CN113042521B - 一种抗Cr(Ⅵ)胁迫的石油类污染土壤固定化生物修复方法 - Google Patents

一种抗Cr(Ⅵ)胁迫的石油类污染土壤固定化生物修复方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗Cr(Ⅵ)胁迫的石油类污染土壤固定化生物修复方法。利用苦荞壳为原料，通过在乙二胺水溶液以及坏血酸溶液中水热碳化、在甲酸中旋转加热以及负载纳米零价铝逐步提高生物炭的还原性，以期实现Cr(Ⅵ)的还原；通过负载谷氨酰半胱氨酸合成酶、谷胱甘肽合成酶增强微生物的解毒能力；该方法对于重金属Cr(Ⅵ)胁迫的石油类污染土壤的生物修复十分有效，在去除石油类的同时也部分去除了土壤中的重金属Cr(Ⅵ)。

Description

一种抗Cr(Ⅵ)胁迫的石油类污染土壤固定化生物修复方法
技术领域
本发明属于环境修复技术领域和微生物固定领域，具体涉及一种抗Cr(Ⅵ)胁迫的石油类污染土壤固定化生物修复方法。
背景技术
随着国家油气能源开发规模的扩大，在油气能源的开采、加工、运输以及贮存等过程中，给土壤环境造成了极大的污染，污染物破环土壤微生物和植物的细胞膜，抑制土壤酶活，甚至进入食物链富集到人体类，对人体健康造成极其严重的危害。生物修复因其简单方便、成本低廉、无二次污染的特点，而在石油类污染土壤修复中被广泛使用。CN110003913A将氧化镁负载在蒙脱石的表面和层间，与生物炭混合，能够对大部分重金属均有良好的修复效果，并且具备经济成本低廉，环境友好等特点。CN109603747A将椰壳生物炭置于质量浓度为3～7％的卤化物溶液中，浸泡改性后过120～200目筛，与重金属按重量比大于20:3、30～100℃条件下置于含有重金属的混合物中，能够实现对重金属的强烈吸附。CN111530421A利用高锰酸钾和硫酸亚铁改性剂对玉米秸秆生物碳进行改性，并通过二次正交通用旋转设计，对对生物炭改性处理，拟增加生物炭对重金属吸附固定能力。CN110238190A同时采用微生物去除、重金属去除装置、蚯蚓富集和蛆虫富集，经济合理可有效减少土壤中重金属总量。CN110106162A将载体制备成微球状，内部有孔隙，弱碱性，该微球不但能发挥载体对镉的化学吸附作用，还能改善活性微生物的生长繁殖环境，从而提高活性细菌对镉的胞外吸附和胞内积累作用。CN105695445A采用海藻酸钠、CaCl2、纳米二氧化硅以及低聚木糖制备固定化载体，该固定化能使微生物的生境条件由单纯好氧转变成好氧、缺氧、厌氧并存，丰富了其生物化学反应的途径，从而提升其对复杂有机污染物的降解能力。
目前，生物修复技术往往针对单一的重金属或石油类的土壤修复，而对于同时受到重金属、石油污染土壤修复的技术较少。然而污染土壤中除了严重的石油类污染物质外，往往也会有以重金属为主的无机污染，导致在在石油类污染土壤的生物修复中，石油类降解菌受到重金属的抑制，生物修复效率显著降低。本研究针对重金属Cr(Ⅵ)胁迫条件下，研发了石油类污染土壤的高效修复技术，在实施过程中，以苦荞壳为原材料，制备生物炭，通过在生物炭表面引入含N基团、通过抗坏血酸和甲酸增强生物炭的C＝O、以及通过在生物炭的内部微孔中填充还原性纳米材料来提高生物炭的还原性，实现高价、高溶解性重金属污染物Cr(Ⅵ)的还原，降低毒性作用；同时通过在固定化载体的大孔以及固定化微生物的表面负载生物表面活性剂和金属硫蛋白对重金属Cr(Ⅵ)的络和，并且将谷氨酰半胱氨酸合成酶、谷胱甘肽合成酶通过分散在表面活性剂中的方式固定在微生物附近，以期提高微生物的谷胱甘肽的合成速率，增强微生物的解毒能力。