CN110592063B - 一种修复石油烃污染物的制剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于土壤修复技术领域，具体的说是涉及一种修复石油烃污染物的制剂及其应用。制剂为微生物固定于裂解获得的生物炭材料中；其中，炭材料中微生物的单载量为3.2‑6.5×1010cfu/g；所述微生物为不动杆菌HC8‑3S和迪次氏菌CN‑3。本发明复配的表面活性剂清洗液清洗效率高，土壤残留小。制备的生物炭固定化微生物材料具有固定率高、生产成本低、促进土壤微生态环境改良、对环境不造成二次污染等优点，用于石油及石油产品污染土壤的修复。

Description

一种修复石油烃污染物的制剂及其应用
技术领域
本发明属于土壤修复技术领域，具体的说是涉及一种修复石油烃污染物的制剂及其应用。
背景技术
石油是现代工业重要能源之一，而在石油开采、运输、贮藏和加工等过程中各种泄露污染事件频频发生，破坏土壤生态系统，通过食物链富集，危及人类健康，土壤石油污染问题日益突出。
当前可通过填埋、焚烧、萃取等办法处理，但这些方法都存在价格昂贵、二次污染等问题。微生物修复技术即利用土著微生物吸收、转化、清除或降解有机污染物，是生物修复处理石油污染的重要方法。目前，已知降解石油的微生物共有70属200余种，土壤中最主要的降解细菌有：假单胞菌属(Pseudomonas)、无色杆菌属(Achramobacter)、不动杆菌属(Acinetobacter)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、节杆菌属 (Archrobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、棒杆菌属(Coryneforms)、微球菌属(Micrococcus)、放线菌属(Actinomycetes)、等。但高浓度石油类污染物多属于疏水性有机污染物，毒性大，释放极其缓慢，使得微生物、植物难以存活，生物修复方式将受到较大限制。表面活性剂能降低水的表面张力并提高有机化合物可溶性，提高微生物降解的修复效率。表面活性剂对微生物群落丰度及结构也会造成改变从而影响微生物发酵，有利于微生物的富集和活性的发挥，提高微生物降解石油的效率。研究显示，非和阴离子表面活性剂按一定比例混合，会产生协同增溶作用，且降低表面活性剂在土壤颗粒上的吸附损失，增加溶液中表面活性剂胶束的浓度。
微生物修复包括强化土著微生物降解和投加外源高效降解微生物。而外源高效降解微生物面临与土著微生物竞争和难以适应新的土壤环境等问题。作为一种绿色高效的修复技术，固定化微生物技术受到越来越多的关注。相比游离微生物，固定化微生物具有富集浓度高、活性较高、生物稳定性好、环境耐受性强、可长时间保存等优势；而微生物的生长与代谢都与载体材料有关，生物炭具有高度多孔性和较高的比表面积，有良好的吸附性能。石油是一种复杂混合物，单个石油降解菌株只能代谢一定范围内不同种类的烃，而将具有各种酶活力的菌株进行混合培养对石油的降解效果明显高于单株菌培养。目前用于生物修复的高效降解菌大多是多种微生物混合而成的复合菌群。
随着土壤修复技术的研究深入，各种土壤污染的修复方法和微生物菌剂被广泛应用。2008年高冬梅等人公开了一种高浓度石油污染土壤的生物修复装置和方法(公开号CN101234392 A，申请号200810014714.2)， 2016年孙予罕等人公开了一种石油污染土壤微波快速修复与油品回收的方法及装置(公开号CN105689381A，申请号201610044637.X)，这些修复方法属于异位修复法，适合于污染严重的土壤，成本较高，不适合于大规模土壤修复。2018年李诗恬等人公开了一种用于石油烃污染土壤修复的淋洗药剂及其制备和应用(公开号CN 108441223 A，申请号 201810198339.5)，2018年郑春丽等人公开了一种使用微生物复合土壤修复剂修复污染土壤的方法(公开号CN 108637011 A，申请号 201810442668.X)，2018年王竞等人公开了一种滨海石油污染土壤修复剂的原地制备方法及其应用(公开号CN108676561A，申请号 201810376121.4)，这些方法属于原位修复法，通过使用药剂淋洗或添加微生物制剂以及改良剂等完成土壤的修复过程，修复成本相对较高，微生物制剂的活菌数目有限，最终修复效率偏低。
