CN103865821A - 一种螯合球菌及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种从油井产出液中富集、筛选、培养出的螯合球菌；螯合球菌（Chelatococcus sp.）HB-4CGMCC No.6458已经在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏时间为2012年08月17日；本菌种用于降解石油行业中的高粘原油，增加原油流动性，菌株具有极高的活性，其培养方法简单，容易获取，成本低，生长迅速，对原油的降粘乳化及洗油效果好，适宜于在中低温稠油油藏进行微生物强化水驱增油。
Description
技术领域
本发明涉及微生物采油领域，具体涉及一株螯合球菌及其制备和在采油工程中的应用。
背景技术
微生物提高原油采收率是利用微生物在油藏中的有益活动及其代谢产物作用于油藏残余油，并对原油-岩石-水界面性质的作用，改善原油的流动性，增加低渗透带的渗透率，提高采收率的一项三次生物采油新技术。该技术具有适用范围广、工艺简单、成本低、见效快和环境友好等优点，目前该技术已经在全世界范围内得到广泛应用。我国各大油田在最近几年也加快了微生物采油技术研究的步伐，虽然都取得了一定效果，但在现场应用方面多以单井吞吐为主，大规模微生物水驱增油技术应用仍较少。
宝力格油田原油性质总体较差，平面上由南向北变差：粘度在13.8~432mPa·s之间，地下油水粘度比大，在34~800之间。其中巴19、38断块为稀油油藏，巴48、51断块为普通稠油油藏，普通水驱难以采出地层原油。因此华北油田公司投资1亿多元，从2010年4月开始在该区块169口注水井开展整体微生物驱，截止2012年5月，累计注入150，000m3，增油效果明显，但在微生物驱的过程中发现，以前筛选注入的菌种环境适应性及驱油效果不够理想，因此华北油田采油工程研究院大力开展了高效驱油菌种的筛选工作。
根据查阅国内外专利和文献发现，目前筛选出用于微生物驱油的菌种有黄单胞杆菌、恶臭假单胞菌、铜绿假单胞菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脱氮芽孢杆菌、肠杆菌、短芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、裂烃棒杆菌、野兔棒杆菌、酵母嗜石油杆菌、枯草杆菌、热带假丝酵母、球拟酵母、粘滞沙雷氏菌、阴沟肠杆菌、鲁疫链球菌、梭形芽孢杆菌、波茨坦短芽孢杆菌、不动杆菌、明串球菌。室内研究表明，这些菌株都具有一定降低的降低发酵液表面张力和油水界面张力，部分能够降解原油，具有降低原油粘度的功能，但都有一定的局限性，比如对地层温度，矿化度以及原油性质的适应性等方面，而且很少有经过物模驱油实验评价和现场应用效 果分析。
发明内容
本发明的目的是：提供一株可有效降解高蜡及高胶质原油，降低原油粘度并提高原油采收率一株螯合球菌及其制备和应用。
本发明的技术方案是：本发明所提供的螯合球菌（Chelatococcus sp.）HB-4CGMCC No.6458已经在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏时间为2012年08月17日。
螯合球菌（Chelatococcus sp.）CGMCC No.6458是从宝力格油井产出液中分离得到的，细胞大小为0.5μm×1.0~1.67μm，单个或成对排列；革兰氏阴性，不生孢。其菌落为淡白色，杆状，表面光滑，半透明，边缘凸起，直径为1.0mm。具体生理生化实验见表1。
表1螯合球菌部分生理生化特征
注：“+”表示生长或反应阳性，“-”表示不生长或反应阴性
实验证明，螯合球菌（Chelatococcus sp.）CGMCC No.6458能有效降解原油并改善原油性质，作用后的原油粘度由2300mPa.S下降到810mPa.S，降黏率达到了64.8%，原油组分中轻质组分增加，重质组分减少，原油流动性等到明显改善。该菌株能够产生一定量的有机酸和生物表面活性剂，发酵液的表面张力降低45%，油水界面张力降低了87%，能够使原油与水完全乳化，形成典型的水包油乳液。该菌株可广泛应用于采油工程及石油运输领域，特别是微生物强化水驱增油领域。
