CN104031870A - 一种微生物复合菌剂及由其制备的土壤联合修复剂及二者的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种微生物复合菌剂，并涉及所述微生物复合菌剂与生物表面活性剂组成的联合修复剂，以及所述微生物复合菌剂和所述联合修复剂在修复石油污染土壤中的应用，属于石油污染土壤或含油污泥修复技术领域；所要解决的技术问题是提供一种能够有效降解石油污染土壤或含油污泥中的TPH污染物，尤其是正构烷烃、藿烷和芳香烃的微生物复合菌剂，同时提供该微生物复合菌剂与生物表面活性剂联合修复石油污染土壤的方法；基础技术方案为，包括铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌、鲁菲不动杆菌、绿脓假单胞菌、无色杆菌、门多萨假单胞菌、热带假丝酵母菌和白色类诺卡氏菌的微生物复合菌剂。

Description

一种微生物复合菌剂及由其制备的土壤联合修复剂及二者的应用

技术领域

本发明涉及一种微生物复合菌剂，并涉及所述微生物复合菌剂与生物表面活性剂组成的联合修复剂，以及所述微生物复合菌剂和所述联合修复剂在修复石油污染土壤中的应用，属于石油污染土壤或含油污泥修复技术领域。

背景技术

针对石油污染土壤修复技术的研究经历了一个较为漫长的探索和发展的过程，概况而言，既可以从环境治理方法上分为物理法、化学法和生物法三种，也可以从修复位置上分为原位修复和异位修复两种。任何修复技术都是基于当时存在的环境问题提出的，具备不容忽视的应用及参考价值。土壤气相抽提技术主要针对不饱和区的高挥发性污染物，如石油产品中的轻质烃、汽油等，而对于挥发性较差的柴油、燃料油和煤油等的去除率不高，更适合采用生物通风技术，对于较难去除的组分，需要采用外加氧化剂来提高去除率，对于高浓度石油污染土壤可以采用有机溶剂萃取法（OSE）回收绝大部分原油。从目前来看，生物修复技术尤其是微生物修复技术由于处理费用低、无二次污染和可原位处理等特点，被认为是针对油污土壤治理具有广阔应用前景的修复技术。

我国目前对石油污染土壤或油泥生物修复技术研究主要集中于高效降解菌株（群）的筛选及特性研究和生物修复实施方法的改进两个方面。污染土壤的石油组分复杂，单一的细菌或真菌产生酶的种类较少、浓度较低，一般只能降解少数特定烃类或者只降解到某一阶段，复杂烃类的彻底降解往往需要多种微生物协同作用。研究表明：加入复合降解菌能有效地强化生物修复速度和程度。

生物表面活性剂(biosurfactant，BS)是微生物在代谢过程中分泌出的具有一定表面活性的代谢产物，如糖脂、多糖脂、脂肽或中性类脂衍生物等。因其可增加疏水性有机物的溶解性，改变微生物细胞表面的疏水性，具有良好表面活性、低毒和易生物降解等优点，而在油污土壤生物修复应用中具有特殊的地位和重要性。因此利用复合微生物菌剂和生物表面活性剂进行油污土壤或油泥的修复是一种新型联合生物修复法，相对于单一修复法可有效提高生物修复控制技术的效率和实用性。

发明内容

本发明克服现有技术的不足，所要解决的技术问题是：

一、提供一种能够有效降解石油污染土壤或含油污泥中的TPH污染物，尤其是正构烷烃、藿烷和芳香烃的微生物复合菌剂；

二、提供该微生物复合菌剂与生物表面活性剂组成的土壤联合修复剂；

三、提供该微生物复合菌剂单独修复石油污染土壤和利用所述土壤联合修复剂修复石油污染土壤的方法。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：一种微生物复合菌剂，包括铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）、恶臭假单胞菌（Pseudomonasputida）、鲁菲不动杆菌（Acinetobacterlwoffii）、绿脓假单胞菌（Pesudomonaspyocyaneum）、无色杆菌（Achromobacter）、门多萨假单胞菌（Pseudomonasmendocina）、热带假丝酵母菌（Candidatropicalis）和白色类诺卡氏菌（Nocardioidesalbus）。

