CN101486980A - 用于石油污染物及石油产品降解的固体微生物菌剂、制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种用于石油污染物及石油产品降解的固体微生物菌剂，及其制备方法和应用，属于石油污染土壤及石油产品泄漏突发事故应急处理的生物修复技术领域。固体微生物菌剂是由铜绿假单胞菌细菌发酵液与草炭土、麸皮按重量比例0.1～1∶1∶0.2～0.5混合制成，所述铜绿假单胞菌细菌发酵液中铜绿假单胞菌的有效活菌数为10⁶～10¹⁰个/ml。本发明的固体微生物菌剂具有在土壤中活性高，生长迅速，对环境不造成二次污染的优点，用于在石油污染土壤及石油产品泄漏事故场地的生物修复。

Description

用于石油污染物及石油产品降解的固体微生物菌剂、制备方法及应用

技术领域

本发明涉及一种用于石油污染物降解的固体微生物菌剂、制备方法及应用，属于石油污染土壤及石油产品泄漏突发事故应急处理的生物修复技术领域。

背景技术

生物修复也有称生物整治、生物恢复、生态修复或生态恢复，是指利用处理系统中的生物，主要是微生物的代谢活动来减少污染现场污染物的浓度或使其无害化的过程。由于生物修复是通过投加或刺激土壤中的生物来降解污染物，并不破坏植物生长所需的土壤环境。其最终产物是CO₂、H₂O等物质，因此具有环境友好、不产生二次污染的特点。另外，相对于传统污染土壤修复技术，生物修复技术是最经济的一种，其费用约为热处理费用的1/3-1/4。迄今为止，已知能降解石油烃类的微生物共100余属，200多种，它们分属于细菌、放线菌、霉菌和藻类。降解石油的细菌有假单胞菌属、不动杆菌属、小球菌属、弧菌属等属中的某些菌株。常见的降解石油的霉菌有曲霉、青霉、枝孢霉等属中的菌株。

在石油污染土壤中的生物修复过程中，石油中的主要成分烃类化合物的憎水性是微生物进行代谢、降解存在的主要问题。生物表面活性剂是一类由微生物产生、分子结构具有亲水性和疏水性基团的高分子物质，包括糖脂、脂肽、多糖-蛋白络合物、磷脂、脂肪酸和中性脂等。与其他表面活性剂相比，它不仅具有能降低界面张力和乳化难溶性有机物的作用，同时还有易于生物降解和无毒的优点。在微生物降解原油的过程中，生物表面活性剂起到了非常重要的作用，生物表面活性剂可以促使烃类物质乳化、分散，并改变细胞表面的疏水性，达到加强微生物与烃类物质间的亲和力，同时也起到促使烃类物质扩散进入细胞的作用，从而强化微生物对石油污染物的降解。2005年张惠殊等人公开了提高石油采收率的降粘菌及应用(CN1566327)的专利，其中就涉及到三株可以产生有机酸和表面活性剂的假单胞菌的使用，有机酸是丁酸、乙酸和十碳烯酸；表面活性剂是糖脂，而这两类产物均有利于提高石油采收率。国内目前在石油污染的微生物修复中多采用多菌株联合修复，有些菌的主要功能是产表面活性剂，另外一些菌主要是降解石油菌。在实际应用过程中取得的效果不甚理想，主要原因是在恶劣的环境中达不到实验室中菌株生长的理想状态，产表面活性剂的菌株生长受到限制就会影响到整个修复进程。

发明内容

针对现存的微生物菌剂在生物修复过程存在的问题，本发明提供一种用于石油污染物及石油产品降解的固体微生物菌剂，该菌株不仅能大量产生表面活性剂，而且能够直接利用石油污染物作为碳源，修复效果十分明显。

本发明还提供该固体微生物菌剂的制备方法，包括制备该微生物菌剂的所使用的菌种，以及培养发酵方法。

本发明还提供该固体微生物的应用。

本发明是通过以下具体措施来实现的：

本发明涉及一种用于石油污染物及石油产品降解的固体微生物菌剂，其特别之处在于：含有铜绿假单胞菌(Pesudomonas aeruginosa)。

上述本发明的固体微生物菌剂，最好采用以下方法制成：由铜绿假单胞菌细菌发酵液与草炭土、麸皮按重量比例0.1～1:1：0.2～0.5混合制成，所述铜绿假单胞菌细菌发酵液中铜绿假单胞菌的有效活菌数为10⁶～10¹⁰个/ml。。

本发明还涉及上述固体微生物菌剂的制备方法，所述的铜绿假单胞菌细菌细菌发酵液的制备，步骤如下：

(1)菌种

铜绿假单胞菌(Pesudomonas aeruginosa)