针对现存的药剂淋洗及微生物菌剂在石油烃污染土壤的原位修复过程中所存在的问题，急需一种用以提升微生物菌剂修复污染土壤的效率的方法。
发明内容
本发明针对目前药剂淋洗和微生物菌剂在石油污染土壤修复技术中所存在问题，提供一种修复石油烃污染物的制剂及其应用，用以提升微生物菌剂修复污染土壤的效率。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种修复石油烃污染物的制剂，制剂为微生物固定于裂解获得的生物炭材料中；其中，炭材料中微生物的单载量为3.2-6.5×1010cfu/g；所述微生物为不动杆菌HC8-3SAcinetobacter sp.HC8-3S和迪次氏菌属CN-3 Dietzia sp.CN-3。
所述不动杆菌HC8-3S Acinetobacter sp.HC8-3S，保藏号：CCTCC NO:M 2019449，保藏日期2019年6月12日；所述迪次氏菌属CN-3Dietzia sp.CN-3，保藏号：CCTCC NO:M2015537，保藏日期为2015年9月15 日；保藏单位均为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。
一种修复石油烃污染物的制剂的制备方法，以农业废弃生物质作为原料在300-500℃下进行高温裂解获得生物炭材料；而后采用吸附法将不动杆菌HC8-3SAcinetobacter sp.HC8-3S和迪次氏菌属CN-3Dietzia sp. CN-3菌悬液固定至生物炭材料，获得生物炭固定化微生物材料，即修复石油烃污染物的制剂；其中，所述菌悬液与生物炭以10-15:1的比列进行吸附固定。
将所述生物炭材料与混合菌液混合，于30-37℃、振荡培养过夜，过滤、洗涤、烘干是菌液吸附于生物炭材料上；其中，混合菌液物为不动杆菌HC8-3S和迪次氏菌属CN-3菌悬液配制成OD600＝0.5。
一种修复石油烃污染物的制剂的应用，所述制剂在修复石油烃污染物土壤中的应用。
所述制剂接种于经表面活性剂洗涤液后的修复石油烃污染物土壤中；其中，制剂的接种量为3-5％。
所述洗涤后的修复石油烃污染物土壤为将待修复石油烃污染物土壤分筛后经洗涤液洗涤，洗涤后固液分离，收集固体，待用；其中，洗涤液为表面活性剂清洗液和清洗助剂，比例为1-3:3-5；所述表面活性剂清洗液为十二烷基硫酸钠(SDS)TW-80、TX-100中的一种或几种的组合；清洗助剂为木质素磺酸钠和/或硅酸钠。
一种使用复合表面活性剂强化微生物菌剂修复石油烃污染土壤的方法，将待修复石油烃污染物土壤处理后经表面活性剂洗涤液洗涤，洗涤后分离，收集固体并向其中接种所述制剂，于20-26℃混合堆放经润湿后即可实现对石油烃污染土壤的修复。
将待修复石油烃污染物土壤分筛后经表面活性剂洗涤液洗涤，洗涤后固液分离，收集固体，待用；其中，表面活性剂洗涤液为表面活性剂清洗液和清洗助剂按1-3:3-5的质量比混合；所述表面活性剂清洗液为十二烷基硫酸钠(SDS)TW-80、TX-100中的一种或几种；清洗助剂为木质素磺酸钠和/或硅酸钠。
所述待修复石油烃污染物土壤粉碎，去除杂质，晾晒至含水量低于 8％呈细土松散状。
原理说明
表面活性剂能降低水的表面张力并提高有机化合物可溶性，并且对微生物群落丰度及结构造成改变从而影响微生物发酵，有利于微生物的富集和活性的发挥，提高微生物降解石油的效率。使用表面活性剂清洗石油烃污染土壤，降低土壤中石油烃含量，避免石油降解微生物受到高浓度石油烃的刺激危害。当向污染土壤中施加微生物菌剂时，外源高效降解微生物面临与土著微生物竞争和难以适应新的土壤环境等问题，而固定化微生物具有富集浓度高、活性较高、生物稳定性好、环境耐受性强等优势，有利于提高微生物对污染土壤中石油烃的降解效率。