作为优选，铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌、鲁菲不动杆菌、绿脓假单胞菌、无色杆菌、门多萨假单胞菌、热带假丝酵母菌和白色类诺卡氏菌的混合体积比为1.5:1.5:1.5:1.5:1:1:1:1。

该菌剂为液态制剂，也可在冷冻干燥机中制成固态冻干白色粉剂。

同时提供了一种联合修复配方，具体为：一种土壤联合修复剂，由微生物复合菌剂以及生物表面活性剂组成，所述微生物复合菌剂含有铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌、鲁菲不动杆菌、绿脓假单胞菌、无色杆菌、门多萨假单胞菌、热带假丝酵母菌和白色类诺卡氏菌。其中铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌、鲁菲不动杆菌、绿脓假单胞菌、无色杆菌、门多萨假单胞菌、热带假丝酵母菌和白色类诺卡氏菌优选的混合体积比为1.5:1.5:1.5:1.5:1:1:1:1，生物表面活性剂的纯度优选不低于85wt%。

所述微生物复合菌剂和生物表面活性剂的体积比为4-8: 1。

本发明采用的生物表面活性剂优选鼠李糖脂（RL）。所述鼠李糖脂由铜绿假单胞菌发酵后用酸沉淀冷冻干燥法提取，其浓度优选85wt%以上，性状为棕黄色粘稠状膏体。

本发明所述的微生物复合菌剂和土壤联合修复剂均可以用于修复石油污染土壤或含油污泥，对土壤中的TPH污染物具有优良的降解作用，也适用于对正构烷烃、藿烷、芳香烃的降解。

本发明所述的微生物复合菌剂和土壤联合修复剂用于修复石油污染土壤时，土壤中的石油含量应不高于10wt%。

单独采用所述的微生物复合菌剂修复石油污染土壤的方法，包括如下步骤：

（1）将铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌、鲁菲不动杆菌、绿脓假单胞菌、无色杆菌、门多萨假单胞菌、热带假丝酵母菌和白色类诺卡氏菌八株菌分别复活、扩大培养后，混合备用；所述八株菌优选体积比按顺序为1.5:1.5:1.5:1.5:1:1:1:1；

（2）将大块油泥破碎混匀后，按油泥中的原油质量的8-10wt%、1-3wt%分别添加尿素和磷酸二氢铵，混合均匀；

（3）次日在油泥中添加油泥体积4-6%的微生物复合菌剂，搅拌均匀，保持油泥中水量在30-35%；每隔2天进行翻耕、使油泥通风，供应氧气，同时注意保持水分；

（4）每半个月，按照上述配比添加微生物复合菌剂；

每周快速检测TPH降解率、原油各组分及细菌、酵母菌数量，观察油泥颜色，直至油泥颜色接近正常土壤颜色，TPH含量达标；

采用所述的土壤联合修复剂修复石油污染土壤的方法，包括如下步骤：

（1）将铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌、鲁菲不动杆菌、绿脓假单胞菌、无色杆菌、门多萨假单胞菌、热带假丝酵母菌和白色类诺卡氏菌八株菌分别复活、扩大培养后，混合备用；所述八株菌优选体积比按顺序为1.5:1.5:1.5:1.5:1:1:1:1；

（2）将铜绿假单胞菌发酵后用酸沉淀冷冻干燥法提取鼠李糖脂，其纯度在85wt%以上，备用；

（3）将大块油泥破碎混匀后，按油泥中的原油质量的8-10wt%、1-3wt%分别添加尿素和磷酸二氢铵，按油泥体积的0.75-1%添加所述鼠李糖脂，混合均匀；所述鼠李糖脂添加方式优选稀释后添加；

