CN100347285C - 一种用于石油污染物降解的液体微生物制剂 - Google Patents
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Abstract
一种用于石油污染物降解的液体微生物制剂，属于石油污染土壤的生物修复技术。本发明的技术特征是将具有石油烃降解能力的真菌和细菌分别通过液体培养后按照一定比例混合制成液体微生物制剂，采用本发明提供的微生物制剂具有在土壤中活性高、迁移迅速、能够与污染物充分接触并能够协同降解石油烃污染物的优点。在石油污染土壤的生物修复技术领域具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于石油污染物降解的液体微生物制剂，属于石油污染土壤的生物修复技术。
背景技术
生物修复技术是石油及相关产品污染土壤的主要修复技术。由于石油污染物具有组成复杂性、生物难降解性和具有较低的生物可利用度等特点，土著微生物难以有效的、快速的、彻底的降解土壤中的石油烃。生物添加法可通过添加具有高效降解石油烃能力的微生物制剂提高生物修复的效率，有效的去除石油烃污染物。因此，加强优势菌选育和开发环境微生物制剂是石油污染土壤生物修复技术的核心。土壤中存在多种能够降解石油烃的微生物，其中细菌和真菌是土壤生态系统中石油烃的主要降解者。
以细菌为主要组成的微生物制剂通过细菌对石油烃底物的协同代谢、共代谢作用完成对石油烃的生物降解。2001年Maruyama Akihiko等人公开了采用Alcanivorax属和Bacillus属的菌株制备成混合生物制剂降解海洋或相关环境中的重油污染物的方法(JP2001037466)。细菌是原核生物，其在对有机污染物质的生物降解过程中主要所利用的是单/双加氧酶胞内氧化系统及一系列脱氢酶系，反应需在细菌与石油烃接触后发生，细菌对底物的利用受到石油烃生物可利用度低的限制。另外，石油烃与单/双加氧酶系统最适宜的底物范围是C4-C20的直链烷烃，因此细菌对碳数更高、结构更为复杂的石油烃类的降解较为困难。细菌在土壤中受到土壤颗粒的强吸附作用，导致投加的细菌难以在污染区域中均匀分布，也影响了细菌生物制剂用于土壤生物修复过程的效率。细菌在代谢石油烃的过程中会产生一些糖脂、多糖、蛋白质及脂蛋白等生物表面活性剂，生物表面活性剂类物质能够乳化石油烃，在一定程度上能够加强石油烃的生物可利用度。
真菌属于真核生物，能够分泌胞外酶，这些胞外酶多属于氧化还原酶和水解酶。胞外酶能够分散到土壤环境中，通过直接与石油烃的接触降解污染物。比如，白腐真菌能够分泌木质素降解酶至胞外，这类胞外酶能够非特异性的降解染料、农药和多环芳烃等环境污染物，并且可将不溶性污染物部分氧化为可溶性物质，从而进一步被细菌代谢。因此，真菌酶系的复杂性和能产生胞外酶的特点使得真菌更容易利用结构复杂、分子量较大的污染物。另外，真菌的生长方式决定了在土壤中真菌具有更好的延伸特性，解决了传统生物制剂在土壤中迁移困难的问题。2002年李培军等人公开了一种降解石油固体菌剂的制备方法(CN 1382758A)，该方法使用多株真菌制备成混合菌剂，利用多种真菌对石油烃的协同降解作用将其用于石油污染土壤的生物修复。但真菌在降解有机污染物的过程中易产生有毒的中间代谢产物积累，有可能对土壤产生二次污染。
发明内容
针对细菌或真菌生物制剂在生物修复过程中存在的问题，本发明提供一种用于石油污染物降解的液体微生物制剂，综合利用真菌和细菌在降解石油烃过程中各自的优点，能够实现真菌和细菌之间的生态合作与代谢途径的互补，从而提高对石油烃的降解能力。
本发明公开的一种用于石油污染物降解的液体微生物制剂，由真菌液体培养物和细菌液体培养物组成，真菌液体培养物与细菌液体培养物的混合比例为1∶0.1～10；所述的真菌液体培养物为刺孢小克银汉菌(Cunninghamella echinulata)或白腐真菌黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)的单株液体培养物，或是两种真菌液体培养物的混合物，真菌培养物中的真菌含量为10～80mg干重/ml；所述的细菌液体培养物是具有石油烃降解能力的细菌的单株液体培养物，细菌含量为106～1012个/ml。
在本发明的技术方案中，所述的真菌培养物中的真菌含量优选为20～60mg干重/ml；细菌含量优选为108～1012个/ml。当真菌液体培养物为刺孢小克银汉菌液体培养物与白腐真菌黄孢原毛平革菌液体培养物的混合物时，刺孢小克银汉菌液体培养物与白腐真菌黄孢原毛平革菌液体培养物的混合比例为1∶0.8～1。
本发明的技术方案中，具有石油烃降解能力的细菌为选自下组的细菌：(Pseudomonas)、诺卡氏菌属(Nocardia)、红球菌属(Rhodococcus)、微球菌属(Micrococcus)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)或芽孢杆菌属(Bacillus)中的一种或几种。
本发明所述的用于石油污染物降解的液体微生物制剂与现有的微生物制剂相比，其明显的优点是：将具有石油烃降解能力的真菌和细菌混合制成微生物制剂，充分综合利用了细菌对低分子量烃类降解能力强、产生生物表面活性剂提高石油烃的生物可利用度、对真菌的可溶性中间代谢产物能够继续降解等优点，以及真菌产生降解能力强的胞外酶、能够降解结构复杂分子量较大的污染物、在土壤体系中延伸性好等优点，实现了真菌和细菌之间在土壤中的生态合作与代谢途径的互补，从而提高了对石油烃的降解能力。本发明所述制剂制备过程简单，协同降解能力强，在土壤中迁移迅速，石油污染土壤的生物修复领域具有广阔的应用前景。