螯合球菌（Chelatococcus sp.）CGMCC No.6458的筛选，由下列步骤组成：
（1）采样和富集
（2）筛选和纯化
（3）菌株驱油效果评价
（4）现场驱油实验
具体工艺步骤及工艺条件是：
步骤（1）采样和富集：从宝力格油田产出液及费油坑中进行取样，然后采用以富集培养基进行富集。
富集培养基质量百分比组成为：葡萄糖2%，蛋白胨0.05%，酵母粉0.05%，尿素0.05%，硫酸铵0.05%，磷酸二氢钾0.5%，7水硫酸镁0.02%，氯化钠0.01%，自来水配制。
制备富集培养基的工艺条件为：pH值6~8，115℃灭菌20分钟，培养温度为25-45℃，培养时间为8~48小时。
步骤（2）菌种的筛选和纯化：
将质量2%的混合菌液与质量5%的宝力格混合油加入到富集培养基中，45℃条件下在摇床恒温培养48小时，观察原油的乳化情况并测量发酵液的表界面张力值，对原油能够完全分散乳化并且发酵液表/界面张力值降低大于50%以上的样品进行下一步的分离纯化，分离用培养基质量：营养琼脂+5%脱纤维羊血。对分离纯化的单菌株重复步骤（2）的实验，最终筛选出一株高效驱油菌种，经16s rDNA序列分析并结合生理生化实验确定该菌株为螯合球菌属。
步骤（3）菌株驱油效果评价
对筛选的螯合球菌进行驱油效果评价，包括微生物作用前后原油全烃组分分析、微生物代谢产物分析、对原油的降黏乳化效果分析及物模驱油实验。
步骤（4）现场驱油实验
将菌株在45℃条件下采用12m3工业发酵罐发酵48小时，发酵后的菌液按照1%的浓度与1%的营养液从注水井注入到油藏中，注入量为0.07PV，从对应油井对微生物驱效果进行跟踪监测。
本发明的有益效果是：
本发明所述的螯合球菌（Chelatococcus sp.）CGMCC No.6458具有优良的降 低原油粘度并提高原油采收率的性能，室内物模实验提高采收率达到了13.8%，现场驱油效果实验也起到了明显效果，产出液中监测到的目标菌已成为优势菌群，菌浓达到5×106个/mL，含水上升率得到有效控制，原油粘度下降52%，提高采收率大于5.0%，投入产出比为1:5.6。该发明可广泛应用于微生物驱油领域，并且适合大面积推广使用，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1螯合球菌（Chelatococcus sp.）CGMCC No.6458测序序列；
图2螯合球菌（Chelatococcus sp.）CGMCC No.6458作用前后原油全烃气相色谱图:
图2A微生物作用前原油气相色谱图（空白）
图2B微生物作用后原油气相色谱图
图2C微生物作用前后原油组分碳数分别变化
图3螯合球菌（Chelatococcus sp.）CGMCC No.6458物模驱油效果图。
具体实施方式
下属实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所有百分比浓度均为质量百分比，所有培养基中的溶剂均为蒸馏水。
实施例1、
螯合球菌（Chelatococcus sp.）CGMCC No.6458的筛选、培养和对原油的处理效果
螯合球菌（Chelatococcus sp.）CGMCC No.6458的筛选与培养：
在250mL三角瓶中加入99mL油井产出液污水，然后再加入1%的培养基，在温度为45℃下，恒温振动18-24小时。培养基各组分质量百分比为：
葡萄糖2%，蛋白胨0.05%，酵母粉0.05%，尿素0.05%，硫酸铵0.05%，磷酸二氢钾0.5%，7水硫酸镁0.02%，氯化钠0.01%，其余为产出液污水。在温度为25～30℃下培养3～5天，然后用无菌枪头吸取1ml上述菌液加入盛有9ml无菌水试管中充分混匀，以此推制成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6不同稀释液。分别从10-2，10-3，10-4三管稀释液中各吸取100ul于固体LB培养平板上，固体LB培养基各组分质量百分比：牛肉膏5%，蛋白胨1%，NaCl1%，琼脂2%，其余为蒸馏水，在温度为30℃培养箱中培养24h，出现淡黄色菌体，用接种环从 平板上挑选出此菌体，在固体LB培养基上划线纯化2-3次，得到螯合球菌（Chelatococcus sp.）CGMCC No.6458。上述培养基均在121℃、0.1Mpa下灭菌20分钟。