（4）次日在油泥中添加油泥体积的4-6%的微生物复合菌剂，搅拌均匀，保持油泥中水量在30-35%；每隔2天进行翻耕、使油泥通风，供应氧气，同时注意保持水分；

（5）每半个月，按照上述配比添加微生物复合菌剂；

每周快速检测TPH降解率、原油各组分及细菌、真菌数量，观察油泥颜色，及时调整营养元素含量，直至油泥颜色接近正常土壤颜色，TPH含量达标；

也可以分别按油泥体积的0.75-1%和4-6%分别量取鼠李糖脂和微生物复合菌剂，二者混合后，稀释，再按照步骤（4）的操作添加到油泥中。

本发明所述的微生物复合菌剂的菌株是以从陕西姬塬油田油污土壤附近被石油污染的土壤为样本，以石油为唯一碳源，通过富集培养和特殊培养基分离法，最终分离筛选出具有高效石油降解能力的菌株。通过生理生化初步鉴定以及分子鉴定归属于铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）、恶臭假单胞菌（Pseudomonasputida）、鲁菲不动杆菌（Acinetobacterlwoffii）、绿脓假单胞菌（Pesudomonaspyocyaneum）、无色杆菌（Achromobacter）、门多萨假单胞菌（Pseudomonasmendocina）、热带假丝酵母菌（Candidatropicalis）和白色类诺卡氏菌（Nocardioidesalbus）。为方便表述，上述八种菌株按顺序依次简记为X1、X2、Q1、Q2、S1、S2、J1、J2，并根据生理生化初步鉴定将其分为4种属：其中X1和X2为假单胞菌属，Q1和Q2为不动杆菌属，S1和S2为无色杆菌属，J1和J2为真菌属。

从土壤中筛选分离所述微生物复合菌剂的培养液配方和扩大菌剂培养液配方，及菌种保藏条件。

（1）菌株分离培养液：

①营养肉汁琼脂培养基，pH7.0，每升培养基含有如下质量的营养物质：

余量为蒸馏水，用于分离培养X1、X2、Q1、Q2、S1、S2六株细菌；

②葡萄糖营养琼脂：pH7.0，每升培养基含有如下质量的营养物质：

余量为蒸馏水，用于分离培养J1、J2两株真菌。

（2）扩大菌剂培养液，成分见下表：

其中微量元素液成分如下：

余量为蒸馏水。

（3）菌种保藏条件：

X1和X2，Q1和Q2，S1和S2均为细菌，分别接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基，37℃培养24h，真空干燥并制成冻干粉剂，密封于安培瓶中，置于4℃冰箱备用。

J1、J2接种于葡萄糖营养液体培养基，28℃培养48h，真空干燥并制成冻干粉剂，密封于安培瓶中，置于4℃冰箱备用。

最后，本发明提供了所述微生物复合菌剂-生物表面活性剂联合修复剂应用于修复10wt%浓度以下的石油污染土壤或油泥的方法。具体应用时，可根据油污土壤的体积先添加0.75-1.00%的BL，再利用本发明的微生物复合菌剂扩大培养后与BL联合作用用于土壤或油泥中TPH物质的原位生物修复。根据土壤中原油浓度的含量，一般在低于10wt%原油浓度条件下，复合菌剂添加量为土壤体积的4-6%（以液态制剂计算所需添加量）。换而言之，本发明还提供了利用本发明的微生物复合菌剂现场修复石油污染土壤的方法。该方法主要包括以下步骤：

（1）将八株复合菌进行复活，在扩大培养液中培养，发酵生产，备用；

（2）由X1铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)发酵后用酸沉淀冷冻干燥法提取RL，其纯度在85wt%以上，备用；

（3）采用小型拖犁机将大块油泥破碎混匀，添加尿素，磷酸二氢铵营养元素，其用量为油泥中原油含量的8-10wt%，1-3wt%，按照处理油泥体积对应比例添加RL，将加入物稀释后与土搅拌混匀；

