CN1382758A

CN1382758A - 一种降解石油固体菌剂的制备方法

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Publication number: CN1382758A
Application number: CN 01113881
Authority: CN
Inventors: 李培军; 张海荣; 姚德明; 姜昌亮; 马学军; 许华夏; 郭书海; 张春桂; 杨桂芬
Original assignee: Institute of Applied Ecology of CAS
Current assignee: Institute of Applied Ecology of CAS
Priority date: 2001-04-20
Filing date: 2001-04-20
Publication date: 2002-12-04

Abstract

一种降解石油固体菌剂的制备方法。采用真菌菌种中毛霉1株,青霉1株,曲霉1株,木霉1株和白腐真菌2株,分别取所述属中一株,经斜面培养、摇瓶培养、固体培养得单一固体培养物,将每种单一固体培养物等量混合均匀制得成品。它协同作用强、降解能力大,适用于稀油、稠油、特稠油和高凝油污染土壤的生物修复。

Description

一种降解石油固体菌剂的制备方法

本发明涉及石油污染土壤生物修复技术，具体地说是一种降解石油固体菌剂的制备方法。

关于污染土壤的治理，九十年代以来，生物修复技术在我国越来越引起人们的关注。不同类型的石油(稀油、高凝油、特稠油和稠油)污染土壤，如高含量落地原油及油泥用物理化学方法回收石油后，产生的油泥废弃物，经过物理化学处理，由于高温和化学提取剂的作用，自然界存在的大量微生物已很少存在，土壤理化性质被彻底改变，还有化学浸提剂的残留等，为生物修复技术的应用增加了难度。污染土壤生物修复技术主要有原位处理和异位处理两类，原位生物处理方法是在受污染地区直接采用生物修复技术；原位生物修复由于环境条件不易控制，所以处理周期长，但费用低，适合大面积轻度污染的土壤。异位生物修复技术是将受污染土壤运输到特定工程地点进行生物修复。这种方法可保证生物降解的较理想条件，因而对污染土壤处理效果好，还可防止污染物转移，被视为一项具有广阔应用前景的处理技术。以上两种技术都离不开微生物及其酶的功能，因为对于被污染的土壤和环境生态系统，微生物具有修复功能，可以恢复环境的本来面貌。

土著微生物降解有机化合物有巨大的潜力，是生物修复的基础。当土壤遭受有机物污染后，对于土著微生物实际上就自然地存在驯化选择过程，其中一些特异的微生物在污染物的诱导下产生分解污染物的酶系，进而将污染物降解转化。但有时土著微生物遇到特殊情况，也会使生长速度受到抑制，代谢活性不高，此时添加外来微生物也许会发挥“先锋生物”的作用。

在石油污染土壤中实际上不存在单一的有机化合物，它包括直链烃、环烃和芳香烃等，还没有单一微生物能具有降解所有这些污染物的能力，另外，生物降解通常是分步进行的，在这些过程中包括了多种酶和多种微生物的作用，一种酶或微生物的产物可能成为另一种酶或微生物的底物，因此在污染土壤的处理中，必须考虑接种多种微生物或者激发多样的土著微生物，以协同降解作用使不同类型的石油(稀油、高凝油、特稠油和稠油)污染土壤，特别是较难处理的稠油和特稠油污染土壤及回收石油后的废弃油泥均有理想的处理效果。

本发明的目的是提供一种由多种微生物合成的、协同作用强、降解能力大的降解石油固体菌剂的制备方法。

本发明的技术方案是采用真菌菌种，具体为：真菌中毛霉1株，青霉1株，曲霉1株，木霉1株和白腐真菌2株，分别取所述属中一株，经斜面培养、摇瓶培养、固体培养得单一固体培养物，将每种单一固体培养物等量混合均匀制得成品；具体操作步骤为：

(1)斜面培养：采用所述菌种，用常规方法制备的马铃薯培养基，将菌种接到准备好的试管中斜面上，在25～28℃培养5～7天，待孢子形成备用；

(2)摇瓶培养：上述斜面培养菌种均采用马铃薯综合培养基，培养基pH为自然，称取去皮、切成小块的马铃薯200～220g，加水煮25～30min后，过滤，上清液定容至体积为1000ml，然后加入葡萄糖或蔗糖18～20g，磷酸二氢钾1.0～1.2g，硫酸镁1.4～1.6g，Vb微量；将所述马铃薯综合培养基分装到300～500ml容积的三角瓶中，每瓶装量为75～150ml，在1个大气压下灭菌20～30min，冷却至室温～45℃，然后在无菌室中接种，即将斜面培养好的菌体转移到摇瓶中，置于摇床上，调节摇床速度120～125转/分钟，25～28℃培养5～7天，待孢子长好后进行固体培养；

(3)固体培养：固体培养基成分为高压灭菌后的麦麸或稻糠、稻壳和锯末，稻壳∶麦麸或稻糠∶锯末比例为3∶1∶1，将摇瓶中的液体培养菌体倒入上述采用的马铃薯综合培养基中混合均匀，此液代替水分，与灭菌后的麦麸或稻糠、稻壳和锯末固体培养基混合均匀，使含水率50-60％，于25～28℃室内培养5～7天，即得单一固体培养物；

