CN108866034A - 一种细菌纤维素固定化漆酶POPs消减材料的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种细菌纤维素固定化漆酶POPs消减材料的制备方法。采用方法的要点是将斜面菌种转接到种子培养基中进行动态培养，然后再次转接静态培养获得细菌纤维素膜薄膜；采用0.1%的NaOH在水浴中处理，然后用去离子水冲洗至中性，冷冻干燥得到细菌纤维素干膜；最后采用吸附‑交联法制备固定化漆酶材料，可用于处理自然水体中的持久性有机污染物。该方法操作简单、安全环保、可控性强。本发明制备的细菌纤维素薄膜能安全高效的固定化漆酶，最大限度地保持酶活性，规避了传统游离态漆酶降解水体中POPs污染物流失严重、难以重复使用等问题，有利于自然水体中POPs的高效、安全降解与消除。

Description

一种细菌纤维素固定化漆酶POPs消减材料的制备方法
技术领域
本发明涉及一种POPs消减材料的制备方法，特别涉及一种细菌纤维素固定化漆酶POPs消减材料的制备方法，属于环境保护工程技术领域。
背景技术
持久性有机污染物(Persistent Organic Pollutants，POPs)是指具有毒性、生物蓄积性和半挥发性，在环境中持久存在，可通过各种环境介质(如大气、水、生物体)长距离迁移，最终影响人体健康和环境安全的天然或人工有机污染物。由于POPs具有环状高分子化合物的化学稳定性，在常规废水处理系统的生化环节很难被厌氧或好氧微生物分解，大多仍残留于工业废水中，最终随外排水流入生态系统，在河道、湖泊等自然水体内不断富集造成环境恶化。因此，鉴于POPs的高毒性、不易降解及其生物累积性和在食物链中无限放大效应，加速研发高效、安全减少与消除自然水体中POPs污染物的新型环境治理材料，减轻生态系统的POPs污染负荷迫在眉睫。
研究发现，漆酶可催化多种酚型和非酚型化合物，特别对于降解氯酚类污染物、多环芳烃、氯仿、苯及其衍生物等POPs污染物效果尤为显著。漆酶作为一种催化底物广、贮存要求低、催化全过程无二次污染的高效氧化酶，有望应用于自然水体中POPs污染物的高效、安全减少与消除。但游离的漆酶会出现：(1)漆酶流失严重，难以从水体中分离并重复使用；(2)受到实际水体复杂环境影响，易变性失活，进而造成漆酶处理成本大幅上升，严重限制了其在水环境治理领域的应用与推广。而酶固定化技术则可以明显改善漆酶在水体催化过程中重复利用率低、易失活等问题。
植物纤维素是地球上含量最丰富的天然高分子化合物，由单一的D-葡萄糖单元通过β-1,4-糖苷键链状连接而成。而细菌纤维素是一种由微生物合成的高纯度胞外生物纤维，其化学结构与植物纤维素相似，但不同于植物纤维素的是细菌纤维素在生物合成过程中逐层形成，由纳米级纤维逐渐形成三维立体网状结构，获得的细菌纤维素具有高比表面积、高结晶度、高持水性和透水性，具有良好的生物相容性和生物可降解性，其表面富含裸露的-OH基团，可作为与酶结合的偶联位点。因此，将考虑BC作为固定化漆酶的载体，通过酶固定化技术解决漆酶在实际催化过程中重复利用率低、易失活等问题，实现漆酶对自然水体中POPs污染物的高效催化降解。
在细菌纤维素固定化生物酶领域，中国专利(201510391158.0)“原位发酵制备细菌纤维素的方法”以原位发酵制备细菌纤维素，通过添加非金属矿无机凝胶至细菌纤维素发酵培养基中，再添加产细菌纤维素菌株，通过发酵分离获得细菌纤维素产品；中国专利(201510280360.6)“一种以细菌纤维素为载体的固定化酶及其制备方法”以细菌纤维素为载体的固定化酶，通过C-N键进行共价结合，并对细菌纤维素的尺寸和形状可控，获得形状与尺寸多样化的固定化酶；中国专利(201810027453.1)“一种细菌纤维素固定化微藻处理废水的方法”将木醋杆菌培养基接入微藻的培养液中，以木醋杆菌产生的纤维素捕集微藻并固定化形成团状或球状用来处理各种废水；美国专利(US 20170191100 A1)“Bacterialcellulose and bacterium producing it”以液体中高度分散的细菌纤维素，当施用于材料时显示优异的成型性能和与其它材料的高混溶性，获得高适用性的实用材料及作为生产细菌纤维素的细菌。截至目前，还未见到利用细菌纤维素作为固定化漆酶支架制备POPs消减材料的相关工艺技术的出现。
基于此，为实现对自然水体(河道、湖泊)中POPs污染物的高效安全减少与消除，开发细菌纤维素固定化漆酶POPs消减材料并促进其产业化，意义尤为重要。本申请制备的POPs消减材料产品将为自然水体(河道、湖泊)中POPs污染物的高效、安全减少与消除提供环境友好的新材料，同时也为自然水体中其他有机有毒、无毒污染物的综合治理提供新的思路和方法。
发明内容
为实现对自然水体(河道、湖泊)中POPs污染物的高效安全减少与消除，开发细菌纤维素固定化漆酶POPs消减材料产品并促进其应用，本发明的目的是提供一种细菌纤维素固定化漆酶POPs消减材料的制备方法。
为实现上述目的，本发明的技术方案是采用以下步骤：