（4）次日在油泥中浇洒复合菌剂，其用量为油泥体积的4-6%（液态菌制剂，包含营养液），搅拌均匀，保持油泥中水量在30%左右；隔2天进行翻耕、使土壤通风，供应氧气，保持水分；

（5）每半个月再按照上述配比添加BL、浇洒复合菌剂，定期翻耕浇水；

（6）每周快速检测TPH降解率、原油各组分及细菌、真菌数量，观察油泥颜色，及时调整营养元素含量，直至受污土壤颜色接近正常，TPH含量达标。

为方便表述，本发明中所述油泥均为石油污染土壤的简称。

与现有技术相比本发明具有以下有益效果。

本发明以降解正构烷烃、藿烷、芳烃的微生物混合菌群为出发点，分离和筛选了一组以细菌和酵母菌组成的混合菌群，并优化了它们的配比制成复合菌剂，同时从其中的铜绿假单胞菌属的代谢物提取出生物表面活性剂（BL）——鼠李糖脂（RL），研究了微生物复合菌剂和RL的联合修复油污土壤的应用方法，通过所述菌剂和修复方法，可使得中度原油污染土壤的石油烃类（TPH）降解达90%以上，其中，正构烷烃的降解高达95%左右。

本发明的联合修复剂中的生物表面活性剂有利于改善油/水/微生物细胞界面的接触行为，在促进微生物降解土壤中石油的基础上，再加入微生物复合菌剂，可以广泛降解油污土壤中正构烷烃、藿烷、芳香烃类物质。本发明同时提供了该微生物复合菌剂的种属组成及最优配比，复合菌剂和生物表面活性剂联合修复的用量，以及使用此修复剂现场修复石油污染土壤应用的方法。

利用本发明的联合修复剂及修复方法能有效降低土壤或油泥中的石油烃、正构烷烃、藿烷和芳香烃的含量，实现油污土壤的复耕，消除污染土壤中TPH及各成分对人体的危害，恢复土壤的生态功能。本发明在对黄土塬区石油污染土壤TPH污染物的生物修复处理中展示出了优异的修复效果。根据土壤中石油含量的多少，一般1-2个月左右即能使土壤中TPH污染物降解到标准范围。处理工艺简单、快速、有效。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。

一、微生物复合菌剂的分离、鉴定与扩大培养

（一）降解正构烷烃、藿烷、芳烃微生物菌株的分离

以陕西姬塬油田油污土壤附近被石油污染的土壤为样本，以石油为唯一碳源，通过富集培养和特殊培养基分离法，最终分离筛选出具有高效石油降解能力的X1和 X2、Q1和 Q2、S1和S2、J1和J2八株菌，通过生理生化初步鉴定为4种属：其中X1和 X2为假单胞菌属，Q1和 Q2为不动杆菌属，S1和S2为无色杆菌属， J1和J2为真菌属。

（二）分子生物学鉴定

以细菌16S rRNA PCR通用引物（由宝生物工程（大连）有限公司（takara）合成），进行PCR扩增目的片段，把16S rDNA PCR产物与PMD18-T载体连接后转化入大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性克隆，培养12h后，寄到宝生物有限公司测序。测序结果用BLAST软件与Genbank中已登录的16S rDNA序列进行同源性比较，构建16S rDNA 系统发育树进行进化分析，初步鉴定八株菌属于不同的属，包括：X1为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），X2为恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida），Q1为鲁菲不动杆菌（Acinetobacter lwoffii），Q2为绿脓假单胞菌，S1为无色杆菌（Achromobacter），S2为门多萨假单胞菌（Pseudomonas mendocina），J1为热带假丝酵母菌（Candida tropicalis），J2为白色类诺卡氏菌（Nocardioides albus）。