从还原重金属Cr(Ⅵ)和提高微生物的解毒能力共同减弱重金属对于固定化微生物的胁迫作用，提升石油污染土壤的生物修复工作效率。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于在重金属Cr(Ⅵ)胁迫作用下强化石油类污染的土壤的生物修复的，通过引入-NH2和C＝O基团、内部微孔填充铝基纳米材料增强生物炭载体的还原性，并通过负载酶系提升微生物解毒能力的固定化微生物菌剂的制备方法，拟解决目前修复过程中重金属常被吸附在生物炭载体上从而不断加深对微生物毒害作用的技术难题，且以苦荞壳为原料，为农业废弃物资源化利用提供一条有效途径。本发明具体按以下步骤进行：
1、将生物质原料，进一步优化为苦荞壳，在280～300℃、5～7MPa条件下，在20～30％的乙二胺水溶液中水热碳化8～12h，而后通过10～12％的盐酸进行清洗孔道去除孔道内的堵塞物质。
2、将苦荞壳制备的生物炭载体通过在50～60％的抗坏血酸溶液中进行200～250℃、2～4MPa的水热碳化6～8h，进一步增强生物炭的还原性，同时降低生物炭的零电荷点。
3、将生物炭载体置于棕色反应器中加入去离子水，生物炭的加量和去离子水的加量比值为5％～10％(w:w)，55～60℃加热搅拌，间隔4～5分钟，滴加2～3mol/L甲酸，甲酸投加量为生物炭质量的4％～7％，确保生物炭表面的零电荷点保持在2～3，氧化还原电位低于-300mv，沉淀。
4、将沉淀的生物炭加入在浓度为20～25g/L纳米零价铝溶液中，生物炭和纳米材料溶液的加量比值为50％～60％(w:w)，超声反应30～40min，采用超声频率为40～50kHz，反应过程中，超声波功率密度为1200～1500w/m3。
在120～150kPa氮气分压的保护作用下，将经过超声的生物炭在120～150r/min的条件下搅拌24～30h，静止6～10h，通过无氧水过滤并轻微冲洗，800～1000r/s离心3～5min，收集离心管底部产物，得到制备的微生物固定化生物炭载体。
5、将具有较高石油类降解性能的细菌以1％的接种量接入牛肉膏蛋白胨培养基中，在150r/min，30℃条件下震荡培养15～20h后，放入10～15cm深的容器中静置1～2h；将经过去离子水冲洗pH至6.5～7的生物炭按照10％(w:w)的量投到牛肉膏蛋白胨培养基中，在牛肉膏蛋白胨液体培养基液面下2～3cm处按照40～50r/min的速率搅拌20～30h，利用生物炭吸附、固定石油类降解微生物，沉淀2～3h，收集固定化微生物菌剂。
6、将制备的生物炭固定化微生物菌剂投入混合溶液中浸泡，所述混合溶液中包括：鼠李糖脂、谷氨酰半胱氨酸合成酶、谷胱甘肽合成酶、金属硫蛋白，浓度分别为5g/L、100μmol/L、120μmol/L、200μmol/L，浸泡后0.2～0.5h，将生物炭固定化微生物菌剂沥干，用30～35℃的N2风干，直到生物炭固定化微生物菌剂含水率为35～40％。
7、针对不同的土壤性质、污染物特征的土壤生物修复，本固定化微生物菌剂的投加量略显不同，大体可参考如下公式确定固定化菌剂的投加量：
Q＝A×C石油+0.25×B×C×CCr(VI)+2.5×D×C水+0.15×E×D土
其中：
Q——固定化菌剂的投加量，吨/亩；