(2)一级种子液

将上述菌种在牛肉膏蛋白胨斜面培养基上活化16～32h后，转接到液体LB培养基或牛肉膏蛋白胨培养基内摇瓶活化16～32h，作为一级种子液，

(3)细菌发酵液

将上述菌种的一级种子液接种量2％～10％转接到发酵培养基内摇床培养16～32h，转速为150～250rpm，培养温度为20～30℃。

上述本发明的固体微生物菌剂的制备方法，所述步骤(3)中的发酵培养基所选用的碳源、氮源分别是玉米淀粉、豆粕粉；最好是加入有效量的酵母粉。发酵培养基的优选配比如下：豆粕粉为2～6g，玉米淀粉为1～3g，酵母粉为1～3g，K₂HPO₄ 0.11g，CaCl₂ 0.01g，MgSO₄·7H₂O 0.15g，MnSO₄ 0.01g，蒸馏水100ml。

本发明还涉及一种上述固体微生物菌剂的应用，用于石油污染物或石油产品污染场地进行降解处理。

本发明的固体微生物菌剂的应用，在用于石油污染物及石油产品污染场地进行降解处理时，还可添加复合肥和水，搅拌均匀，洒在污染场地。添加的复合肥为一般为离子型的农用复合肥。

上述应用时，固体菌剂的添加量及复合肥的添加量可根据土壤污染的程度或石油产品泄漏的程度进行调整。

本发明的技术特点是将具有能够大量产生表面活性剂的石油降解菌，进行高密度发酵培养，获得高活性的细菌发酵液，然后按照一定比例与优质草炭土、麸皮混合拌匀，制成固体微生物菌剂。采用本发明所述的固体微生物菌剂，在胜利油田进行了现场中试实验，配合施加一定量的复合肥，现场降解效果良好。本发明提供的固体微生物菌剂具有在土壤中活性高、生长迅速、对环境不造成二次污染的优点。

本发明所述的用于石油污染物及石油产品降解的固体微生物菌剂与现有的微生物菌剂比较，具有如下优点：采用具有高效降解原油能力的细菌菌株，避免了真菌菌剂在降解石油烃过程中产生有毒代谢物的可能性，不会对土壤生态环境造成二次污染。本菌株既可产生表面活性剂，又可高效降解石油，在实际应用过程中避免了复合菌剂细菌间的协同作用效果差的缺点。另一方面所选的固体载体为富含有机质的草炭土和麸皮，质地疏松，营养丰富，微生物吸附于草炭、麸皮载体中可以二次增殖，使污染土壤的生物修复效果大大提高。添加的复合肥为常用的农用复合肥，既可刺激添加的细菌生长，也可促进土著细菌的生长，从而达到加速修复进程的目的。

本发明所述固体菌剂制备过程简单易操作，成本低廉，在石油污染土壤及石油产品泄漏事故场地的生物修复领域具有广阔的应用前景。

具体实施方式

本发明所述的细菌是铜绿假单胞菌(Pesudomonas aeruginosa)。该菌株分离自我国胜利油田的污染泥土。

实施例1：细菌发酵液的制备

采用的细菌是铜绿假单胞菌(Pesudomonas aeruginosa)。将其分别经过斜面培养、摇瓶活化培养、摇瓶发酵培养得到细菌发酵液，具体操作步骤为：

(1)斜面培养基：采用常规方法制备牛肉膏蛋白胨固体培养基，具体步骤为：牛肉膏3g，蛋白胨5g，NaCl 5g，蒸馏水1000ml，pH7.2～7.4，琼脂1.5％～2％，搅拌均匀，于1.05kg/cm²，121.3℃条件下灭菌20～30min。灭菌后做成斜面，分别在超净工作台上，无菌接种保藏的菌株到试管斜面上，菌种在25～30℃条件下培养16～32h，待菌苔长满斜面备用；

(2)种子液的制备：液体培养基仍为牛肉膏蛋白胨培养基，将配制好的液体培养基分装入150～250ml三角瓶内，装液量为20～60ml，与121.3℃灭菌30min。待冷却至40℃左右，挑取一环斜面菌苔接种于三角瓶内，然后置于摇床上培养，调节摇床转速为150～250rpm，20～30℃条件下培养16～32h，待培养基混浊后装入发酵培养基内培养。

(3)细菌发酵液的制备：将活化好的细菌的种子液，按照2％～10％(v/v)的接种量接入发酵培养基内，发酵培养基配方如下：豆粕粉为2～6g，玉米淀粉为1～3g，酵母粉为1～3g，K₂HPO₄ 0.11g，CaCl₂ 0.01g，MgSO₄·7H₂O 0.15g，MnSO₄ 0.01g，蒸馏水100ml。接种后置于摇床上培养22h，温度为20～30℃，摇床转速为150～250rpm。此条件下得到高活性的细菌发酵液，铜绿假单胞菌的有效活菌数为10⁷～10⁹个/ml。

