CN102409016A - 一株铜绿假单胞菌及其培养方法与应用 - Google Patents

一株铜绿假单胞菌及其培养方法与应用 Download PDF

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本发明涉及涉及一株铜绿假单胞菌及其培养方法与应用。石油烃降解菌是能将石油烃作为唯一碳源进行生物降解，并产生气体、脂肪酸及生物表面活性剂等代谢产物的一类微生物的总称，可以代谢产生鼠李糖脂等生物活性物质，起到剥离原油，提高采收率的功效。本发明提供的铜绿假单胞菌在恒温通气条件下通过液体培养基培养，液体培养基配方为每100ml水中含有酵母提取物0.5g、蛋白胨0.5g、葡萄糖1.5g和氯化钠0.5g，pH6.8-8.0，可应用于低渗透性油田三次开发。本发明提供的菌种可提高采油脱油效率，菌培养方法简单易操作，生长繁殖迅速，具有扩大化生产的可行性。

Description

一株铜绿假单胞菌及其培养方法与应用
技术领域
    本发明涉及菌种及其培养方法与应用，具体涉及一株铜绿假单胞菌及其培养方法与应用。
背景技术
石油是关系国民经济命脉的战略性资源，经过经过一次、二次两次常规采油之后的总采收率一般只能占地下原油的30%～40%。三次采油（EOR）技术是一项能够利用物理、化学和生物等技术提高原油采收率的重要油田开发技术。在过去数十年内，美国、加拿大和委内瑞拉等石油大国都把如何提高原油采收率作为研究工作的重点目标。随着社会经济持续快速增长，我国对油气需求量也不断增加。因此，运用三次采油技术来原油提高采收率，是减缓我国多数油田产量递减速度、维持原油稳产的战略需要。
石油烃降解菌(hydrocarbon degradation bacteria, HDB) 是能将石油烃作为唯一碳源进行生物降解，并产生气体、脂肪酸及生物表面活性剂等代谢产物的一类微生物的总称，可以代谢产生鼠李糖脂等生物活性物质，起到剥离原油，提高采收率的功效。
发明内容
本发明的目的是提供一株能显著降低接触角、提高洗油效率、降低含水、增加产油量的铜绿假单胞菌及其培养方法与应用。
本发明所采用的技术方案是：
一株铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）CAWP 10-15-2 CCTCC NO.M2011287。
一株铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）CAWP 10-15-2 CCTCC NO.M2011287的培养方法，是将铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）CAWP 10-15-2 CCTCC NO.M2011287接种至专用液体培养基中，在35-37℃的温度条件下恒温通气培养；
专用液体培养基的配方为：每100ml水中含酵母提取物0.5g、蛋白胨0.5g、葡萄糖1.5g、NaCl 0.5g，pH6.8～8.0。
铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）CAWP 10-15-2 CCTCC NO.M2011287的接种比例为5～10%；
培养过程的溶解氧为5～7mg/L；
培养周期为48～72小时。
所述的一株铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）CAWP 10-15-2 CCTCC NO.M2011287在低渗透性油田三次开发中提高采收率中的应用。
所述的一株铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）CAWP 10-15-2 CCTCC NO.M2011287在制备提高原油采收率生物制剂中的应用。
    本发明具有以下优点：
本发明提供的铜绿假单胞菌，可应用于低渗透性油田的三次开发，可以显著降低接触角，48小时脱油效率可达40%左右；该菌可以有效驱替出岩心内部饱和原油，使岩心驱替效率增加10%左右；并具有岩心渗透率微生物解堵恢复作用，渗透恢复率可达90%以上；提高洗油效率，降低含水，增加产油量，提高原油采收率；借此开发的生物制剂，用于污染治理与环保清洁，具有较高的研究、应用及市场价值；此外，该菌培养方法简单易操作，生长繁殖迅速，具有扩大化生产的可行性。
附图说明
图1为铜绿假单胞菌CAWP 10-15-2的生长曲线。
图2为铜绿假单胞菌CAWP 10-15-2电镜照片。
图3为铜绿假单胞菌CAWP 10-15-2附着在岩芯表面的照片。
图4为铜绿假单胞菌CAWP 10-15-2深入岩芯孔的照片。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细的说明。
本发明所涉及的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）CAWP 10-15-2，已与2011年8月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.M2011287。
以下实施例用于说明本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂。
以下实施例中所涉及的培养基为：
Figure 2011104192596100002DEST_PATH_IMAGE002