C石油——土壤中石油污染物的浓度，g/kg；
CCr(VI)——土壤中Cr(VI)的浓度，mg/kg；
C水——土壤中含水率；
D土——土壤平均粒径，mm；
A——系数，当土壤中石油类含量为7～13g/kg、14～20g/kg、20～30g/kg时，A的取值范围分别为1～1.3、2～3、6～8。
B——系数，当土壤中重金属Cr(VI)含量为3～8、9～20、21～28、29～40mg/kg时，B的取值分别取0.8～1.2、3～5、10～12、26～38。
C——系数，当土壤中的重金属Cr(VI)分别以水溶态+交换态、碳酸盐结合态、铁锰氧化物结合态、有机结合态和残留态为最多的存在形态时，C的取值分别为2～3、0.8～1、0.7～1、3～5、0.8～1.2。
D——系数，当土壤的含水率分别为5～15％、16～30％、31～50％时，D的取值分别为1.2～1.5，1.0～1.3，2～3。
E——系数，若土壤粒径分别为大于0.2mm、0.2～2mm，0.02～0.2mm、0.002～0.02mm时，E的取值范围约为0～0.2、0.4～0.6、56～100和6000～10000。
方法特点：
本发明中，步骤1中在280～300℃进行水热碳化可以在生物炭表面保留大量-NH2、-NO2基团，同时280～300℃温度下生物炭表面更易生成均匀分散的微球微观形状，能够提供更多结合位点。此外，通过与乙二胺进行水热碳化的方式可以将乙二胺的-NH2基团结合在生物炭的苯环结构上，增多生物炭的-NH2结构，从而增强生物炭的还原性；通过HCl溶液疏通生物炭孔道为后续负载微生物以及纳米材料提供有利条件。
步骤2中选择采用抗坏血酸增强苦荞壳生物炭表面的还原性，负载在生物炭表面的抗坏血酸也可通过逐级供给电子而转变为半脱氢抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的过程，清除细菌胞内超负氧离子(O2 -)、羟自由基(OH-)、有机自由基(R-)和有机过氧基(ROO-)等自由基，避免生物炭载体固定的石油类降解菌受到重金属和石油类污染物引起的脂质过氧化反应，此外抗坏血酸也能起到维持微生物的巯基酶的活性，减轻重金属Cr(Ⅵ)与半胱氨酸残基侧链上的巯基(-SH)结合的能力，增强微生物体内中L-半胱氨酸对重金属离子Cr(Ⅵ)的解毒能力。考虑到抗坏血酸具有极强的还原性，在空气中容易被氧化，因此选择水热碳化将抗坏血酸负载在生物炭上。本发明中，创新地选择水热碳化将抗坏血酸负载在生物炭上，避免其在空气中容易被氧化。为避免步骤1中已经在生物炭表层形成了纳米级、均匀分散的微观表面结构，在步骤2中不被破坏，同时为了减少生物炭中的碳损失，优选水热碳化条件为：反应温度200～250℃、压力为2～4MPa、反应时间6～8h。
步骤3中为选择甲酸进一步增强生物炭载体表面的还原性，为避免其氧化，在避光的棕色烧瓶中进行反应，55～60℃的旋转加热方式可使甲酸以及甲酸中的C＝O基团均匀负载在生物炭上，增强其还原性。同时，本步骤中通过不断改变甲酸的总滴加量，可降低生物炭表面的零电荷点至3以下，在pH>3的土壤中可有效与重金属Cr(Ⅵ)发生静电吸附，当重金属Cr(Ⅵ)被吸附在生物炭上时，生物炭能更好地将其还原降低其生物毒性。
