CN109207413B - 一种高效石油降解复合菌剂及其制备方法与应用 - Google Patents

一种高效石油降解复合菌剂及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种高效石油降解复合菌剂及其制备方法与应用。一种高效石油降解复合菌剂，包括如下有效微生物：石油烃降解菌ECO‑17，菌种保藏号CGMCC No.15837；石油烃降解菌‑3，菌种保藏号CGMCC No.16238；智利鞘氨醇盒菌(Sphingopyxis chilensis)‑13，菌种保藏号CGMCC No.16241；石油烃降解菌(Achromoobacter pulmonis)‑10，菌种保藏号CGMCC No.16240。本发明根据菌株对石油烃的降解特性进行降解菌株筛选，4株菌株对不同碳链长度石油烃有不同的降解特性，而且4株菌株复配后未有竞争性抑制生长，且具有协同促进作用，能提高最终石油烃的降解效率。

Description

一种高效石油降解复合菌剂及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种高效石油降解复合菌剂及其制备方法与应用，属于微生物技术领域。
背景技术
土壤石油及多环芳烃污染具有隐蔽性和潜伏性、不可逆性和长期性、后果严重性等特点。生物修复是石油污染土壤有效的修复方法，生物修复是一种受控的或者自发的过程，指的是通过使用生物系统(包括微生物、植物和酶)来将环境中的污染物降解、消耗、分解、转化、代谢和/或移除，以达到减少或最终消除环境污染的目的。大部分情况下，在石油污染土壤及沉积物中烃降解微生物群落会生长，如果有足够的时间，污染场地的土壤会恢复到之前的状态。为了得到这样的结果，必须有足够数量的微生物，而且必须有大量石油烃降解的关键基因。然而，修复的时间还取决于其他的一系列因素：(1)污染程度：高浓度石油烃会抑制微生物的生长，原因是由于其细胞毒性，特别是高水溶性，低疏水性的石油烃组分；(2)土壤条件：为了保持生物活性，石油烃降解菌需要特定的条件，包括适当的pH值、温度范围、自由氧、营养元素(氮和磷)、氧气与水分。如果这些条件不在适于微生物生长可接受范围内，总石油烃的微生物降解就会停止，这时石油烃的降解仅靠化学与风化作用，可能要持续非常长的时间。
原位生物修复技术以及异位生物修复技术是较常用的生物修复技术类型，这两者都是利用石油烃作为碳源，通过微生物自身的代谢过程，对石油类污染物进行催化和降解。国内外对于生物技术修复石油污染土壤的研究日益增加，也取得了众多成果。生物法修复油污土壤具有显著的优点：该方法可用于受污染面积较大的土壤的修复，而且该修复技术所需成本较低；对土壤的修复效果较好，污染物在土壤中的残留量低；该方法绿色环保，不会因为该法的使用对土壤造成二次污染；不破坏植物生长需要的土壤条件，且能改善土壤质量。
石油烃降解菌数量众多，有假单胞菌属、微球菌属、诺卡氏菌属、不动杆菌属等七十多个属，两百多种。由于石油烃成分复杂，包括直连烷烃、支链烷烃、环烷烃、多环芳烃以及含氮、含硫化合物等，不同的降解菌可以利用石油的组分不同，因此，复配菌以及菌群对石油烃的降解效果要优于单菌。目前常用的微生物复配的方式是将对石油降解率较高的微生物进行组合试验，然后对组合后的复配菌进行降解功能的验证，来筛选降解效果优于单菌的复配组合。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种高效石油降解复合菌剂及其制备方法与应用。
本发明技术方案如下：
一种高效石油降解复合菌剂，包括如下有效微生物：
石油烃降解菌(Tsukamurella pulmonis)ECO-17，于2018年6月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种保藏号CGMCC No.15837；
石油烃降解菌(Bacillus paramycoides)-3，于2018年8月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种保藏号CGMCC No.16238；
智利鞘氨醇盒菌(Sphingopyxis chilensis)-13，于2018年8月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种保藏号CGMCC No.16241；
石油烃降解菌(Achromoobacter pulmonis)-10，于2018年8月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种保藏号CGMCC No.16240。
根据本发明优选的，所述石油烃降解菌(Tsukamurella pulmonis)ECO-17有效活菌数为108～1010CFU/g、石油烃降解菌(Bacillus paramycoides)-3有效活菌数为108～1010CFU/g、智利鞘氨醇盒菌(Sphingopyxis chilensis)-13有效活菌数为108～1010CFU/g、石油烃降解菌(Achromoobacter pulmonis)-10有效活菌数为108～1010CFU/g。
上述高效石油降解复合菌剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)分别对石油烃降解菌(Tsukamurella pulmonis)ECO-17、石油烃降解菌(Bacillus paramycoides)-3、智利鞘氨醇盒菌(Sphingopyxis chilensis)-13和石油烃降解菌(Achromoobacter pulmonis)-10进行活化培养；
