 0.3g、硫酸镁 0.05g、氯化钠 0.1g、氯化钙 0.005g 、水100mL、PH 7.2-7.4。
3.权利要求1所述的一株简单芽孢杆菌（Bacillus simplex）YM8 CGMCC No.5242在降解原油组分中的应用。
4.权利要求1所述的一株简单芽孢杆菌（Bacillus simplex）YM8 CGMCC No.5242在治理原油污染中的应用。
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