步骤4中，由于纳米零价铝属于轻金属，具有十分好的安全性、环境风险较低；铝原子的电负性为1.6，单质铝具有极强的还原性；铝的密度为2.7×10 3kg/m3，填充在生物炭中不会使土壤容重增加，从而降低生物炭对于土壤的调节作用，考虑到纳米零价铝所具备的上述特征，选择纳米零价铝填充在生物碳的微孔内，降低重金属Cr(Ⅵ)对于石油类降解菌的胁迫作用。实施过程中通过配置20～25g/L的浓度、超声分散，24～30h的震荡吸附，可以充分使纳米零价铝进入到生物碳的微孔内并进行有效填充。此外，当生物炭载体中填充的纳米零价铝被氧化后仍旧能通过纳米氧化铝与重金属Cr(Ⅵ)形成外层络合、内层络合和界面沉淀来结合重金属离子Cr(Ⅵ)，持久减弱重金属Cr(Ⅵ)对于载体表面和孔径内的微生物的毒性作用。
步骤5中先将微生物震荡培养至稳定期，而后与微生物静止在10～15cm深的容器中，通过在培养基上层液面处搅拌为微生物的生长提供氧气，而静置在容器底层的生物炭减少了与空气接触从而仍保持较强的还原性。微生物不断生长，后沉降在生物炭上，逐步在生物炭表层和孔道内生长，经过20～30h的生长形成固定化微生物。
步骤6中将固定化微生物菌投入混合溶液中的目的是在微生物的表层覆盖一层保护膜；其中表面活性剂鼠李糖脂和金属硫蛋白的目的是为了结合土壤中的重金属Cr(Ⅵ)从而降低其生物毒性，而谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶的目的是为了提高微生物的解毒能力，保证微生物体内谷胱甘肽的正常合成，这与步骤2中采用抗坏血酸维持巯基酶的活性共同有效保证微生物免受重金属的毒害作用。
步骤7中石油污染和重金属Cr(Ⅵ)污染程度直接决定了生物修复中微生物的数量。石油污染浓度越大，对微生物的毒性越大，生物修复周期越长，因此需要的微生物数量越多；重金属浓度越大，对微生物的毒害作用越强，对石油污染物质的降解效果越差，因此随着重金属浓度的增加，固定化微生物的投加量也势必增加。重金属在土壤中的存在形式以及可迁移性决定了其对微生物毒害作用的强弱，一般而言，土壤中重金属的毒性，有机结合态>水溶态+交换态>残留态>碳酸盐结合态+铁锰氧化物结合态，土壤中含水量决定了重金属的迁移性，一般而言，含水率越高，重金属迁移性越强，对土壤中微生物的毒性抑制作用越强，土壤的石油污染修复效果越差，但若含水率极低会导致微生物生长繁殖变缓，同样也会减弱微生物对石油污染物质的生物降解。土壤颗粒大小也会影响微生物对于石油污染的生物降解效果，土壤颗粒过细容易导致土壤板结不利于微生物进行呼吸作用，从而降低石油污染土壤的生物修复效果。本发明结合重金属Cr(Ⅵ)对于微生物的抑制作用、生物炭固定化载体对于微生物保护作用，土壤中重金属Cr(Ⅵ)及石油类的迁移转化作用的综合分析，创新了抗重金属Cr(Ⅵ)胁迫的石油类污染土壤固定化生物修复方法。
具体实施方式
实施例1
本实施例是针对四川长宁页岩气井场内部石油烃类污染土壤开展的抗重金属Cr(Ⅵ)胁迫的土壤固定化石油类污染土壤修复方法的研发。
利用苦荞壳为原料，将苦荞壳依次用自来水和纯净水洗净，105℃烘干12h，将干燥后的原料粉碎，过10目筛。通过以下四种手段逐步强化生物炭的还原能力，第一，取粉碎后的苦荞壳置于反应釜中，同时加入质量分数为20％的乙二胺水溶液500mL，在280℃、5000kPa条件下水热碳化8h，过滤得到生物炭，并用体积分数为10％的盐酸清洗生物炭。第二，将清洗后的生物炭置于另一个装有500mL的体积分数为50％的抗坏血酸溶液的反应釜中，在200℃、2000kPa条件下进行第二次水热碳化，碳化时间为6h。