(2)对步骤(1)制得的活化后的石油烃降解菌(Tsukamurella pulmonis)ECO-17、石油烃降解菌(Bacillus paramycoides)-3、智利鞘氨醇盒菌(Sphingopyxis chilensis)-13和石油烃降解菌(Achromoobacter pulmonis)-10分别进行种子培养；
(3)将步骤(2)制得的石油烃降解菌(Tsukamurella pulmonis)ECO-17种子液、石油烃降解菌(Bacillus paramycoides)-3种子液、智利鞘氨醇盒菌(Sphingopyxischilensis)-13种子液和石油烃降解菌(Achromoobacter pulmonis)-10菌液进行混合发酵培养，制得发酵菌液；
(4)将步骤(3)制得的发酵菌液与草炭土按质量比1︰(5～20)的比例混合，制得石油烃降解菌剂。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中，活化培养条件均为28～37℃倒置培养1～2天，活化培养基均为LB固体培养基，每升组份如下：
蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂20g，水定容至1L，pH自然。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，种子培养条件均为28～37℃、100～200转/分钟的条件下，摇床培养1～2天，种子培养基均为LB液体培养基，每升组份如下：
蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，水定容至1L，pH自然。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中，混合发酵培养条件均为28～37℃、溶氧20～70％的条件下培养1～2天，发酵培养基，每升组份如下：
蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，0.1～1‰(质量百分比)石油，水定容至1L，pH自然。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中，石油烃降解菌(Tsukamurella pulmonis)ECO-17的接种量为0.5～5％(体积百分比)，石油烃降解菌(Bacillus paramycoides)-3的接种量为0.5～5％(体积百分比)，智利鞘氨醇盒菌(Sphingopyxis chilensis)-13的接种量为0.5～5％(体积百分比)，石油烃降解菌(Achromoobacter pulmonis)-10的接种量为0.5～5％(体积百分比)。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中，混合后还包括晾干至含水率10～15％的步骤。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中草炭土的含水率≤5％，有机质质量百分比含量40～60％。
上述高效石油降解复合菌剂在降解石油污染物中的应用。
根据本发明优选的，所述应用，步骤如下：
向待修复的石油污染物中添加高效石油降解复合菌剂，高效石油降解复合菌剂的添加量为石油污染物质量的0.1～2％，同时添加氮磷比为5︰1的复合肥，旋耕，保持土壤水分15～25％，处理30～180天。
根据本发明进一步优选的，所述石油污染物为被石油污染的土壤或油泥。
根据本发明进一步优选的，所述石油污染物中含有石油烃的质量含量为0.5～7％。
根据本发明进一步优选的，所述复合肥的添加量为石油污染物质量的0.01～0.1％。
有益效果
本发明根据菌株对石油烃的降解特性进行降解菌株筛选，利用降解特性互补的原则进行复配。4株菌株对不同碳链长度石油烃有不同的降解特性，分别对石油烃碳数为＜14、14～28、29～36、＞C36等不同碳链长度的石油烃有突出的降解效果，而且4株菌株复配后未有竞争性抑制生长，且具有协同促进作用，能提高最终石油烃的降解效率。
附图说明
图1是石油烃降解菌(Tsukamurella pulmonis)ECO-17降解石油后的气相图谱；
图2是石油烃降解菌(Bacillus paramycoides)-3降解石油后的气相图谱；
图3是智利鞘氨醇盒菌(Sphingopyxis chilensis)-13降解石油后的气相图谱；
图4是石油烃降解菌(Achromoobacter pulmonis)-10降解石油后的气相图谱；
图5是高效石油降解复合菌剂降解石油后的气相图谱；
图6是石油溶液的气相图谱；
图7是对比例1的菌剂降解石油后的气相图谱。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
生物材料来源
石油烃降解菌(Tsukamurella pulmonis)ECO-17，于2018年6月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种保藏号CGMCC No.15837。
石油烃降解菌(Bacillus paramycoides)-3，于2018年8月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种保藏号CGMCC No.16238。
智利鞘氨醇盒菌(Sphingopyxis chilensis)-13，于2018年8月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种保藏号CGMCC No.16241。
