CN106148318A - 一种生物炭固定化菌剂的制备与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种生物炭固定化菌剂的制备与应用,该方法包括步骤如下:将降解石油的微生物依次进行种子液培养和液态发酵培养,得发酵液;将发酵液与生物炭进行混合吸附,制得生物炭固定化微生物菌剂。本发明还提供上述生物炭固定化菌剂在油泥砂及石油污染土壤中的应用。本发明通过将具有降解石油功能的微生物通过生物炭固定后,对油泥砂及石油污染土壤进行修复,石油去除效率显著提高,较单独微生物修复去除率提高20%‑30%。本发明以玉米芯等农业废弃物作为前体物来制备载体,成本低且容易大量获得,同时实现了废物资源化。
Description
技术领域
本发明涉及一种可处理油泥砂及修复石油污染土壤的生物炭固定化菌剂的制备和应用,属于环境生物修复技术领域。
背景技术
随着石油工业的迅速发展,油气田开发对土壤的污染日益严重,石油进入土壤会破坏生态系统的结构和功能,并危及人类健康,因此修复污染土壤迫在眉睫。微生物修复技术是利用微生物的降解作用发展起来的一种高效、安全、低成本的石油污染土壤修复技术,但由于我国北方陆上油田普遍含盐量高、土壤贫瘠的特点,微生物受不利条件影响降解作用难以充分发挥。固定化菌剂可将微生物固定在适宜其生长的独立微环境中,有效屏蔽土著菌的恶性竞争及外界不利因素对微生物体的直接侵害,提高对污染物的降解率。各种石油污染土壤的微生物菌剂的制作技术也被相继报道。
石化企业在生产过程中会产生大量油泥砂,目前油泥砂已被列入《国家危险废物目录》中的含油废物类(HW08项)。国内外企业对油泥砂一般先采取物化处理脱水、回收原油后,再进一步无害化处理。然而,油泥砂成分较为复杂,前期物化处理工艺常涉及乳化剂、絮凝剂,更增加了脱水油泥砂成分的复杂程度。普通的土壤修复微生物菌剂投加进油泥砂后,受环境因素影响,降解菌存活时间较短,对油泥砂进行无害化效果不显著。因此,有必要研制一种适应范围宽泛的菌剂,可同时应用于石油污染土壤修复和油泥砂处理。
中国专利文件CN105087538A(申请号:201510451863.5)公开了一种石油降解菌剂及其制备方法和用途,其制备方法为:将聚乙烯醇与海藻酸钠溶液按比例混合均匀,再加入活性炭混匀,冷却后加入以10:1的比例与包含金黄杆菌:柄杆菌:无色杆菌:伯克氏菌(各菌株质量比为36:22:18:5)的石油降解菌液进行混合;再用注射器将得到的混合溶液滴入氯化钙饱和硼酸溶液,进行成球;静置后,将溶液中的微球取出,用灭菌后的0.9%NaCl溶液洗涤,得到固体微球形的石油降解菌剂。但是,该专利文件使用包埋法将降解菌固定于海藻酸钠、聚乙烯醇和活性炭的混合载体网状结构中,解决了微生物的环境影响因素,但包埋法制备的微球空间位阻较大,大分子污染物的扩散阻力较高,在一定程度上限制了降解菌作用的充分发挥;且使用海藻酸钠、聚乙烯醇作为载体,成本较直接的吸附固定法要高。
中国专利文件CN104152432A(申请号:201410400607.9)公开了石油烃降解菌载体材料及用途,制备方法为:1)将玉米芯切成块,用水冲洗干净,在盐酸水溶液中浸泡;取出,用无菌水冲洗至中性,烘干,粉粹,过20目筛,得到玉米芯粉末;将大豆秸秆切成段,用水冲洗干净,在盐酸水溶液中浸泡;取出,用无菌水冲洗至中性,烘干,粉粹,过20目筛,得到大豆秸秆粉末;2)将玉米芯粉末和大豆秸秆粉末按照质量比为2:1的比例混合,制得石油烃降解菌载体材料。但是,该专利文件直接采用玉米芯作为固定化载体,未对玉米芯进行热解炭化,玉米芯本身对污染物的吸附能力较热解后的玉米芯炭要低,且无法起到固碳减排的作用。