第三，取500mL的棕色圆底烧瓶中加入300mL纯水，将经过二次碳化的20g生物炭投放其中，在55℃下旋转加热，间隔5min滴加1mL2mol/L的甲酸，经过0.5h后生物炭表面的零电荷点为3，氧化还原电位为-325mv。第四，将所有生物炭置于浓度为20g/L的纳米零价铝溶液中超声30min，超声功率为1200w，考虑到铝在空气中容易被氧化，因此在氮气的保护作用下搅拌24h，静置6h，搅拌速率为150r/min，过滤生物炭并用无氧水冲洗，将冲洗后的生物炭载体在无氧水中离心3min，离心速度为800r/min。将Pseudomonasputida(中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号10368)按1％的接种量的接种并培养15h的菌体培养液装入深10cm、直径为12cm的圆柱形容器中，静置1h，在氮气保护下将所有经过无氧水冲洗pH至7.0生物炭加入到容器中，在液面下方2cm处搅拌30h，搅拌速率为50r/min。
考虑到微生物本身的解毒能力不强，因此固定化微生物菌剂投入谷氨酰半胱氨酸合成酶、谷胱甘肽合成酶、金属硫蛋白和鼠李糖脂的混合溶液中浸泡15min，鼠李糖脂、谷氨酰半胱氨酸合成酶、谷胱甘肽合成酶、金属硫蛋白的浓度分别为5g/L、100μmol/L、120μmol/L、200μmol/L，捞出过滤并用氮气吹干，氮气流量为0.5L/min，温度为25℃。
将四川长宁页岩气井场内部石油烃类污染土壤在60℃下烘干12h，研磨并过10目筛，测定土壤中Cr(Ⅵ)含量为15mg/L，石油污染浓度为10000mg/kg，含水率为34％。将以上制备的具有高还原性和解毒能力的固定化微生物菌剂按照28.85吨/亩的标准投放到长宁页岩气井场内部石油烃类污染土壤中进行为其30d的生物降解，同时取在300℃、5000kPa水热碳化所得到的苦荞壳生物炭在相同条件下附菌，也按照28.85吨/亩的标准投放到长宁页岩气井场内部石油烃类污染土壤中进行为其30d的生物降解。30d的生物修复结果显示，前者治理的土壤中，治理后Cr(Ⅵ)含量为5mg/L，石油类含量去除率为83.6％，在后者治理的土壤中，治理后Cr(Ⅵ)含量为12mg/L，石油类含量去除率为48.1％，处理效果远低于具有高还原性和解毒能力的固定化微生物菌剂。
实施例2
本实施例是针对新疆塔里木油田石油污染土壤开展的抗重金属Cr(Ⅵ)胁迫的土壤固定化石油类污染土壤修复方法的研发。
利用苦荞壳为原料，将苦荞壳用纯水洗净，105℃烘干8h，将干燥后的原料粉碎，过10目筛。取粉碎后的苦荞壳置于1L反应釜中，取质量分数为30％的乙二胺水溶液1000mL加入反应釜中碳化12h，碳化条件为300℃、7000kPa。用体积分数为12％的盐酸清洗碳化侯的生物炭，疏通生物炭内部孔道。将清洗后的生物炭置于另一个装有1000mL的体积分数为60％的抗坏血酸溶液的反应釜中进行第二次水热碳化，碳化条件为250℃，4000kPa，碳化时间为8h。取30g生物炭加入到装有300mL纯水的圆底烧瓶中加入，在60℃下旋转加热，并滴加3mol/L的甲酸，平均滴加速率为1mL/2min，为防治甲酸分解，此处采用锡纸贴在圆底烧瓶上以防透光，经过15min后生物炭表面的零电荷点为2.63，氧化还原电位为-389mv。