石油烃降解菌(Achromoobacter pulmonis)-10，于2018年8月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种保藏号CGMCC No.16240。
培养基
LB固体培养基，每升组分如下：
蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂20g，dH2O水定容至1L。
LB液体培养基，每升组分如下：
蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，dH2O水定容至1L。
无机盐培养基，每升组份如下：
KNO3 1.5g，(NH4)SO4 1.5g，K2HPO4 1g，KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，dH2O定容至1L。
石油-无机盐固体培养基，每升组份如下：
KNO3 1.5g，(NH4)SO4 1.5g，K2HPO4 1g，KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，10％石油，琼脂20g，dH2O定容至1L。
石油-无机盐液体培养基，每升组份如下：
KNO3 1.5g，(NH4)SO4 1.5g，K2HPO4 1g，KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，10％石油，dH2O定容至1L。
实施例中所述草炭土的含水率≤5％，有机质质量百分比含量40～60％，购自山东环保草炭土有限公司。
实施例1
上述高效石油降解复合菌剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)分别对石油烃降解菌(Tsukamurella pulmonis)ECO-17、石油烃降解菌(Bacillus paramycoides)-3、智利鞘氨醇盒菌(Sphingopyxis chilensis)-13和石油烃降解菌(Achromoobacter pulmonis)-10进行活化培养，活化培养条件为32℃倒置培养1天；
(2)对步骤(1)制得的活化后的石油烃降解菌(Tsukamurella pulmonis)ECO-17、石油烃降解菌(Bacillus paramycoides)-3、智利鞘氨醇盒菌(Sphingopyxis chilensis)-13和石油烃降解菌(Achromoobacter pulmonis)-10分别进行种子培养，种子培养条件为32℃、150转/分钟的条件下，摇床培养1天；
(3)将步骤(2)制得的石油烃降解菌(Tsukamurella pulmonis)ECO-17种子液、石油烃降解菌(Bacillus paramycoides)-3种子液、智利鞘氨醇盒菌(Sphingopyxischilensis)-13种子液和石油烃降解菌(Achromoobacter pulmonis)-10菌液进行混合发酵培养，混合发酵培养条件为32℃、溶氧50％的条件下培养1天，制得发酵菌液；
发酵培养基，每升组份如下：
蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，0.5g石油，dH2O水定容至1L；
所述石油烃降解菌(Tsukamurella pulmonis)ECO-17的接种量为2％(体积百分比)，石油烃降解菌(Bacillus paramycoides)-3的接种量为2％(体积百分比)，智利鞘氨醇盒菌(Sphingopyxis chilensis)-13的接种量为2％(体积百分比)，石油烃降解菌(Achromoobacter pulmonis)-10的接种量为2％(体积百分比)；
(4)将步骤(3)制得的发酵菌液与草炭土按质量比1︰10的比例混合，阴凉处自然风干2h晾干至含水率10％，制得石油烃降解菌剂。
经检测，制得的石油烃降解菌剂中，所述石油烃降解菌(Tsukamurella pulmonis)ECO-17、石油烃降解菌(Bacillus paramycoides)-3、智利鞘氨醇盒菌(Sphingopyxischilensis)-13、石油烃降解菌(Achromoobacter pulmonis)-10的有效活菌数分别约为2.1×108CFU/g、1.7×108CFU/g、1.5×108CFU/g、1.3×108CFU/g。
实施例2
如实施例1所述的高效石油降解复合菌剂，不同之处在于，步骤(3)中石油烃降解菌(Tsukamurella pulmonis)ECO-17、石油烃降解菌(Bacillus paramycoides)-3、智利鞘氨醇盒菌(Sphingopyxis chilensis)-13、石油烃降解菌(Achromoobacter pulmonis)-10种子液的接种比例为1％、1％、2％、2％(均为体积百分比)。
经检测，制得的石油烃降解菌剂中，所述石油烃降解菌(Tsukamurella pulmonis)ECO-17、石油烃降解菌(Bacillus paramycoides)-3、智利鞘氨醇盒菌(Sphingopyxischilensis)-13、石油烃降解菌(Achromoobacter pulmonis)-10的有效活菌数分别约为1.7×108CFU/g、1.4×108CFU/g、2.3×108CFU/g、2.1×108CFU/g。
实施例3
如实施例1所述的高效石油降解复合菌剂，不同之处在于，步骤(4)中发酵液与草炭土的质量比1:5。