将每种单一固体培养物等量混合均匀即制得成品，或将单一固体培养物风干，在常温下分别保存，临用前等量混合均匀制得成品；

所述毛霉1株为高大毛霉；所述青霉1株为产黄青霉；所述曲霉1株为棕曲霉；所述木霉1株为绿色木霉；白腐真菌2株分别为黄孢原毛平革菌和采绒革盖菌。

本发明具有如下优点：

本发明方法制备的菌剂投加方式是土著和添加微生物共用方式，菌剂的投加不仅是投加微生物，另一方面固体培养基也是共代谢底物和膨松剂，起到了激发多种土著微生物活性和改善微生物生态环境的作用，其协同作用强、降解能力大，使污染土壤取得了良好的处理效果，使不同类型的石油(稀油、高凝油、特稠油和稠油)污染土壤，特别是较难处理的稠油和特稠油污染土壤及回收石油后的废弃油泥有理想处理效果；本发明应用范围广，它适用于稀油、稠油、特稠油和高凝油污染土壤的生物修复。

图1为本发明实施例中石油烃的降解率比较图。

下面结合附图实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例1

采用真菌菌种，具体为：真菌中所述毛霉(Mucor sp.)1株为高大毛霉((Mucormucedo(L.)Fres.)；所述青霉(Penicillium sp.)1株为产黄青霉(Penicilliumchrysogenum Thom)；所述曲霉(Aspergillus sp.)1株为棕曲霉(Aspergillusochraceus Wilhelm)；所述木霉(Trichoderma sp.)1株为绿色木霉(Trichodermaviride Pers.ex Fr.)；所述白腐真菌(White rot fungi)2株为黄孢原毛平革菌(Phanerochaete Chrysosporium)和采绒革盖菌(Cviolus versicolor)，所述菌种为通过购买或采自稀油、高凝油、特稠油、稠油中降解能力强的优势菌种，将其依次分别取所述属中1株，经斜面培养、摇瓶培养、固体培养得单一培养物，将每种单一培养物等量混合均匀制得成品；具体操作步骤为：

(1)斜面培养：采用上述菌种，用常规方法制备的马铃薯培养基，具体步骤为：马铃薯去皮，切成小块，称取200g，煮沸30min，然后用纱布过滤，在上清液中加20g蔗糖，加15g琼脂，加水至1000ml，pH自然，在1个大气压下(1.05kg/cm²，121.3℃)灭菌30min，将菌种接到准备好的试管中斜面上，菌种在28℃培养5天，待孢子形成备用；

(2)摇瓶培养：上述斜面培养菌种采用马铃薯综合培养基，培养基pH为自然，其具体步骤为：称取去皮的马铃薯220g，加水煮25min，过滤，上清液定容至体积为1000ml，然后加入葡萄糖18g，磷酸二氢钾(KH₂PO₄)1.2g，硫酸镁(MgSO₄.7H₂O)1.6g，Vb微量，将所述马铃薯综合培养基分装到500ml容积的三角瓶中，每瓶装量为100ml，在1个大气压下灭菌20min，冷却至40℃时，在无菌室中接种，即接入上述斜面培养好的菌体，然后置于摇床上，调节摇床速度125转/分钟，25℃培养5天，待孢子长好后进行固体培养；

(3)固体培养：固体培养基成分为高压灭菌后的稻糠、稻壳和锯末，稻壳∶稻糠∶锯末比例为3∶1∶1，将摇瓶中的液体培养菌体倒入上述采用的马铃薯综合培养基中混合均匀，此液代替水分，与灭菌后的稻糠、稻壳和锯末固体培养基混合均匀，使含水率60％，于25℃室内培养，培养5天，即得单一固体培养物；

将每种单一固体培养物等量混合均匀即制得成品，或将单一固体培养物风干，在常温下分别保存，临用前等量混合均匀制成成品。

处理物是某采油厂对高含量油泥用物理化学方法回收石油后，产生的油泥废弃物，经过物理化学处理，由于高温和化学提取剂的作用，自然界存在的大量微生物已很少存在，土壤理化性质被彻底改变，还有化学浸提剂的残留等，为生物修复技术的应用增加了难度。

本发明将油泥废弃物放在Φ15×20cm陶瓷盆中，本实施例投加2.5％的固体菌剂，使处理物中的复合有机肥料5％〔含有机质39.3％，总氮(T-N)1.82％，五氧化二磷(P₂O₅)5.69％，氧化钾(K₂O)2.62％〕，客土10％，水分20％，pH＝7，在温度22～36℃(即正常大气温度)条件下，堆腐处理60天，每20天对堆料翻动一次。60天后处理物中石油烃去除46.67％，比不投加固体菌剂的高24.24％，如图1所示。