（三）菌株的扩大培养

培养X1、X2、Q1、Q2、S1、S2这六株细菌用牛肉膏蛋白胨培养基，培养热带假丝酵母菌、白色类诺卡氏菌两株菌用麦氏培养基。混合菌剂的培养发酵采用三级扩大培养法，在37℃的温度下培养48h，再用平板稀释法查看菌落数是否大于 1×10¹⁰ cfu·ml^-1后，将X1、X2、Q2和Q1、S1、S2这六株菌按照60%（体积百分数）以及 J1、J2这两株菌按照40%（体积百分数）配成混合菌剂，密封保存在室温下。

二、微生物复合菌剂的配比优化

将以上8种菌剂和混合菌剂分别接入有20ml无机盐培养基的三角烧瓶，加入2g原油，28℃摇床震荡培养15天后取出培养基，加入10ml氯仿，放入超声波仪器中破乳15分钟，倒入滴液漏斗中将氯仿萃取出来，重复三次，再放入水浴中蒸发将氯仿蒸发至尽，剩下的物质准确称量后定容10ml，即为GC-MS测试降解油样。不添加混合菌剂的设置为对照组。

GC-MS实验条件：

载气选用氦气，流速1.0ml/min；DB-5MS毛细管柱，分流进样，分流比10:1，进样量1μl；尾吹流量10.0ml/min；进样口温度为250℃，离子源温度为230℃；柱温采用程序升温，初温40℃，保持8分钟，在以10℃/min升至220℃，保持17分钟，在以10℃/min升至290℃，保持10分钟；离子化方程（EI），离子化能量为70eV。质谱全扫描（Scan）定性，扫描范围：45-500amu。

用各菌株对正构烷烃、藿烷、芳烃降解来优化复合菌剂配比：

从正构烷烃29种物质的降解率可以看出，15天时，假单胞菌属、不动杆菌属4株菌对于高碳数段的正构烷烃降解率高达60%以上，最高为Q1菌剂对C31-C39降解率达到97.58%；X2菌剂对低碳数正构烷烃有降解优势，达到67.50%， Q（假单胞菌属）和X（不动杆菌属）菌剂对于正构烷烃降解在单一菌剂作用中表现较优。

各菌剂作用能促使五环三萜类化合物（藿烷）的手性碳R构型向更稳定的S构型转化并在7天时，C31αβ-22S与C31αβ-22(S+R)的质量比值为0.600，已经达到转化终点。J、S菌属的∑藿烷与∑正构烷烃的质量比值明显小于原油（0.394），分别达到0.111，0.158，表明原油遭受这两种细菌降解时藿烷系列的降解速率明显大于正构烷烃系列。总体来说，菌剂对藿烷的降解中，S（无色杆菌属）和J（真菌属）菌属为藿烷优势降解菌。

15天残油样中并未检测出萘，证明萘在15天前已经被菌剂的强烈去甲基反应降解完全。菲/正构烷烃质量比值中J2、S1（0.394、0.285）明显大于原始油样的0.167值，表明这两种细菌作用原油时正构烷烃的降解速率明显大于菲系列，或者说原油遭受J2、S1这两种细菌降解时菲系列的稳定性明显大于正构烷烃。X2、Q1的菲/正构烷烃质量比分别为0.023、0.064和0.100，明显小于原始油样的0.167值，表明这2种细菌作用原油时菲系列的降解速率明显大于正构烷烃。同理，屈/正构烷烃质量比中J2和S1均大于原始油样的值，表明这两种细菌作用原油时正构烷烃的降解速率明显大于屈系列。X2、Q1的屈/正构烷烃质量比分别为0.011、0.028、 0.021，明显小于原始油样的0.074值，表明这2种细菌作用原油时屈系列的降解速率明显大于正构烷烃。整体而言， X2、Q1菌属的菲/正构烷烃比值和屈/正构烷烃比值均小于原油，说明这两种菌剂对芳香烃有较好的降解优势。

将培养的铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌、鲁菲不动杆菌、绿脓假单胞菌、无色杆菌、门多萨假单胞菌、热带假丝酵母菌、白色类诺卡氏菌的混合体积比按照1.5:1.5:1.5:1.5:1:1:1:1复配得到的混合菌剂对正构烷烃、藿烷、芳烃降解均衡，保持了各菌的降解优势。