经检测，制得的石油烃降解菌剂中，所述石油烃降解菌(Tsukamurella pulmonis)ECO-17、石油烃降解菌(Bacillus paramycoides)-3、智利鞘氨醇盒菌(Sphingopyxischilensis)-13、石油烃降解菌(Achromoobacter pulmonis)-10的有效活菌数分别约为3.2×108CFU/g、2.5×108CFU/g、4.3×108CFU/g、4.1×108CFU/g。
对比例1
如实施例1所述的高效石油降解复合菌剂，不同之处在于，替换石油烃降解菌(Achromoobacter pulmonis)-10为石油烃降解菌(Tsukamurella pulmonis)ECO-17，实施例1步骤(3)中的各菌种的接种量分别为石油烃降解菌(Tsukamurella pulmonis)ECO-17的接种量为4％(体积百分比)，石油烃降解菌(Bacillus paramycoides)-3的接种量为2％(体积百分比)，智利鞘氨醇盒菌(Sphingopyxis chilensis)-13的接种量为2％(体积百分比)；
将上述发酵液与草炭土按质量比1︰10的比例混合，阴凉处自然风干2h晾干至含水率10％，制得石油烃降解菌剂。
经检测，制得的石油烃降解菌剂中，所述石油烃降解菌(Tsukamurella pulmonis)ECO-17、石油烃降解菌(Bacillus paramycoides)-3、石油烃降解菌(Achromoobacterpulmonis)-10的有效活菌数分别约为3.2×108CFU/g、2.1×108CFU/g、1.9×108CFU/g。
实验例1
将实施例1步骤(2)中制备的石油烃降解菌(Tsukamurella pulmonis)ECO-17种子液、石油烃降解菌(Bacillus paramycoides)-3种子液、智利鞘氨醇盒菌(Sphingopyxischilensis)-13种子液和石油烃降解菌(Achromoobacter pulmonis)-10菌液分别进行发酵培养，培养条件按实施例1步骤(3)所述条件，然后将4种菌的发酵液按照实施例1步骤(4)的条件制备单菌菌剂，单菌菌剂中的活菌数量与实施例1的菌剂的总活菌数相同，利用石油烃降解菌(Tsukamurella pulmonis)ECO-17种子液、石油烃降解菌(Bacillusparamycoides)-3种子液、智利鞘氨醇盒菌(Sphingopyxis chilensis)-13种子液和石油烃降解菌(Achromoobacter pulmonis)-10制备的菌剂分别标记为1#、2#、3#、4#，将实施例1所述的复合菌剂标记为5#，且1#、2#、3#、4#、5#菌剂的微生物浓度相同。
分别将1#、2#、3#、4#、5#菌剂按照质量百分比5％的接种量接种到石油-无机盐固体培养基中，置于30℃摇床上培养7d，转速为150rpm。以不接菌的培养基为空白对照。培养结束后向培养液中加入二氯甲烷，萃取剩余石油，向萃取液中加入足量无水硫酸钠进行脱水，过滤后进行旋蒸，使二氯甲烷完全挥发，室温放置，重量稳定后称重。采用下面公式计算石油烃的降解率(η％)：
η(％)＝(ω0-ωx)/ω0×100
式中：ω0为对照培养液中残油含量；ωx为测试菌培养液中残油含量。
不同处理在液体摇瓶中对石油烃的降解率分别为：1#降解率为39.3％，2#降解率为35.6％，3#降解率为33.9％，4#降解率为38％，5#降解率为49.8％。
分别对1#、2#、3#、4#、5#菌剂降解后的萃取物及空白对照萃取物进行气相色谱分析，结果如图1～6所示。
图1～5分别为1#～5#菌剂降解石油烃后的气相图谱，图6为未经处理的石油烃溶液的气相图谱。对比图6，图1～4对石油烃均具有良好的降解效果，而且可以看出图1～4中不同碳链长度具有不同的降解效果，分别对碳链长度为＜14、29～36、＞C36、14～28区域的石油烃的降解效果特别突出。而4种菌组合形成的菌剂的降解效果从图5中可以看出，对从短链到长链均具有很好的降解效果，而且石油烃的降解率明显提高。
实验例2
取实施例1制备的高效石油降解复合菌剂和对比例1的菌剂进行油泥污染土壤修复试验，具体方法为：
收集落地油污染土，摊成薄层，自然晾干至含水率至15％，然后将油泥块人工粉碎。每吨污染土添加5kg氮磷肥料以及10kg高效石油降解复合菌剂，保持土壤松散，堆成高50cm、宽100cm的堆体，修复一个月。
采样风干粉碎，二氯甲烷萃取3次，采用实施例4中的方法计算石油含量，经检测，实施例1菌剂的石油降解率为37.4％，对比例1菌剂的石油降解率为30.6％。
图7为对比例1的菌剂对石油污染土壤的修复结果分析。通过对降解后的试验结果分析，对比例1的菌剂修复土壤后的石油组成与实施例1的菌剂相比，中长链的石油烃残留明显升高，表明菌剂中菌种的组成缺失了对中长链石油烃的有效降解。

Claims (14)

1.一种高效石油降解复合菌剂，其特征在于，包括如下有效微生物：
石油烃降解菌（Tsukamurella pulmonis）ECO-17，于2018年6月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种保藏号CGMCC No.15837；
石油烃降解菌（Bacillus paramycoides）-3，于2018年8月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种保藏号CGMCCNo.16238；
智利鞘氨醇盒菌（Sphingopyxis chilensis）-13，于2018年8月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种保藏号CGMCC No.16241；
石油烃降解菌(Achromoobacter pulmonis)-10，于2018年8月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种保藏号CGMCC No.16240。