为继续增强生物炭的还原性，将所有生物炭置于浓度为25g/L的纳米零价铝溶液中超声40min，超声功率为1500w，并在氮气的保护作用下搅拌30h，搅拌速率为120r/min，在氮气保护下捞出生物炭载体放入无氧水中1000r/min离心5min。将Pseudomonasputida(中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号10368)按1％的接种量接种并培养20h的菌体培养液装入深15cm、直径为15cm的圆柱形容器中，静置2h，在氮气保护下将所有经过无氧水冲洗pH至7.0生物炭加入到容器中，在液面下方2cm处搅拌20h，搅拌速率为40r/min。
将固定化微生物菌剂投入谷氨酰半胱氨酸合成酶、谷胱甘肽合成酶、金属硫蛋白和鼠李糖脂的混合溶液中浸泡30min，使金属硫蛋白和鼠李糖脂负载在生物炭的大孔中以及微生物的表层以达到络和重金属Cr(Ⅵ)的目的，同时谷氨酰半胱氨酸合成酶、谷胱甘肽合成酶由于分散在鼠李糖脂中刺激微生物产生谷胱甘肽缓解重金属Cr(Ⅵ)带给微生物的毒害。鼠李糖脂、谷氨酰半胱氨酸合成酶、谷胱甘肽合成酶、金属硫蛋白的浓度分别为5g/L、100μmol/L、120μmol/L、200μmol/L，捞出过滤并用氮气吹干，氮气流量为0.8L/min，温度为30℃。
将新疆塔里木油田石油污染土壤在60℃下烘干12h，研磨并过10目筛，测定土壤中Cr(Ⅵ)含量为30mg/L，石油污染浓度为15000mg/kg，含水率为18％。将以上制备的具有高还原性和解毒能力的固定化微生物菌剂投放到新疆塔里木油田石油污染土壤中进行为其60d的生物降解，考虑到Cr(Ⅵ)、石油类的含量，土壤含水率以及当地天气情况，按照116吨/亩的标准进行投放。60d的生物修复结果显示，治理后土壤中Cr(Ⅵ)含量为17mg/L，石油类含量去除率为88.6％，比从当地购买的固定化微生物菌剂对石油污染物的去除率高了52.4％。
实施例3
本实施例是针对长庆油田石油类污染土壤开展的抗重金属Cr(Ⅵ)胁迫的土壤固定化石油类污染土壤修复方法的研发。
利用苦荞壳为原料，将苦荞壳依次用自来水和纯净水洗净，105℃烘干8h，将干燥后的原料粉碎，过10目筛，取40g粉碎后的苦荞壳置于反应釜中，同时加入质量分数为24％的乙二胺水溶液500mL，在290℃、6000kPa条件下水热碳化10h，过滤得到生物炭，并用体积分数为10％的盐酸清洗生物炭，将清洗后的生物炭置于另一个装有500mL的体积分数为55％的抗坏血酸溶液的反应釜中，在240℃、2500kPa条件下进行第二次水热碳化，碳化时间为6.5h。取500mL的棕色圆底烧瓶中加入300mL纯水，将经过二次碳化的20g生物炭投放其中，在56℃下旋转加热，间隔5min滴加1mL2mol/L的甲酸，经过0.6h后生物炭表面的零电荷点为2.5，氧化还原电位为-312mv。将所有生物炭置于浓度为22g/L的纳米零价铝溶液中超声35min，超声功率为1400w，考虑到铝在空气中容易被氧化，因此在氮气的保护作用下搅拌24h，静置6h，搅拌速率为120r/min，过滤生物炭并用无氧水冲洗，将冲洗后的生物炭载体在无氧水中离心4min，离心速度为900r/min。将Pseudomonasputida(中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号10368)按1％的接种量的接种并培养18h的菌体培养液装入深13cm、直径为18cm的圆柱形容器中，静置1h，在氮气保护下将所有经过无氧水冲洗pH至7.0生物炭加入到容器中，在液面下方3cm处搅拌24h，搅拌速率为45r/min。