三、微生物复合菌剂-生物表面活性剂的含油污泥原位修复处理

具体操作如下：

（1）由铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)发酵后用酸沉淀冷冻干燥法提取生物表面活性剂，得到鼠李糖脂含量为85%以上的棕黄色粘稠状生物表面活性剂；

（2）将八株复合菌进行复活，在扩大培养液中培养，发酵生产，备用；

（3）采用小型拖犁机将大块油泥破碎混匀，添加尿素，磷酸二氢铵营养元素，添加量为油泥中含有的原油质量的8-10wt%，1-3wt%，按照处理油泥体积的0.75-1%量取步骤（1）的生物表面活性剂，加适量水稀释后与土搅拌混匀；

（4）次日在油泥中浇洒微生物复合菌剂，其用量为油泥体积的4-6%（液态菌制剂，包含营养液），搅拌均匀，保持油泥中水量在30-35%；隔2天进行翻耕、使油泥通风，供应氧气，保持水分；

（5）半个月时再按照上述配比添加生物表面活性剂、浇洒微生物复合菌剂，并定期翻耕浇水；

（6）每周快速检测TPH降解率、原油各组分及细菌、真菌数量，观察油泥颜色，及时调整营养元素含量，直至油泥颜色接近正常，TPH含量达标，达到复耕要求。

实施例1为对城壕作业区2吨含油污泥经过30d生物处理，含油污泥的含油率由5％下降为0.3％。

实施例2为对姬源油田井场5吨含油污泥经过30d生物处理，含油污泥的含油率由10.25％下降为2.38％。

实施例3对城壕作业区3吨含油污泥进行生物修复试验，经过30d处理后，含油污泥的含油率由5.09％下降至0.63％。

实施例4为对姬源油田井场2吨含油污泥经过55d生物处理，含油污泥的含油率由10％下降为0.53％。

本发明还选取了微生物复合菌剂（MI）与鼠李糖脂（RL）通过现场试验来研究石油污染土壤在生物表面活性剂与菌剂联合作用下的修复性能，可在短期内修复受污土壤，使土壤达到复耕要求。本发明所用菌群适应性强，对环境无污染，费用低、周期短、效果好，适用于10%浓度以下原油污染土壤的处理。MI与RL联合作用10%油污土壤的修复性能高于自然降解或菌剂作用土壤的修复性能，RL+MI处理可明显增加土壤中微生物数量，细菌、放线菌和霉菌最高生物量，分别比空白处理提高约20、5.8和4.7倍；第14d、21d和28d的降油率分别达67.6%、88.6%和97.3%，较MI和RL单独处理分别提高了22-24%和32-38%。

从目前来看，生物修复技术尤其是微生物修复技术由于处理费用低、无二次污染和可原位处理等特点，被认为是针对油污土壤治理具有广阔应用前景的修复技术。由微生物代谢分泌产生的生物表面活性剂，因其具有良好表面活性、低毒和易生物降解等优点，可增加难溶疏水性有机物的溶解性，改变微生物细胞表面的疏水性，与微生物复合菌剂联合使用在油污土壤生物修复应用中具有显著效果。

本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。因此，无论从哪一点来看，本发明的上述实施方案都只能认为是对本发明的说明而不能限制发明，权利要求书指出了本发明的范围，而上述的说明并未指出本发明的范围，因此，在与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何变化，都应认为是包括在权利要求书的范围内。

Claims (10)

1.一种微生物复合菌剂，其特征在于：包括铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌、鲁菲不动杆菌、绿脓假单胞菌、无色杆菌、门多萨假单胞菌、热带假丝酵母菌和白色类诺卡氏菌。

2.根据权利要求1所述的一种微生物复合菌剂，其特征在于：所述铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌、鲁菲不动杆菌、绿脓假单胞菌、无色杆菌、门多萨假单胞菌、热带假丝酵母菌和白色类诺卡氏菌的混合体积比为1.5:1.5:1.5:1.5:1:1:1:1。