发明内容
针对现有技术的不足,本发明提供一种利用生物炭和石油降解微生物制备固定化菌剂的方法,并将其应用于油泥砂和石油污染土壤等污染介质中石油的去除,促进污染介质中石油的去除。
本发明的技术方案如下:
一种生物炭固定化菌剂的制备方法,包括步骤如下:
将降解石油的微生物依次进行种子液培养和液态发酵培养,得发酵液;将发酵液与生物炭进行混合吸附,制得生物炭固定化微生物菌剂。
根据本发明,优选的,所述的降解石油的微生物为假单胞菌(Psedomonas sp.),菌种保藏号:CGMCC No.12596,保藏机构:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
根据本发明,优选的,所述生物炭按如下方法制备得到:
将玉米芯粉碎、干燥,在200-500℃下限氧热解30-150分钟,冷却后粉碎、过筛,取粒径为0.25-2.5厘米的部分作为生物炭。该生物炭作为微生物的载体。
根据本发明,优选的,所述生物炭与发酵液混合的质量比为6-12:1。
根据本发明,优选的,所述的生物炭固定化菌剂中有效活菌数约为1×105-1×107CFU/g。
根据本发明,优选的,降解石油的微生物进行种子液培养的步骤如下:
将降解石油的微生物接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基上,活化20-30h;从牛肉膏蛋白胨固体培养基上挑取微生物接到牛肉膏蛋白胨液体培养基中进行种子液培养,在转速为120-160rpm的摇床上30℃培养15-20h;
所述牛肉膏蛋白胨固体培养基组分如下:牛肉膏3g,蛋白胨10g,NaCl 5g,琼脂10g,蒸馏水1000mL,pH 7.0;
所述牛肉膏蛋白胨液体培养基组分如下:牛肉膏3g,蛋白胨10g,NaCl 5g,蒸馏水1000mL,pH 7.0。
根据本发明,优选的,降解石油的微生物进行液态发酵培养的步骤如下:
按照体积比5%的接种量将种子液培养后的降解石油的微生物接种到液体发酵培养基中,在转速为120-160rpm的摇床上30℃培养20-25h;
所述液态发酵培养基组分如下:KNO3 0.5g,K2HPO4 0.5g,KH2PO4 0.5g,MgSO4·7H2O0.5g,无水CaCl2 0.1g,NH4NO3 1.0g,NaCl 1g,原油2.0g,H2O 1000mL。
根据本发明,上述生物炭固定化菌剂在油泥砂及石油污染土壤中的应用,包括步骤如下:
向含原油1-10wt%的油泥砂或石油污染土壤中添加氮磷农用复合肥,调节油泥砂或石油污染土壤的碳、氮、磷的摩尔比为(100-120):(5-10):1,调整油泥砂或石油污染土壤含水率至20-50%,疏松油泥砂或石油污染土壤,按质量比0.5-5%加入生物炭固定化菌剂,混合均匀,每隔一周翻搅一次,维持油泥砂或石油污染土壤含水率20-50%,在15-40℃条件下修复2个月即可。
本发明的原理:
由于生物炭多孔特征明显,比表面积较大,吸附能力较强,以它为载体的固定化菌剂投加入污染介质后,会促进石油类污染物由污染介质向生物炭载体迁移,使生物炭同时富集降解菌和污染物,增加了微生物和污染物的接触。生物炭可以为降解菌提供的独立微环境,能屏蔽外界不利因素对降解菌的直接侵害,提高降解菌对污染环境中石油的去除效率。生物炭固定化菌剂可实现污染物的富集-降解一体化,有助于促进污染介质中石油的去除。
本发明的有益效果:
1、本发明通过将具有降解石油功能的微生物通过生物炭固定后,对油泥砂及石油污染土壤进行修复,石油去除效率显著提高,较单独微生物修复去除率提高20%-30%。
2、本发明固定后的石油烃降解菌能长时间内保持活性,便于存储和运输。
3、本发明以玉米芯等农业废弃物作为前体物来制备载体,成本低且容易大量获得,同时实现了废物资源化。
4、本发明以生物炭为载体,生物炭作为一种具有高度稳定性的富碳物质,在其产生和储存的过程中都能起到将生物质中碳素锁定而避免经微生物分解等途径进入大气的功效,起到了增汇减排,影响气候变化和全球热辐射平衡的积极作用。
5、本发明制得的生物炭固定化菌剂可应用于石油污染土壤及油泥砂修复过程中,具有成本低、效率高的特点,具有显著的经济效益和社会效益。
具体实施方式:
下面通过具体实施例对本发明做进一步说明,但不限于此。
微生物来源
实施例1-6中的假单胞菌(Psedomonas sp.)的菌种保藏号:CGMCC No.12596,保藏机构:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所。
实施例1:假单胞菌对石油的降解
挑取假单胞菌(Psedomonas sp.)接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基上,活化24h。所述牛肉膏蛋白胨固体培养基组分如下:牛肉膏3g,蛋白胨10g,NaCl 5g,琼脂10g,蒸馏水1000mL,pH 7.0。从牛肉膏蛋白胨固体培养基上挑取假单胞菌接到牛肉膏蛋白胨液体培养基中,在转速为150rpm的摇床上30℃培养18h,再按照体积比5%的接种量接种到原油培养基中,置于28℃摇床上培养7d,转速为150rpm。以不接菌的原油培养基为空白对照。培养结束时,向培养基中加入二氯甲烷进行萃取,将萃取液进行旋转蒸发使二氯甲烷挥发干净,采用重量法测定培养基中残油含量。所述牛肉膏蛋白胨液体培养基成分如下:牛肉膏3g,蛋白胨10g,NaCl 5g,蒸馏水1000mL,pH 7.0。所述原油培养基成分如下:NH4NO3 1.0g,K2HPO41.0g,KH2PO4 1.0g,MgSO4·7H2O 0.5g,无水CaCl2 0.1g,原油5.0g,H2O 1000mL。
采用下面公式计算石油烃的降解率(η%):η(%)=(ω0-ωx)/ω0×100。式中:ω0为对照培养基中残油含量;ωx为测试菌培养基中残油含量。
经计算:在液体摇瓶中假单胞菌对原油具有很强的降解能力,一周的石油降解率为26.1%。
实施例2:生物炭的制备
玉米芯粉碎至小于2.5cm,干燥至含水率≤10%,400℃限氧热解60分钟,可得玉米芯炭。其吸油能力为6.0g/g,密度为0.14g/cm3,产率为30%。
实施例3:生物炭固定化菌剂的制备
挑取假单胞菌(Psedomonas sp.)接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基上,活化24h。从牛肉膏蛋白胨固体培养基上挑取假单胞菌接到牛肉膏蛋白胨液体培养基中进行种子液培养,在转速为150rpm的摇床上30℃培养18h。再按照体积比5%的接种量接种到液体发酵培养基中培养,置于30℃培养24h,转速为150rpm。得假单胞菌菌液。经检测,假单胞菌菌液中假单胞菌的有效活菌数为6.2×107CFU/mL。所述液态发酵培养基组分如下:KNO3 0.5g,K2HPO4 0.5g,KH2PO4 0.5g,MgSO4·7H2O 0.5g,无水CaCl2 0.1g,NH4NO3 1.0g,NaCl 1g,原油2.0g,H2O 1000mL。将发酵液与实施例2制得的生物炭以质量比为1:8进行混合吸附,制得生物炭固定化微生物菌剂。经检测,生物炭固定化微生物菌剂中假单胞菌的有效活菌数约为7.5×106CFU/g。