螯合球菌（Chelatococcus sp.）CGMCC No.6458对原油降解效果分析：试验过程：用LB培养基将菌株螯合球菌（Chelatococcus sp.）CGMCC No.6458活化24小时，然后按5%的接种量转接到富集培养基（葡萄糖2%，蛋白胨0.05%，酵母粉0.05%，尿素0.05%，硫酸铵0.05%，磷酸二氢钾0.5%，7水硫酸镁0.02%，氯化钠0.01%，自来水配制）中，加入5%的原油，在温度45℃、转速150rpm摇床上培养7天，将原油脱水后进行气相色谱全烃分析，并以微生物作用前原油做空白对照，同时用红外测油仪测定石油浓度，计算石油降解率，结果见图2。实验结果表明，螯合球菌（Chelatococcus sp.）CGMCC No.6458对原油有很好的降解作用，降解率达到50%以上，而且作用后的原油的(C21+C22)/(C28+C29)值由1.75增加到1.99，表明轻质组分相对含量增加，重质组分降低，而且姥鲛烷/C17，植烷/C18分别由0.65和1.08增加到0.85和1.43，说明作用后原油的流动性增加。
螯合球菌（Chelatococcus sp.）CGMCC No.6458对原油的降黏乳化效果分析：
试验过程：用LB培养基将菌株螯合球菌（Chelatococcus sp.）CGMCCNo.6458活化24小时，然后按5%的接种量转接到富集培养基（葡萄糖2%，蛋白胨0.05%，酵母粉0.05%，尿素0.05%，硫酸铵0.05%，磷酸二氢钾0.5%，7水硫酸镁0.02%，氯化钠0.01%，自来水配制）中，加入5%的原油，在温度45℃、转速150rpm摇床上进行培养2天，并没隔2小时观察原油的乳化情况，实验发现螯合球菌（Chelatococcus sp.）CGMCC No.6458在8小时左右就可以将原油完全乳化，并形成O/W型乳液，见图2，微生物作用2天后原油粘度由2300mPa.S下降到810mPa.S，降黏率达到了64.8%。发酵液的表面张力降低45%，油水界面张力降低了87%。
实施例2、
代谢产物有机酸分析
将菌株螯合球菌（Chelatococcus sp.）CGMCC No.6458活化24小时，然后按5%的接种量转接到富集培养基（：葡萄糖2%，蛋白胨0.05%，酵母粉0.05%，尿素0.05%，硫酸铵0.05%，磷酸二氢钾0.5%，7水硫酸镁0.02%，氯化钠0.01%，自来水配制）中，在温度45℃、转速150rpm摇床上进行培养2天，对发酵液中有机酸含量进行分析，分析过程如下：
取发酵液10mL离心除菌体，用氨水调节pH值10并烘干，加入丁醇0.5mL，再加入3滴浓硫酸作催化剂，超声处理混匀2min，在90°C下密封反应一定的时间，反应过程中间隔10min或者20min摇晃.反应结束，冷却，加入5.0mL去离子水，混匀，用十二烷萃取3次（1mL、0.5mL、0.5mL），静置分层后，用滴管吸取上层有机相至10.0mL比色管中，加入萃取剂定溶至5.00mL.加入无水硫酸钠震荡2min，进行气相色谱分析，结果见表1。
表2螯合球菌（Chelatococcus sp.）发酵液有机酸分析
气相色谱条件：250℃；检测器温度：250℃；载气：高纯氮，进样量：2.0μL；柱温：起始温度100℃(5min)，升温速率10°C/min，中止温度250℃(3min)；载气流速：15.00mL/min；氢气流速：26.50mL/min；空气流速：252.31mL/min；载气流量：3.5圈；分流比：1.5圈；氢气流量：4.5圈，空气流量：6圈；GC-MS分析方法：柱温：起始温度60℃（1min）；升温速率15°C/min；中止温度150℃（5min）。根据GC-MS定性定量分析，螯合球菌（Chelatococcus sp.）CGMCCNo.6458主要产甲酸、乙酸、2-羟基丙酸和丁酸，其产量分别为18.5、72.1、9.5及15.8mg/L。
实施例3、室内物模驱油实验
实验模型：实验用人工填砂岩心管模型长度为100cm，内径2.5cm。岩心参数见表2