3.一种土壤联合修复剂，其特征在于：由微生物复合菌剂以及生物表面活性剂组成，所述微生物复合菌剂含有铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌、鲁菲不动杆菌、绿脓假单胞菌、无色杆菌、门多萨假单胞菌、热带假丝酵母菌和白色类诺卡氏菌。

4.根据权利要求3所述的一种土壤联合修复剂，其特征在于：所述微生物复合菌剂中的铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌、鲁菲不动杆菌、绿脓假单胞菌、无色杆菌、门多萨假单胞菌、热带假丝酵母菌和白色类诺卡氏菌的混合体积比为1.5:1.5:1.5:1.5:1:1:1:1，所述生物表面活性剂的纯度不低于85wt%；所述微生物复合菌剂和生物表面活性剂的体积比为4-8：1。

5.根据权利要求4所述的一种土壤联合修复剂，其特征在于：所述生物表面活性剂为鼠李糖脂。

6.权利要求1或2所述的微生物复合菌剂或权利要求3-5任一所述的土壤联合修复剂在修复石油污染土壤中的应用。

7.权利要求1或2所述的微生物复合菌剂或权利要求3-5任一所述的土壤联合修复剂在降解土壤中TPH污染物的应用。

8.权利要求1或2所述的微生物复合菌剂或权利要求3-5任一所述的土壤联合修复剂在降解正构烷烃、藿烷、芳香烃中的应用。

9.根据权利要求6所述的微生物复合菌剂在修复石油污染土壤中的应用方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）将铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌、鲁菲不动杆菌、绿脓假单胞菌、无色杆菌、门多萨假单胞菌、热带假丝酵母菌和白色类诺卡氏菌八株菌分别复活、扩大培养后，混合备用；

（2）将大块油泥破碎混匀后，按油泥中的原油质量的8-10wt%、1-3wt%分别添加尿素和磷酸二氢铵，混合均匀；

（3）次日在油泥中添加油泥体积4-6%的微生物复合菌剂，搅拌均匀，保持油泥中水量在30-35%；每隔2天进行翻耕、使油泥通风，供应氧气，同时注意保持水分；

（4）每半个月，按照上述配比添加微生物复合菌剂；

每周快速检测TPH降解率、原油各组分及细菌、酵母菌数量，观察油泥颜色，直至油泥颜色接近正常土壤颜色，TPH含量达标；

步骤（1）所述八株菌优选体积比按顺序为1.5:1.5:1.5:1.5:1:1:1:1，所述油泥即为石油污染土壤。

10.根据权利要求6所述的土壤联合修复剂在修复石油污染土壤中的应用方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）将铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌、鲁菲不动杆菌、绿脓假单胞菌、无色杆菌、门多萨假单胞菌、热带假丝酵母菌和白色类诺卡氏菌八株菌分别复活、扩大培养后，混合备用；

（2）将铜绿假单胞菌发酵后用酸沉淀冷冻干燥法提取鼠李糖脂，其纯度在85wt%以上，备用；

（3）将大块油泥破碎混匀后，按油泥中的原油质量的8-10wt%、1-3wt%分别添加尿素和磷酸二氢铵，按油泥体积的0.75-1%添加所述鼠李糖脂，混合均匀；所述鼠李糖脂添加方式优选稀释后添加；

（4）次日在油泥中添加油泥体积的4-6%的微生物复合菌剂，搅拌均匀，保持油泥中水量在30-35%；每隔2天进行翻耕、使油泥通风，供应氧气，同时注意保持水分；

（5）每半个月，按照上述配比添加微生物复合菌剂；

每周快速检测TPH降解率、原油各组分及细菌、酵母菌数量，观察油泥颜色，直至油泥颜色接近正常土壤颜色，TPH含量达标；

步骤（1）所述八株菌优选体积比按顺序为1.5:1.5:1.5:1.5:1:1:1:1，所述油泥即为石油污染土壤。