2.如权利要求1所述的高效石油降解复合菌剂，其特征在于，所述石油烃降解菌（Tsukamurella pulmonis）ECO-17有效活菌数为108～1010 CFU/g、石油烃降解菌（Bacillus paramycoides）-3有效活菌数为108～1010 CFU/g、智利鞘氨醇盒菌（Sphingopyxis chilensis）-13有效活菌数为108～1010 CFU/g、石油烃降解菌(Achromoobacter pulmonis)-10 有效活菌数为108～1010 CFU/g。
3.权利要求1所述的高效石油降解复合菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）分别对石油烃降解菌（Tsukamurella pulmonis）ECO-17、石油烃降解菌（Bacillus paramycoides）-3、智利鞘氨醇盒菌（Sphingopyxis chilensis）-13和石油烃降解菌(Achromoobacter pulmonis)-10进行活化培养；
（2）对步骤（1）制得的活化后的石油烃降解菌（Tsukamurella pulmonis）ECO-17、石油烃降解菌（Bacillus paramycoides）-3、智利鞘氨醇盒菌（Sphingopyxis chilensis）-13和石油烃降解菌(Achromoobacter pulmonis)-10分别进行种子培养；
（3）将步骤（2）制得的石油烃降解菌（Tsukamurella pulmonis）ECO-17种子液、石油烃降解菌（Bacillus paramycoides）-3种子液、智利鞘氨醇盒菌（Sphingopyxis chilensis）-13种子液和石油烃降解菌(Achromoobacter pulmonis)-10 菌液进行混合发酵培养，制得发酵菌液；
（4）将步骤（3）制得的发酵菌液与草炭土按质量比1︰（5～20）的比例混合，制得石油烃降解菌剂。
4.如权利要求3所述的高效石油降解复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中，活化培养条件均为28～37℃倒置培养1～2天，活化培养基均为LB固体培养基，每升组份如下：
蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂20g，水定容至1L，pH自然。
5.如权利要求3所述的高效石油降解复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，种子培养条件均为28～37℃、100～200转/分钟的条件下，摇床培养1～2天，种子培养基均为LB液体培养基，每升组份如下：
蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，水定容至1L，pH自然。
6.如权利要求3所述的高效石油降解复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中，混合发酵培养条件均为28～37℃、溶氧20～70%的条件下培养1～2天，发酵培养基，每升组份如下：
蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，水定容至1L，pH自然，0.1～1‰的石油作为诱导剂。
7.如权利要求3所述的高效石油降解复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中，石油烃降解菌（Tsukamurella pulmonis）ECO-17的接种量为0.5～5%（体积百分比），石油烃降解菌（Bacillus paramycoides）-3的接种量为0.5～5%（体积百分比），智利鞘氨醇盒菌（Sphingopyxis chilensis）-13的接种量为0.5～5%（体积百分比），石油烃降解菌(Achromoobacter pulmonis)-10 的接种量为0.5～5%（体积百分比）。
8.如权利要求3所述的高效石油降解复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中，混合后还包括晾干至含水率10～15%的步骤。
9.如权利要求3所述的高效石油降解复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中草炭土的含水率≤5%，有机质质量百分比含量40～60%。
10.权利要求1所述高效石油降解复合菌剂在降解石油污染物中的应用。
11.如权利要求10所述的应用，其特征在于，步骤如下：
向待修复的石油污染物中添加高效石油降解复合菌剂，高效石油降解复合菌剂的添加量为石油污染物质量的0.1～2%，同时添加氮磷比为5︰1的复合肥，旋耕，保持土壤水分15～25%，处理30～180天，即得。
12.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述石油污染物为被石油污染的土壤或油泥。
13.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述石油污染物中含有石油烃的质量含量为0.5～7%。
14.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述复合肥的添加量为石油污染物质量的0.01～0.1%。
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