表2实验用岩心参数
实验用水、油、菌液：
实验用水为宝力格油田产出水，属NaHCO3型，矿化度为7105mg/L。
实验用油为宝力格油田巴51-34井原油，原油粘度为525mP.S。
实验用菌液为螯合球菌（Chelatococcus sp.）CGMCC No.6458
实验用微驱营养液为0.6%葡萄糖、0.1%蛋白胨、0.08%酵母膏、0.1%氯化铵、0.1%磷酸氢二纳、0.02%磷酸二氢钾，总浓度为1.0%。
实验操作依次为：岩心抽空饱和地层水，注入饱和油，老化5天，水驱达95%后注入1PV“菌液（5×106个/mL）+1.0%营养物”段塞，然后关闭岩心管两端阀门，在发酵2天后进行水驱，当含水率达到98%以上时停止实验，微驱过程中监测菌浓及原油采收率，驱油实验平行3组，整个过程控制注入速度为0.2mL/min，实验结果见图3。
螯合球菌（Chelatococcus sp.）CGMCC No.6458可以提高采收率15.4%，而且出口端的菌浓可可以达到4×107个/mL，而且产出液中原油粘度下降了50%以上，表明螯合球菌（Chelatococcus sp.）CGMCC No.6458能够在油藏环境下有效生长繁殖，通过微生物本身对原油的降解及代谢产物的作用并起到明显的驱油作用。
实例4、现场实验
在宝力格现场巴51断块选择两口有代表性的井组进行螯合球菌（Chelatococcus sp.）CGMCC No.6458驱油实验，将菌株在45℃条件下采用12m3工业发酵罐发酵48小时，发酵后的菌液按照1%的浓度与1%的营养液从注水井注入到油藏中，注入量为0.07PV，从对应油井对微生物驱效果进行跟踪监测。分析结果表明，注入的螯合球菌（Chelatococcus sp.）CGMCC No.6458在油藏中能够很好地生长繁殖，产出液菌浓达到5×106个/mL以上，含水上升率得到有效控制，原油粘度下降58%，微驱有效期为8个月，提高采收率大于5.0%，投入产出比达到1:5.6。
Claims (5)
1.一种螯合球菌，其特征在于：螯合球菌（Chelatococcus sp.）HB-4CGMCCNo.6458已经在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏时间为2012年08月17日。
2.一种权利要求1所述的螯合球菌的应用，其特征在于：将菌株在45℃条件下采用12m3工业发酵罐发酵48小时，发酵后的菌液按照1%的质量浓度与质量1%的营养液从注水井与注水注入到油藏中，注入量为0.07PV。
3.根据权利要求2所述的螯合球菌的应用，其特征在于：营养液为0.6%葡萄糖、0.1%蛋白胨、0.08%酵母膏、0.1%氯化铵、0.1%磷酸氢二纳、0.02%磷酸二氢钾，总质量浓度为1.0%。
4.根据权利要求2所述的螯合球菌的应用，其特征在于：发酵用培养基为葡萄糖2%，蛋白胨0.05%，酵母粉0.05%，尿素0.05%，硫酸铵0.05%，磷酸二氢钾0.5%，7水硫酸镁0.02%，氯化钠0.01%，自来水配制。
5.一种权利要求1所述的株螯合球菌的制备方法，其特征在于：
（1）采样和富集：从宝力格油田产出液及费油坑中进行取样，然后采用以富集培养基进行富集；
富集培养基按质量百分比组成为：葡萄糖2%，蛋白胨0.05%，酵母粉0.05%，尿素0.05%，硫酸铵0.05%，磷酸二氢钾0.5%，7水硫酸镁0.02%，氯化钠0.01%，自来水配制；
制备富集培养基的工艺条件为：pH值6~8，115℃灭菌20分钟；培养温度为25-45℃，培养时间为8~48小时；
（2）菌种的筛选和纯化：
将质量2%的混合菌液与质量5%的宝力格混合油加入到富集培养基中，45℃条件下在摇床恒温培养48小时，观察原油的乳化情况并测量发酵液的表界面张力值，对原油能够完全分散乳化并且发酵液表/界面张力值降低大于50%以 上的样品进行下一步的分离纯化，分离用培养基：营养琼脂+5%脱纤维羊血；对分离纯化的单菌株重复步骤（2）的实验，最终筛选出一株菌种，经16s rDNA序列分析并结合生理生化实验确定该菌株为螯合球菌属。
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