考虑到微生物本身的解毒能力不强，因此固定化微生物菌剂投入谷氨酰半胱氨酸合成酶、谷胱甘肽合成酶、金属硫蛋白和鼠李糖脂的混合溶液中浸泡20min，鼠李糖脂、谷氨酰半胱氨酸合成酶、谷胱甘肽合成酶、金属硫蛋白的浓度分别为5g/L、100μmol/L、120μmol/L、200μmol/L，捞出过滤并用氮气吹干，氮气流量为0.4L/min，温度为22℃。
将长庆油田石油类污染土壤在60℃下烘干15h，研磨并过10目筛，测定土壤中Cr(Ⅵ)含量为20mg/L，石油污染浓度为7000mg/kg，含水率为21％。将以上制备的具有高还原性和解毒能力的固定化微生物菌剂按照19吨/亩的标准投放到长庆油田石油类污染土壤中进行为其30d的生物降解，同时取在290℃、7000kPa水热碳化所得到的苦荞壳生物炭在相同条件下附菌，也按照19吨/亩的标准投放到长宁页岩气井场内部石油烃类污染土壤中进行为其30d的生物降解。30d的生物修复结果显示，前者治理的土壤中，治理后Cr(Ⅵ)含量为9mg/L，石油类含量去除率为69.7％，在后者治理的土壤中，治理后Cr(Ⅵ)含量为16mg/L，石油类含量去除率为42.6％，处理效果远低于具有高还原性和解毒能力的固定化微生物菌剂。

Claims (11)

1.一种抗Cr(VI)胁迫的石油类污染土壤固定化生物修复方法，其特征在于，以苦荞壳为生物质材料，制备具有高还原性特点的生物炭，并通过负载还原性物质和微生物活性保护剂，提升微生物在重金属胁迫下的石油类降解活性，包括如下步骤：
(1)利用生物质材料，于20～30％的乙二胺水溶液中进行水热碳化8～12h，而后通过10～12％的盐酸进行清洗孔道去除孔道内的堵塞物质；
(2)在浓度为50～60％的抗坏血酸溶液中水热碳化6～8h，增强生物炭的还原性，降低生物炭零电荷点；
(3)将(2)中制的载体加入去离子水，置于棕色反应器中均匀加热，温度为55～60℃，加入甲酸溶液，进一步增强生物炭的还原性质，并使生物炭表面的零电荷点保持在2～3，氧化还原电位低于-300mv；
(4)将(3)中制备好的生物炭在纳米零价铝溶液中超声30～40min，后在惰性气体的保护作用下，在120～150r/min的条件下搅拌24～30h，静止6～10h，过滤并在惰性气体的保护作用下轻微冲洗；
(5)将(4)中制备好的复合生物炭载体在无氧水中离心，转速为800～1000r/min，离心时间保持在3～5min，去除载体大孔内的纳米材料，得到制备的新型固定化载体；
(6)将(5)中制备的生物炭，经过无氧水冲洗pH至6.5～7后，投入接种后的牛肉膏蛋白胨培养基中静置培养1～2h，后在牛肉膏蛋白胨液体培养基液面下2～3cm处按照40～50r/min的速率搅拌20～30h培养；
(7)将(6)中制备的固定化微生物菌剂投入谷氨酰半胱氨酸合成酶、谷胱甘肽合成酶、金属硫蛋白和鼠李糖脂的混合溶液中浸泡0.2～0.5h后，沥干，通入30～35℃的N2风干，直到生物炭固定化微生物菌剂含水率为35～40％；