实施例4:生物炭固定化菌剂在油泥砂中的应用效果试验
采用实施例3制备的生物炭固定化菌剂进行盆土试验。从油田区中采集油泥砂样品,经测定其含油率为8%,粉碎,混匀。分别进行3种处理:处理一:称取油泥砂1.0kg,加入菌剂30g,肥料20g(硝基磷酸铵);处理二:称取油泥砂1.0kg,加入菌剂30g;处理三:称取油泥砂1.0kg。将上述三组处理后的油泥砂分别装入花盆,调节并保持含水率为20-50%,每隔一周翻搅一次,室温放置2个月。采用重量法测定石油含量,计算公式为:石油量(g/kg)=蒸发瓶中残留物重/鲜土重*(1-含水率)*1000。经过2个月的修复,处理一的石油去除率为29.2%,处理二的石油降解率为9.7%,处理三的石油降解率为5.2%。
实施例5:生物炭固定化菌剂在石油污染土壤中的应用效果试验
采用实施例3制备的生物炭固定化菌剂进行盆土试验。从农田中采集土样,按重量比3%加入新鲜石油,自然风干,粉碎,混匀。分别进行3种处理:处理一:称取油泥砂1.0kg,加入菌剂30g,肥料20g(硝基磷酸铵);处理二:称取油泥砂1.0kg,加入菌剂30g;处理三:称取油泥砂1.0kg。将上述三组处理后的油泥砂分别装入花盆,调节并保持含水率为20-50%,每隔一周翻搅一次,室温放置2个月。采用重量法测定石油含量,计算公式为:石油量(g/kg)=蒸发瓶中残留物重/鲜土重*(1-含水率)*1000。经过2个月的修复,处理一的石油去除率为38.9%,处理二的石油降解率为19.5%,处理三的石油降解率为8.9%。
实施例6:生物炭固定化菌剂在石油污染土壤中的应用效果试验
采用实施例3制备的生物炭固定化菌剂修复胜利油田孤岛油区含盐2.0-5.0%、含油2.18%的盐碱土壤。取土:对胜利油田孤岛油区进行模拟原位修复,挖2个边长为2m,深0.5m的土坑,编号为1#坑和2#坑,由两坑中共取含油土壤4m3,充分搅拌均匀,然后平均分成2份。回填:将第1份含油土壤填入1#坑做为空白对照;第2份含油土壤加入50kg的固体菌剂和土壤重量1%的肥料(硝基磷酸铵)并搅拌均匀,然后填入2#坑内。修复:保持1#坑和2#坑中土壤含水量20-50%,每隔一周翻动土壤一次,并进行通风强化,定期取样测定总石油烃含量,修复2个月。采用常规的重量法测定石油含量,计算公式为:石油量(g/kg)=蒸发瓶中残留物重/鲜土重*(1-含水率%)*1000。经过2个月的修复后,1#坑的石油降解率3.8%,2#坑的石油降解率达到40.1%,即添加生物炭固定化菌剂的修复效果良好。
实施例7:生物炭的制备
玉米芯粉碎至小于2.5cm,干燥至含水率≤10%,200℃限氧热解150分钟,可得玉米芯炭。
实施例8:生物炭的制备
玉米芯粉碎至小于2.5cm,干燥至含水率≤10%,500℃限氧热解30分钟,可得玉米芯炭。
实施例9:生物炭固定化菌剂的制备
如实施例3所述,不同的是:
发酵液与实施例7制得的生物炭以质量比为1:6进行混合吸附,制得生物炭固定化微生物菌剂。
实施例10:生物炭固定化菌剂的制备
如实施例3所述,不同的是:
发酵液与实施例8制得的生物炭以质量比为1:12进行混合吸附,制得生物炭固定化微生物菌剂。
对比例:发酵液在油泥砂中的应用效果试验