本发明所具有的有益效果
本发明修复方法通过复合表面活性剂强化微生物菌剂进而修复石油烃污染土壤，该方法首先通过复配表面活性剂对石油烃污染土壤进行清洗，降低土壤含油量。将高效石油烃降解菌固定至生物炭，制成生物炭固定化微生物材料，配合洗脱后土壤中残留的表面活性剂，进一步分解土壤中的石油烃，石油污染土壤的降解效果明显；具体为：石油烃清洗去除率达到50.7％，微生物菌剂进一步降解后除率最终达到82.7％。
1.本发明通过利用非和阴离子表面活性剂之间的协同增溶作用，制成复合表面活性剂清洗液，提高了表面活性剂对石油污染土壤的清洗效率，并且土壤中残留的表面活性剂有助于石油降解微生物的富集和活性的发挥，提高微生物降解石油的效率。
2.本发明通过将高效石油降解菌固定至生物炭中制得生物炭固定化微生物材料，使石油降解微生物具有有利的生存空间，且微生物富集浓度高，极大的增强了微生物与石油烃的作用效率，促进了土壤中石油烃的降解。
3.本发明中所应用的用于制备生物炭的原材料为农业废弃生物质玉米秸秆，提升了秸秆的利用率，维护生态，节约资源，降低了生物炭固定化微生物材料的生产成本。
附图说明
图1为本发明实施例提供的石油烃污染土壤修复流程图；
图2为本发明实施例提供的表面活性剂及助剂对石油烃去除效果的影响图，其中，a为单一表面活性剂石油烃去除效果，b复合表面活性剂石油烃去除效果；
图3为本发明实施例提供的裂解温度对固定化微生物洗脱液OD600的影响图；
图4为本发明实施例提供的微生物菌液及固定化微生物材料对石油烃的去除效果图。
具体实施方式:
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，但本发明所保护范围不限于此。
本发明通过利用复合表面活性剂清洗石油污染土壤，降低土壤中石油烃含量，避免石油降解微生物受到高浓度石油烃的刺激危害，石油烃清洗去除率达到50.7％。通过利用微生物固定化技术，将高效石油降解菌株固定至生物炭中制成生物炭固定化微生物材料，为石油降解微生物提供更有利于生长的微环境，配合土壤中残留的表面活性剂并结合生物炭的吸附效果，促进污染土壤中石油烃的降解，去除率最终达到82.7％。本发明复配的表面活性剂清洗液清洗效率高，土壤残留小。制备的生物炭固定化微生物材料具有固定率高、生产成本低、促进土壤微生态环境改良、对环境不造成二次污染等优点，用于石油及石油产品污染土壤的修复。
生物材料来源：
制备该土壤修复固定化微生物材料的菌种均由本实验室自主筛选获得。
实施例1
固定化微生物材料的制备
(1)以农业废弃生物质玉米秸秆为原料制备生物炭。秸秆去除杂质，清洗后自然风干7d，并初步粉碎至1-2cm大小，50℃烘干4h，烘干后将秸秆放入马弗炉中，升温前通入高纯氮气20min，以形成无氧环境，5 ℃/min升温速率分别升温至300、400、500℃，每个温度下热解2h，制得不同裂解温度的生物炭材料；将制得的生物炭进一步粉碎后，过2mm 筛，保存备用。
(2)对保存在-80℃冰箱中的不动杆菌HC8-3S和迪次氏菌属CN-3分别进行复苏培养，将复苏菌液分别转接至2216E培养基中，在30℃,150rpm 恒温摇床中进行扩大培养，获得两株菌的菌悬液，将两种菌悬液按体积 1:1的比例混合。
(3)将上述步骤(1)获得不同裂解温度的生物炭材料分别添加至盛有混合菌悬液的三角瓶中按质量比1:10的比例混合，混合后放置于30 ℃、转速120r/min的摇床震荡培养24h进行固定，而后以4000r/min速度离心10min，弃去上清液；沉淀用0.85％生理盐水洗涤，洗涤后再以 4000r/min速度离心5min，收集沉淀再次按上述记载方式洗涤，共重复清洗两次，分别所得固体物质即为微生物固定化菌剂，将其4℃保存以备后用。