 富集用液体培养基：NaNO3 1.5g，（NH4）2SO4 1.5g，K2HPO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，KCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，CaCl2 0.002g，蒸馏水1000ml，原油5g，pH6.8。
Figure 2011104192596100002DEST_PATH_IMAGE004
 分离培养基：富集用液体培养基中添加2%琼脂。
 血平板培养基：LB固体培养基中添加5%新鲜羊血。
实施例一：铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）CAWP 10-15-2 CCTCC NO.M2011287的分离筛选与纯化：
（一）石油降解菌株富集与分离：
将5g油泥样品加入到100ml的培养基
Figure 960045DEST_PATH_IMAGE002
中，35℃、150r/min摇床培养7d。待培养液混浊后，吸取5ml培养液重新转接入新鲜培养基
Figure 751284DEST_PATH_IMAGE002
中，与上述培养条件相同连续转接富集培养3次。采用稀释平板法进行分离，将培养液系列稀释后，取100μl稀释液涂布于培养基
Figure 892415DEST_PATH_IMAGE004
中，培养48h；待平板长出菌落后选择不同颜色及形态的单菌落，分别回接于培养基①和②中，在两种培养基中均能生长的即为石油降解菌。
（二）表面活性剂产生菌的筛选：由于表面活性剂具有降低表面张力的作用，可使红细胞破裂并释放血红素出现溶血圈，因此采用血平板法筛选。挑取活化好的菌株一环，点接于培养基
Figure 954174DEST_PATH_IMAGE006
上，35℃培养3d后若有溶血圈出现，证明该菌能产生表面活性剂。
（三）纯化：挑取单菌落，转移到培养基
Figure 850455DEST_PATH_IMAGE002
中，35℃，120r/min振荡培养，至菌浓度达到107-108CFU/ml，取100μl涂布于LB固体培养基上，检测纯度，直至获得纯种铜绿假单胞菌CAWP 10-15-2菌株。
实施例二：铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）CAWP 10-15-2 CCTCC NO.M2011287的培养方法：
（一）培养基的配方优化：
1、碳源优化：考察了铜绿假单胞菌菌株（Pseudomonas aeruginosa）CAWP 10-15-2 CCTCC NO.M2011287对葡萄糖、甘油、蔗糖、麦芽糖、酵母浸膏等几种碳源的利用情况，具体方法为：采取单因素分析试验，固定氮源成分为蛋白胨5g/L，改变碳源成分为葡萄糖、甘油、蔗糖、麦芽糖、酵母浸膏等（均为15g/L），接种铜绿假单胞菌菌株（Pseudomonas aeruginosa）CAWP 10-15-2 CCTCC NO.M2011287，35℃，120r/min振荡培养48h，测定OD600，确定细菌生长情况，试验结果显示，葡萄糖为适宜的碳源。
2、氮源优化：考察了铜绿假单胞菌菌株（Pseudomonas aeruginosa）CAWP 10-15-2 CCTCC NO.M2011287对蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏、尿素、(NH4)2SO4几种氮源的利用情况，具体方法为：采取单因素分析试验，固定碳源成分为葡萄糖（15g/L），改变氮源成分为蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏、尿素、（NH4）2SO4（含量均为5g/L），接种铜绿假单胞菌菌株（Pseudomonas aeruginosa）CAWP 10-15-2 CCTCC NO.M2011287，35℃，120r/min振荡培养48h，测定OD600，确定细菌生长情况，试验结果显示，蛋白胨为适宜的氮源。
3、发酵培养基组分的正交试验：通过正交试验确定铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）CAWP 10-15-2 CCTCC NO.M2011287发酵培养基各组分的最佳添加量，被考察因子与水平数如下表1所示：
表1 发酵培养基组分察因子与水平数列表
Figure 2011104192596100002DEST_PATH_IMAGE008
正交试验设计与数据分析如表2所示：
表2 培养基优化正交试验设计与结果
Figure 2011104192596100002DEST_PATH_IMAGE010
最佳组合：A3B3C4D3
回归方程：y=0.0368A+0.1028B+0.1939C+0.0464D+2.5146
最佳培养基配方为：每100ml水中含酵母提取物0.5g，蛋白胨0.5g，葡萄糖1.5g，NaCl 0.5g。
（二）培养方法：
按5-10%的接种比例将铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）CAWP 10-15-2 CCTCC NO.M2011287接种至液体培养基中，在35-37℃的温度条件和5-7mg/L的溶解氧条件下恒温通气培养48-72小时。液体培养基配方为：每100ml水中，含有酵母提取物0.5g、蛋白胨0.5g、葡萄糖1.5g和氯化钠0.5g，pH6.8-8.0。
 