实施例2

与实施例1不同之处在于其具体操作为：

(1)斜面培养：菌种采用常规方法制备的马铃薯培养基，将菌种接到准备好的试管中斜面上，菌种在27℃培养6天，待孢子形成备用；

(2)摇瓶培养：上述斜面培养的菌种采用马铃薯综合培养基，培养基pH为自然，其具体步骤为：称取去皮的马铃薯200g切成小块，加水煮25min，过滤，上清液定容至体积为1000ml，然后加入蔗糖20g，磷酸二氢钾(KH₂PO₄)1.2g，硫酸镁(MgSO₄.7H₂O)1.4g，Vb微量；将所述马铃薯综合培养基分装到500ml容积的三角瓶中，每瓶装量为150ml，在1个大气压下灭菌25min，冷却至35℃时，在无菌室中接种，即将斜面培养好的菌体转移到摇瓶中，置于摇床上，调节摇床速度123转/分钟，26℃培养6天，待孢子长好后进行固体培养；

(3)固体培养：固体培养基成分为高压灭菌后的稻糠、稻壳和锯末，稻壳∶稻糠∶锯末比例为3∶1∶1，将摇瓶中的液体培养菌体倒入上述采用的马铃薯综合培养基中混合均匀，此液代替水分，与灭菌后的稻糠、稻壳和锯末固体培养基混合均匀，使含水率55％，于27℃室内培养6天，即得单一固体培养物；

将油泥废弃物放在Φ15×20cm陶瓷盆中，本实施例投加废弃物2％的固体菌剂，使处理物中的复合有机肥料10％(含有机质39.3％，T-N 1.82％，P₂O₅5.69％，K₂O 2.62％)，客土20％，水分10％，pH＝7，在温度22～36℃条件下，堆腐处理60天，每20天对堆料翻动一次。60天后处理物中石油烃去除率为49.03％，比不投加固体菌剂的高26.60％，如图1所示。

实施例3

与实施例1不同之处在于：

(1)斜面培养：所述菌种采用常规方法制备的马铃薯培养基，将菌种接到准备好的试管中斜面上，菌种在25℃培养7天，待孢子形成备用；

(2)摇瓶培养：上述斜面培养的菌种采用马铃薯综合培养基，培养基pH为自然，其具体步骤为：称取去皮的马铃薯210g切成小块，加水煮30min，过滤，上清液定容至体积为1000ml，然后加入蔗糖19g，磷酸二氢钾(KH₂PO₄)1.1g，硫酸镁(MgSO₄.7H₂O)1.5g，Vb微量；将所述马铃薯综合培养基分装到300ml容积的三角瓶中，每瓶装量为75ml，在1个大气压下灭菌30min，冷却至室温，然后在无菌室中接种，即将斜面培养好的菌体转移到摇瓶中，置于摇床上，调节摇床速度120转/分钟，28℃培养5天，待孢子长好后进行固体培养；

(3)固体培养：固体培养基成分为高压灭菌后的麦麸、稻壳和锯末，稻壳∶麦麸∶锯末比例为3∶1∶1，将摇瓶中的液体培养菌体倒入上述采用的马铃薯综合培养基中混合均匀，此液代替水分，与灭菌后的麦麸、稻壳和锯末固体培养基混合均匀，使含水率50％，于28℃室内培养7天，即得单一固体培养物，将每种单一固体培养物等量混合均匀即制得成品，或将单一固体培养物风干，在常温下分别保存，临用前等量混合均匀制得成品。

堆腐法处理油泥废弃物在本所室外实验场进行，将油泥废弃物放在Φ15×20cm陶瓷盆中，投加2.5％的固体菌剂，使处理物中的复合有机肥料5％(含有机质39.3％，T-N 1.82％，P₂O₅ 5.69％，K₂O 2.62％)，客土20％，水分30％，pH＝8，在温度22～36℃条件下，堆腐处理60天，每20天对堆料翻动一次。60天后处理物中石油烃去除51.20％，比不投加固体菌剂的高28.77％，如图1所示。

比较例

油泥废弃物不投加本发明固体菌剂，于同一实验场放置，其它条件相同，经过60天，测定石油烃去除率仅为22.43％，如图1所示。

Claims

1.一种降解石油固体菌剂的制备方法，其特征在于：采用真菌菌种，具体为：真菌中毛霉1株，青霉1株，曲霉1株，木霉1株和白腐真菌2株，分别取所述属中一株，经斜面培养、摇瓶培养、固体培养得单一固体培养物，将每种单一固体培养物等量混合均匀制得成品；具体操作步骤为：

将每种单一固体培养物等量混合均匀即制得成品，或将单一固体培养物风干，在常温下分别保存，临用前等量混合均匀制得成品。

2.按照权利要求1所述降解石油固体菌剂的制备方法，其特征在于：所述毛霉1株为高大毛霉。

3.按照权利要求1所述降解石油固体菌剂的制备方法，其特征在于：所述青霉1株为产黄青霉。

4.按照权利要求1所述降解石油固体菌剂的制备方法，其特征在于：所述曲霉1株为棕曲霉。

5.按照权利要求1所述降解石油固体菌剂的制备方法，其特征在于：所述木霉1株为绿色木霉。

6.按照权利要求1所述降解石油固体菌剂的制备方法，其特征在于：白腐真菌2株分别为黄孢原毛平革菌和采绒革盖菌。