采用固定化微生物材料洗脱液在600nm处吸光度表示固定化材料对微生物菌株的吸附量，具体测试不同温度下的固定化微生物材料洗脱液的吸附量：
分别取1g不同裂解温度下固定化微生物材料于洁净三角瓶中，加入 10mL生理盐水，用漩涡振荡器振荡3min，2000rpm转速下离心3min，取上清液分别转移至50mL容量瓶中，重复3次，最后用生理盐水定容至 50mL，得到不同裂解温度下固定化微生物材料洗脱液，采用可见光分光光度计于600nm出测其吸光度(参见图3)。
由图3可见三种热解温度(300，400和500℃)下制备的生物炭材料对微生物的吸附量情况，随温度的升高，生物炭对微生物的吸附量逐渐增大，500℃时OD600达到最大。表明采用热解温度为500℃所获得的生物炭固定的为微生物含量最高，有助于提高石油污染土壤的修复效率。
实施例2
修复污染土壤，如图1所示：
1)表面活性剂清洗污染土壤
将石油污染土壤粉碎，去除杂质，室外晾晒8h，于方形浅盘中存放，加入清洗液，(清洗液为洗涤液、单一表面活性剂清洗液或混合表面活性剂清洗液)，将浅盘于搅拌器下室温搅拌24h，拌结束后使其自然沉降，弃去液相，将固相取出于避光通风处风干，将浅盘封存以备后用，测定土壤中石油烃含量(参见图2)。
其中，洗涤液中表面活性剂终浓度为3g/L，助剂终浓度为5g/L，表面活性剂为质量比SDS:TW-80:TX-100＝2:2:1，助剂为质量比木质素磺酸钠：硅酸钠＝1:1；所述清洗时石油污染土壤与清洗液的固液比1:5(g/L)。
单一表面活性剂清洗液为水、十二烷基硫酸钠(SDS)、TW-80或 TX-100；
混合表面活性剂清洗液为将SDS、TW-80和TX-100按照不同质量比混合；
上述记载的污染土壤中油含量的测定具体为：采用红外光谱法测定石油污染土壤中石油烃的含量。取1g土样于洁净三角瓶中，加入25mL四氯化碳萃取样品中的油类物质，摇匀后室温静置12h，将三角瓶洗涤后全部转移至分液漏斗中，振荡1min，振荡过程中经常开启旋塞排气，待静置分层，将有机相转移至新的三角瓶中，加入3g无水硫酸钠，充分摇匀后静置10min，将上层萃取液转移至砂芯漏斗过滤，随后向滤液中继续添加3g硅酸镁，除去动植物油类等极性物质，将三角瓶置于摇床中180rpm、 30min，将三角瓶中的液体再次转移至砂芯漏斗中过滤，用四氯化碳将滤液定容至50mL，使用红外光谱仪测定石油烃的含量。
由图2可见，a图为单一表面活性剂时TW-80的清洗效果最好，其石油污染土壤中石油的去除率为25.2％，b图将SDS：TW80：Triton X-100 按不同质量比进行复配，当使用符合表面活性剂清洗时，其去除率均高于任何单一的表面活性剂，且去除效率最高的表面活性剂质量比为：SDS： TW80：Triton X-100等于2：2：1，去除率达到42.7％，同时经洗涤液清洗后对石油烃去除效果石油烃去除率为50.7％；由上述结果表明，阴离子和非离子表面活性剂复合清洗石油污染土壤时表现出协同作用，促进了石油烃的去除，而通过添加助剂，进一步提高了复合表面活性剂对石油烃的去除效率。
实施例3
将上述实施例1步骤(2)获得菌液，步骤(1)所得生物碳、将上述获得500℃裂解温度下固定化微生物材料分别与污染土壤进行混合，进行降解，测定土壤中石油烃含量，(参见图4)
同时，将上述获得500℃裂解温度下固定化微生物材料添加到经清洗液洗涤后后的石油污染土壤中，而后加水使土壤含水量达到25％，添加适量正常土壤和木屑，充分搅拌均匀，将浅盘放置自然条件下，温度20-26 ℃，定期补水、翻匀并添加NH4Cl和K2HPO4，使土壤中的N、P浓度分别达到2000mg/kg和200mg/kg；而后每7d取样一次并低温保存，测定土壤中石油烃含量；其中，正常土壤：污染土壤＝1:20(质量比)；木屑：污染土壤＝1:10(质量比)。
接种后，每隔一周均匀翻动一次，并添加水保持土壤含水量在25％左右；同时以未经清洗液清洗的污染土壤通过自然沉降的方式作为对照(参见图4)。