实施例2：细菌对原油的降解能力试验

将活化好的细菌，分别从其斜面上挑取一环菌苔，在牛肉膏蛋白胨液体培养基内活化16～32h后，制成一定浓度的菌悬液，再按照2～10％的接种量转接到原油培养基内，置于20～30℃摇床上培养5～12d，转速为150～250rpm。以不接菌的培养基为空白对照。培养结束时，向培养液中加入二氯甲烷(DCM)，离心打破水包油乳液，有机相用颗粒状无水硫酸钠过滤脱水后置于预先恒重的烧杯中，室温氮气吹脱至恒重，采用重量法测定培养液中残油含量。采用下面公式计算石油烃的生物降解率(η％)：

η(％)＝ω₀-ω_x/ω₀×100

式中：ω₀为对照培养液中残油含量；ω_x为测试菌培养液中残油含量。

从下表可以看出，该细菌在液体摇瓶内对原油的降解能力均较高，随着时间延长，降解率逐渐升高，28d时降解率可以达到71.73％(见下表)。

铜绿假单胞菌降解原油的测定实验

实施例3：固体菌剂的制备方法，具体操作步骤为：

(1)按实施例1的方法制备铜绿假单胞菌细菌发酵液。

(2)称取草炭土100g、麸皮20g，装入500mL烧杯内，包扎后于121.3℃灭菌30min～2h，灭菌后待用。

(3)将步骤(1)的细菌发酵液与步骤(2)的草炭、麸皮按比例为0.5：1：0.2混合，于超净工作台上充分拌匀，置于室温条件下储存。两天后测定所制固体菌剂内细菌的有效活菌数，铜绿假单胞菌的有效活菌数为10⁷～10⁹个/ml。

实施例4：固体菌剂应用效果试验

采用本发明制备的固体菌剂在胜利油田某一污染区域进行现场应用效果试验。具体试验方法为：

对现场进行模拟原位修复，挖3个边长为2m深0.5m的土坑(编号为1^#，2^#，3^#)，取含油土壤6m³，充分搅拌均匀，分成三份，1^#区域为空白对照，土壤中加入水，2^#区域为加入大约500克的固体菌剂、和水，3^#区域为500克的固体菌剂和1-3％的肥料。将拌匀的这些土壤加入挖好的坑内，每隔一周翻动土壤一次，并进行通风强化，每隔两天取样测定总石油烃含量，试验处理为三次重复，以减少试验误差。总石油烃含量的测定采用常规的重量法，计算公式为：石油总烃(g/kg)＝蒸发瓶中残留物重/鲜土重*(1—含水率％)*1000。在现场进行为期1个月的修复后。1^#空白对照的最终降解率为20.189％。2^#固体菌剂的降解率为35.826％，3^#活性污泥的降解率为65.743％。由此可以看出，固体草炭菌剂和肥料组的修复效果最优，达到了65％以上。

Claims (8)

1、一种用于石油污染物及石油产品降解的固体微生物菌剂，其特征在于：含有铜绿假单胞菌(Pesudomonas aeruginosa)。

2、如权利要求1所述的固体微生物菌剂，其特征在于：是由铜绿假单胞菌细菌发酵液与草炭土、麸皮按重量比例0.1～1∶1∶0.2～0.5混合制成，所述铜绿假单胞菌细菌发酵液中铜绿假单胞菌的有效活菌数为10⁶～10¹⁰个/ml。

3、一种权利要求2所述固体微生物菌剂的制备方法，其特特征在于：所述的铜绿假单胞菌细菌细菌发酵液的制备，步骤如下：

(1)菌种

铜绿假单胞菌(Pesudomonas aeruginosa)

(2)一级种子液

将上述菌种在牛肉膏蛋白胨斜面培养基上活化16～32h后，转接到液体LB培养基或牛肉膏蛋白胨培养基内摇瓶活化16～32h，作为一级种子液，

(3)细菌发酵液

将上述菌种的一级种子液接种量2％～10％转接到发酵培养基内摇床培养16～32h，转速为150～250rpm，培养温度为20～30℃。

4、如权利要求3所述的固体微生物菌剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中的发酵培养基所选用的碳源、氮源分别是玉米淀粉、豆粕粉。

5、如权利要求4所述的固体微生物菌剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中的发酵培养基还有酵母粉。

6、如权利要求5所述的固体微生物菌剂的制备方法，其特征在于所述步骤(3)中的发酵培养基如下：豆粕粉为2～6g，玉米淀粉为1～3g，酵母粉为1～3g，K₂HPO₄ 0.11g，CaCl₂ 0.01g，MgSO₄·7H₂O 0.15g，MnSO₄ 0.01g，蒸馏水100ml。

7、一种权利要求1或2所述的固体微生物菌剂的应用，其特征在于：用于石油污染物或石油产品污染场地进行降解处理。

8、如权利要求7所述的固体微生物菌剂的应用，其特征在于：所述的固体微生物菌剂添加肥料和水，搅拌均匀，洒在污染场地。