具体实施方式
本发明所述的具有石油烃降解能力的微生物可通过从石油污染的土壤中进行筛选或者从各国菌种保藏中心购买已知的石油烃降解菌株的方式得到。
以下通过实施例进一步描述本发明的应用效果，但不限制本发明。
实施例1
在本实施例中，使用真菌刺孢小克银汉菌1株和细菌假单胞菌1株的培养物组成液体微生物制剂。
本实施例中使用的液体微生物制剂按如下方法制备：
在装有100ml液体马铃薯培养基的容积为300ml三角瓶中接种刺孢小克银汉菌，在28℃，160rpm条件下培养3天，收集培养物，真菌含量为20mg干重/ml。在装有100ml LB液体培养基的容积为300ml三角瓶中接种假单胞菌，在30℃，160rpm条件下培养1天，收集培养物，细菌含量为108个/ml。将得到的真菌培养物和细菌培养物按照混合比例为10∶1进行混合。
采集农田土壤，人工配制石油烃含量为5％的石油污染土壤2000g。灭菌后将土壤分装入四个同样大小的小盒中。分别加入10g细菌培养物、10g真菌培养物、10g液体微生物制剂，剩余的一个小盒不加任何培养物。另外在每个小盒中按C∶N∶P∶K＝100∶10∶1∶2补充含N、P、K的无机盐营养物质。补加无菌水以保持土壤含水量为25％。将四个小盒放入30℃恒温培养箱中进行模拟原位实验。表1给出了15天后各小盒中石油烃降解率的情况。
表1 培养15天后石油烃的降解率
| 实验体系 | 石油烃降解率(％) |
| Control(不加任何培养物)加入10g细菌培养物加入10g真菌培养物加入10g液体微生物制剂 | 3.567.259.1031.02 |
实施例2
在实施例中，使用真菌黄孢原毛平革菌1株和细菌红球菌1株的培养物组成液体微生物制剂。
实施例中使用的液体微生物制剂按如下方法制备：
在装有100ml液体马铃薯培养基的容积为300ml三角瓶中接种黄孢原毛平革菌，在28℃，160rpm条件下培养3天，收集培养物，真菌含量为60mg干重/ml。在装有100ml LB液体培养基的容积为300ml三角瓶中接种红球菌，在30℃，200rpm条件下培养2天，收集培养物，细菌含量为1012个/ml。。将得到的真菌培养物和细菌培养物按照混合比例为1∶10进行混合。
采集农田土壤，人工配制石油烃含量为3％的石油污染土壤2000g。灭菌后将土壤分装入四个同样大小的小盒中。分别加入2g细菌培养物、2g真菌培养物、2g液体微生物制剂，剩余的一个小盒不加任何培养物。另外在每个小盒中按C∶N∶P∶K＝100∶10∶1∶2补充含N、P、K的无机盐营养物质。补加无菌水以保持土壤含水量为30％。将四个小盒放入30℃恒温培养箱中进行模拟原位实验。表2给出了15天后各小盒中石油烃降解率的情况。
表2 培养15天后石油烃的降解率
| 实验体系 | 石油烃降解率(％) |
| Control(不加任何培养物)加入5g细菌培养物加入5g真菌培养物加入5g液体微生物制剂 | 2.316.456.9625.68 |
本发明已参照较优实施方案作了描述，熟悉上述详细描述的本领域的技术人员可以作出许多变动和替换，其均包含在本发明的范围和实质内容中。
Claims (4)
1.一种用于石油污染物降解的液体微生物制剂，其特征在于：该液体微生物制剂由真菌液体培养物和细菌液体培养物组成，真菌液体培养物与细菌液体培养物的混合比例为1∶0.1～10；所述的真菌液体培养物为刺孢小克银汉菌(Cunninghamella echinulata)或白腐真菌黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)的单株液体培养物，或是两种真菌液体培养物的混合物，真菌培养物中的真菌含量为10～80mg干重/ml；细菌液体培养物是具有石油烃降解能力的细菌菌株的液体培养物，细菌含量为106～1012个/ml。
2.按照权利要求1所述的一种用于石油污染物降解的液体微生物制剂，其特征在于：所述的真菌培养物中的真菌含量为20～60mg干重/ml；细菌含量为108～1012个/ml。
3.按照权利要求1所述的一种用于石油污染物降解的液体微生物制剂，其特征在于：当真菌液体培养物为刺孢小克银汉菌液体培养物与白腐真菌黄孢原毛平革菌液体培养物的混合物时，刺孢小克银汉菌液体培养物与白腐真菌黄孢原毛平革菌液体培养物的混合比例为1∶0.8～1。
4.按照权利要求1所述的一种用于石油污染物降解的液体微生物制剂，其特征在于：所述的具有石油烃降解能力的细菌为假单胞菌属(Pseudomonas)、诺卡氏菌属(Nocardia)、红球菌属(Rhodococcus)、微球菌属(Micrococcus)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)或芽孢杆菌属(Bacillus)中的一种或几种。
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1800344A (zh) | 2006-07-12 |
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