实施例三：铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）CAWP 10-15-2 CCTCC NO.M2011287的鉴定：
铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）CAWP 10-15-2 CCTCC NO.M2011287属于假单胞菌属，革兰氏阴性杆菌，兼性厌氧，细胞尺寸为0.5×1.0～0.4×1.5μm，呈直或弯曲杆状，在LB平板中生长可产生可溶性绿色或蓝绿色色素。该菌在LB液体培养基中生长繁殖的生长曲线如图1所示，平衡期细菌浓度为108-109 CFU/ml。
图2为铜绿假单胞菌CAWP 10-15-2电镜照片；图3为铜绿假单胞菌CAWP 10-15-2附着在岩芯表面的照片；图4为铜绿假单胞菌CAWP 10-15-2深入岩芯孔的照片。
实施例四：检测铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）CAWP 10-15-2 CCTCC NO.M2011287的接触角
接触角，也称润湿接触角，是指在固、液、气三相接触达到平衡时，三相接触周边的任一点上，液气界面切线与固体表面间形成的并包含液体的夹角，是润湿程度的量度。若接触角小于90°，则固体是亲液的，即液体可润湿固体，其角越小，润湿性越好；若接触角大于90°，则固体是憎液的，即液体不润湿固体，容易在表面上移动，不能进入毛细孔。
将一滴水或3%、5%铜绿假单胞菌溶液滴在正戊烷处理过的石英片上，10min后用S-2接触角仪测定接触角，实验结果见表3。由结果可知，3%、5%的铜绿假单胞菌溶液可以有效降低接触角，从而改变岩石润湿性，易于原油剥离。
表3 铜绿假单胞菌溶液接触角测定结果（10min）
Figure 2011104192596100002DEST_PATH_IMAGE012
实施例五：检测铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）CAWP 10-15-2 CCTCC NO.M2011287的驱油效率：
取烘干带油石英砂20g，分别加入3%和5%的铜绿假单胞菌溶液50ml，置于37℃恒温箱中观察，分别于0.5，1，3，6，12，24，48小时后取出计算油量，实验结果见表4。3%和5%的铜绿假单胞菌溶液在48h的脱油效率分别为56.3%和63.7%。
表4 微生物溶液脱油效率检测   
Figure 2011104192596100002DEST_PATH_IMAGE014
实施例六：检测铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）CAWP 10-15-2 CCTCC NO.M2011287的室内驱替效率
在室内模拟地下油藏的采油工艺过程，通过实验计算渗透率、采收率的变化，从而对能提高岩芯中的石油采出率的微生物进行评价。具体为用饱和有石油的岩芯样品代表地下的油层，用泵给岩芯样品的圆柱面加压，模拟地层的上覆压力，通过驱替设备给中间容器中的试验液体和岩芯加温到所需要的试验温度（60℃）并维持此温度；用计量泵在模拟地层的高压（最高到60 MPa）下向岩芯注入加热后的微生物液体，并注入岩芯样品，微生物会将岩芯样品中的石油驱除，然后收集计量采出的油量，并计算渗透率、采收率，从而对微生物性能进行评价。
表5  3%铜绿假单胞菌溶液驱油实验数据
可以看出，铜绿假单胞菌溶液注入后，可以驱替出水驱无法动用的原油，整体采收率增加了16.67%。

Claims (5)

1.一株铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）CAWP 10-15-2 CCTCC NO.M2011287。
2.一株铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）CAWP 10-15-2 CCTCC NO.M2011287的培养方法，是将铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）CAWP 10-15-2 CCTCC NO.M2011287接种至专用液体培养基中，在35-37℃的温度条件下恒温通气培养；
专用液体培养基的配方为：每100ml水中含酵母提取物0.5g、蛋白胨0.5g、葡萄糖1.5g、NaCl 0.5g，pH6.8～8.0。
3.根据权利要求2所述的一株铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）CAWP 10-15-2 CCTCC NO.M2011287的培养方法，其特征在于：
铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）CAWP 10-15-2 CCTCC NO.M2011287的接种比例为5～10%；
培养过程的溶解氧为5～7mg/L；
培养周期为48～72小时。
4.权利要求1所述的一株铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）CAWP 10-15-2 CCTCC NO.M2011287在低渗透性油田三次开发中提高采收率中的应用。
5.权利要求1所述的一株铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）CAWP 10-15-2 CCTCC NO.M2011287在制备提高原油采收率生物制剂中的应用。
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