(8)将(7)中制备的固定化微生物菌剂，根据不同理化性质、不同污染浓度的土壤，按一定比例投加到土壤中，修复石油类污染土壤，菌剂投加量由公式Q＝A×C石油+0.25×B×C×C Cr(VI)+2.5×D×C水+0.15×E×D土确定，其中Q为固定化菌剂的投加量，C石油为土壤中石油污染物的浓度，C Cr(VI)为土壤中Cr(VI)的浓度，C水为土壤中的含水率，D土为土壤平均粒径，A、B、C、D、E为系数，其中，当土壤中石油类含量为7～13g/kg时，A的取值范围为1～1.3；当土壤中重金属Cr(VI)含量为3～8、9～20、21～28、29～40mg/kg时，B的取值分别取0.8～1.2、3～5、10～12、26～38；当土壤中的重金属Cr(VI)分别以水溶态+交换态、碳酸盐结合态、铁锰氧化物结合态、有机结合态和残留态为最多的存在形态时，C的取值分别为2～3、0.8～1、0.7～1、3～5、0.8～1.2；当土壤的含水率分别为5～15％、16～30％、31～50％时，D的取值分别为1.2～1.5，1.0～1.3，2～3；若土壤粒径为大于0.2mm时，E的取值范围约为0～0.2。
2.根据权利要求1所述的一种抗Cr(VI)胁迫的石油类污染土壤固定化生物修复方法，其特征在于，步骤(1)所述的水热碳化特征是温度为280～300℃，压力为5～7MPa。
3.根据权利要求1所述的一种抗Cr(VI)胁迫的石油类污染土壤固定化生物修复方法，其特征在于，步骤(2)所述的水热碳化特征是温度为200～250℃，压力为2～4MPa。
4.根据权利要求1所述的一种抗Cr(VI)胁迫的石油类污染土壤固定化生物修复方法，其特征在于，步骤(3)所述生物炭的加量和去离子水的加量比值为5％～10％(w∶w)，滴加的亚硫酸浓度为2～3mol/L，滴加方式为间断投加，间断时间为4～5min，甲酸投加量为生物炭质量的4％～7％。
5.根据权利要求1所述的一种抗Cr(VI)胁迫的石油类污染土壤固定化生物修复方法，其特征在于，步骤(5)所述纳米零价铝的浓度为20～25g/L，其中生物炭和纳米材料溶液的加量比值为50％～60％(w：w)，超声波功率密度为1200～1500w/m3，超声频率为40～50kHz，惰性气体为氮气。
6.根据权利要求1所述的一种抗Cr(VI)胁迫的石油类污染土壤固定化生物修复方法，其特征在于，步骤(6)所述的牛肉膏蛋白胨培养基为微生物以1％的接种量接入并在150r/min，30℃条件下震荡培养了15～20h，培养容器深度为10～15cm。
7.根据权利要求1所述的一种抗Cr(VI)胁迫的石油类污染土壤固定化生物修复方法，其特征在于，步骤(7)所述的溶液中为表面活性剂、谷氨酰半胱氨酸合成酶、谷胱甘肽合成酶、金属硫蛋白的浓度分别为5g/L、100μmol/L、120μmol/L、200μmol/L。
8.根据权利要求1所述的一种抗Cr(VI)胁迫的石油类污染土壤固定化生物修复方法，其特征在于，当土壤中石油类含量为14～20g/kg时，A的取值范围为2～3。
9.根据权利要求1所述的一种抗Cr(VI)胁迫的石油类污染土壤固定化生物修复方法，其特征在于，当土壤中石油类含量为20～30g/kg时，A的取值范围为6～8。
10.根据权利要求1所述的一种抗Cr(VI)胁迫的石油类污染土壤固定化生物修复方法，其特征在于，若土壤粒径为0.02～0.2mm时，E的取值范围约为56～100。
11.根据权利要求1所述的一种抗Cr(VI)胁迫的石油类污染土壤固定化生物修复方法，其特征在于，若土壤粒径为0.002～0.02mm时，E的取值范围约为6000～10000。
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