采用实施例3制备的发酵液进行盆土试验。从油田区中采集油泥砂样品,经测定其含油率为8%,粉碎,混匀。分别进行2种处理:处理一:称取油泥砂1.0kg,加入发酵液30g,肥料20g(硝基磷酸铵);处理二:称取油泥砂1.0kg。将上述两组处理后的油泥砂分别装入花盆,调节并保持含水率为20-50%,每隔一周翻搅一次,室温放置2个月。采用重量法测定石油含量,计算公式为:石油量(g/kg)=蒸发瓶中残留物重/鲜土重*(1-含水率)*1000。经过2个月的修复,处理一的石油去除率为15.3%,处理二的石油降解率为4.5%。
Claims (8)
1.一种生物炭固定化菌剂的制备方法,包括步骤如下:
将降解石油的微生物依次进行种子液培养和液态发酵培养,得发酵液;将发酵液与生物炭进行混合吸附,制得生物炭固定化微生物菌剂。
2.根据权利要求1所述的生物炭固定化菌剂的制备方法,其特征在于,所述的降解石油的微生物为假单胞菌(Psedomonas sp.),菌种保藏号:CGMCC No.12596,保藏机构:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
3.根据权利要求1所述的生物炭固定化菌剂的制备方法,其特征在于,所述生物炭按如下方法制备得到:
将玉米芯粉碎、干燥,在200-500℃下限氧热解30-150分钟,冷却后粉碎、过筛,取粒径为0.25-2.5厘米的部分作为生物炭。
4.根据权利要求1所述的生物炭固定化菌剂的制备方法,其特征在于,所述生物炭与发酵液混合的质量比为6-12:1。
5.根据权利要求1所述的生物炭固定化菌剂的制备方法,其特征在于,所述的生物炭固定化菌剂中有效活菌数为1×105-1×107CFU/g。
6.根据权利要求1所述的生物炭固定化菌剂的制备方法,其特征在于,降解石油的微生物进行种子液培养的步骤如下:
将降解石油的微生物接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基上,活化20-30h;从牛肉膏蛋白胨固体培养基上挑取微生物接到牛肉膏蛋白胨液体培养基中进行种子液培养,在转速为120-160rpm的摇床上30℃培养15-20h;
所述牛肉膏蛋白胨固体培养基组分如下:牛肉膏3g,蛋白胨10g,NaCl 5g,琼脂10g,蒸馏水1000mL,pH 7.0;
所述牛肉膏蛋白胨液体培养基组分如下:牛肉膏3g,蛋白胨10g,NaCl 5g,蒸馏水1000mL,pH 7.0。
7.根据权利要求1所述的生物炭固定化菌剂的制备方法,其特征在于,降解石油的微生物进行液态发酵培养的步骤如下:
按照体积比5%的接种量将种子液培养后的降解石油的微生物接种到液体发酵培养基中,在转速为120-160rpm的摇床上30℃培养20-25h;
所述液态发酵培养基组分如下:KNO3 0.5g,K2HPO4 0.5g,KH2PO4 0.5g,MgSO4·7H2O0.5g,无水CaCl2 0.1g,NH4NO3 1.0g,NaCl 1g,原油2.0g,H2O 1000mL。
8.权利要求1-7任一项制备的生物炭固定化菌剂在油泥砂及石油污染土壤中的应用,包括步骤如下:
向含原油1-10wt%的油泥砂或石油污染土壤中添加氮磷农用复合肥,调节油泥砂或石油污染土壤的碳、氮、磷的摩尔比为(100-120):(5-10):1,调整油泥砂或石油污染土壤含水率至20-50%,疏松油泥砂或石油污染土壤,按质量比0.5-5%加入生物炭固定化菌剂,混合均匀,每隔一周翻搅一次,维持油泥砂或石油污染土壤含水率20-50%,在15-40℃条件下修复2个月即可。
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