由图4可见石油污染土壤不进行洗脱及微生物修复处理，通过自然降解，60d后土壤中含油量的去除率为17.9％。向处理后土壤中添加生物炭，仅凭借生物炭本身对石油烃吸附作用，土壤中石油烃的去除率为19.5％；向土壤中施加混合微生物菌液，通过石油降解微生物代谢作用，土壤中石油烃去除率达到25.2％；在对污染土壤中施加生物炭固定化微生物材料时，土壤中石油烃的去除效果显著，去除率为32％，石油污染土壤经清洗和微生物修复石油烃去除率最终达到82.7％，土壤中石油烃含量为0.77％；而向土壤中分别施加微生物菌液和生物炭时，土壤中石油烃的去除率仅为28.2％。由此可见，生物炭为外源石油降解微生物提供了有利的缓冲微环境，避免了不利土壤条件的侵害作用，保证接种的石油降解微生物的良好生长，提高了污染土壤中石油烃的去除效率。

Claims (9)

1.一种修复石油烃污染物的制剂，其特征在于：制剂为微生物固定于裂解获得的生物炭材料中；其中，炭材料中微生物的单载量为3.2-6.5×1010cfu/g；所述微生物为不动杆菌（Acinetobacter）HC8-3S和迪次氏菌（Dietzia）CN-3；
所述不动杆菌HC8-3S，保藏号：CCTCC No. M 2019449，保藏日期2019年6月12日；所述迪次氏菌CN-3，保藏号：CCTCC No. M 2015537，保藏日期为2015年9月15日；保藏单位均为中国典型培养物保藏中心（CCTCC）；
所述生物炭材料为以农业废弃生物质作为原料在300-500℃下进行高温裂解获得的生物炭材料。
2.一种权利要求1所述的修复石油烃污染物的制剂的制备方法，其特征在于：以农业废弃生物质作为原料在300-500℃下进行高温裂解获得生物炭材料；而后采用吸附法将不动杆菌HC8-3S和迪次氏菌CN-3菌悬液固定至生物炭材料，获得生物炭固定化微生物材料，即修复石油烃污染物的制剂；其中，所述菌悬液与生物炭以10-15:1的比列进行吸附固定。
3.按权利要求2所述的修复石油烃污染物的制剂的制备方法，其特征在于：将所述生物炭材料与混合菌液混合，于30-37℃、振荡培养过夜，过滤、洗涤、烘干使菌液吸附于生物炭材料上；其中，混合菌液为不动杆菌HC8-3S和迪次氏菌CN-3菌悬液配制成的OD600=0.5的菌液。
4.一种权利要求1所述的修复石油烃污染物的制剂的应用，其特征在于：所述制剂在修复石油烃污染物土壤中的应用。
5.按权利要求4所述的修复石油烃污染物的制剂的应用，其特征在于：所述制剂接种于经表面活性剂洗涤液洗涤后的修复石油烃污染物土壤中；其中，制剂的接种量为3-5%。
6.按权利要求5所述的修复石油烃污染物的制剂的应用，其特征在于：所述洗涤后的修复石油烃污染物土壤为将待修复石油烃污染物土壤分筛后经洗涤液洗涤，洗涤后固液分离，收集固体，待用；其中，洗涤液为表面活性剂清洗液和清洗助剂，比例为1-3:3-5；所述表面活性剂清洗液为十二烷基硫酸钠（SDS）、TW-80、TX-100中的一种或几种的组合；清洗助剂为木质素磺酸钠和/或硅酸钠。
7.一种使用复合表面活性剂强化微生物菌剂修复石油烃污染土壤的方法，其特征在于：将待修复石油烃污染物土壤处理后经表面活性剂洗涤液洗涤，洗涤后分离，收集固体并向其中接种权利要求1中所述制剂，于20-26℃混合堆放经润湿后即可实现对石油烃污染土壤的修复。
8.按权利要求7所述的使用复合表面活性剂强化微生物菌剂修复石油烃污染土壤的方法，其特征在于：将待修复石油烃污染物土壤分筛后经洗涤液洗涤，洗涤后固液分离，收集固体，待用；其中，洗涤液为表面活性剂清洗液和清洗助剂按1-3:3-5的质量比混合；所述表面活性剂清洗液为十二烷基硫酸钠（SDS）、TW-80、TX-100中的一种或几种；清洗助剂为木质素磺酸钠和/或硅酸钠。
9.按权利要求7所述的使用复合表面活性剂强化微生物菌剂修复石油烃污染土壤的方法，其特征在于：所述待修复石油烃污染物土壤粉碎，去除杂质，晾晒至含水量低于8%呈细土松散状。
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