1)将斜面菌种接种到pH 4.8～6.8种子培养基，在26～30℃、140～200r/min条件下进行动态培养12～36h天制得种子液，以体积百分比8～15％接种量将种子液转接至pH4.8～6.8的发酵培养基中，每250mL锥形瓶中含有50～100mL发酵培养液，26～30℃静态培养6～8天，在培养液上层获得细菌纤维素薄膜；
2)将步骤1)获得的细菌纤维素薄膜取出，用去离子水缓慢冲洗多次，去除膜表面的菌体及残留的培养基，用质量分数为0.1mol/L NaOH溶液在60～100℃下水浴中处理30～90min至呈白色半透明状取出，再用去离子水反复洗净至中性并在去离子水中浸泡2～5天，将薄膜取出，吸干表面水分，在液氮中速冻或在低温冰箱里冷冻4h，然后进行冷冻干燥24h，得到白色半透明细菌纤维素干膜；
3)将步骤2)获得的细菌纤维素干膜以细菌纤维素为固定化支架采用吸附-交联法固定化方法固定化漆酶，得到细菌纤维素固定化漆酶POPs消减材料。
所述步骤1)中的菌种选自无色杆菌、产碱杆菌、根瘤菌和八叠球菌中的一种。
所述步骤1)中的种子培养基，以重量百分比，包含：30g/L葡萄糖、6g/L酵母膏、10g/L蛋白胨、1g/L柠檬酸三钠、2g/L硫酸镁。
所述步骤1)中的发酵培养基，以重量百分比，包含：30g/L葡萄糖、12g/L酵母膏、12g/L胰蛋白胨、2g/L柠檬酸钠、2g/L硫酸镁、2.7g/L Na2HPO4、2g/L KH2PO4。
所述步骤3)中的吸附-交联法，包括：5～10mL的0.1～10g/L的1000～10000U/g漆酶中加入0.05～0.5g冷冻干燥后的细菌纤维素并使其浸没，在4～25℃下温育和50～80rpm振荡3～5min，然后静置放在4℃条件下吸附8～24h，并加入5～15mL质量百分比为2.5％的戊二醛溶液，在20～30℃，80～100rpm条件下交联反应1～3h，取出细菌纤维素并用pH 5的醋酸钠缓冲溶液清洗1～3次，吸干表面水分，4℃冰箱保存，得到细菌纤维素固定化漆酶POPs消减材料。
与背景技术相比，本发明具有的有益效果是：
本发明利用细菌纤维素可再生、易降解、纯度高和结构可控等特性，通过结构设计与调控培养，获得适于高效固定漆酶和降解POPs应用的目标结构细菌纤维素支架，并将漆酶固定于细菌纤维素支架，制备可用于高效、安全减少与消除自然水体中POPs污染物的细菌纤维素固定化漆酶POPs消减材料并促进其应用。
附图说明
图1是实施例1制备的细菌纤维素固定化漆酶POPs消减材料产品FESEM照片。其中，(a)是细菌纤维素固定化漆酶POPs消减材料放大1万倍照片，(b)是细菌纤维素固定化漆酶POPs消减材料放大3万倍照片。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好的理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1
1)将无色杆菌接种到pH 4.8的种子培养基(以重量百分比，包含：30g/L葡萄糖、6g/L酵母膏、10g/L蛋白胨、1g/L柠檬酸三钠、2g/L硫酸镁)，在26℃、140r/min条件下进行动态培养36h天制得种子液，以体积百分比15％接种量将种子液转接至pH6.8的发酵培养基(以重量百分比，包含：30g/L葡萄糖、12g/L酵母膏、12g/L胰蛋白胨、2g/L柠檬酸钠、2g/L硫酸镁、2.7g/L Na2HPO4、2g/L KH2PO4)中，每250mL锥形瓶中含有50mL发酵培养液，26℃静态培养8天，在培养液上层获得细菌纤维素薄膜；
2)将步骤1)获得的细菌纤维素薄膜取出，用去离子水缓慢冲洗多次，去除膜表面的菌体及残留的培养基，用质量分数为0.1mol/L NaOH溶液在60℃下水浴中处理90min至呈白色半透明状取出，再用去离子水反复洗净至中性并在去离子水中浸泡2天，将薄膜取出，吸干表面水分，在液氮中速冻或在低温冰箱里冷冻4h，然后进行冷冻干燥24h，得到白色半透明细菌纤维素干膜；
3)将步骤2)获得的0.05g细菌纤维素干膜加入到10mL的0.1g/L的10000U/g漆酶中使其浸没，在4℃下温育和50rpm振荡5min，然后静置放在4℃条件下吸附8h，并加入15mL质量百分比为2.5％的戊二醛溶液，在30℃，80rpm条件下交联反应3h，取出细菌纤维素并用pH5的醋酸钠缓冲溶液清洗1次，吸干表面水分，4℃冰箱保存，得到细菌纤维素固定化漆酶POPs消减材料(a)。
实施例2:
1)将产碱杆菌接种到pH 6.8的种子培养基(以重量百分比，包含：30g/L葡萄糖、6g/L酵母膏、10g/L蛋白胨、1g/L柠檬酸三钠、2g/L硫酸镁)，在30℃、160r/min条件下进行动态培养30h天制得种子液，以体积百分比8％接种量将种子液转接至pH 6的发酵培养基(以重量百分比，包含：30g/L葡萄糖、12g/L酵母膏、12g/L胰蛋白胨、2g/L柠檬酸钠、2g/L硫酸镁、2.7g/L Na2HPO4、2g/L KH2PO4)中，每250mL锥形瓶中含有70mL发酵培养液，30℃静态培养7天，在培养液上层获得细菌纤维素薄膜；
2)将步骤1)获得的细菌纤维素薄膜取出，用去离子水缓慢冲洗多次，去除膜表面的菌体及残留的培养基，用质量分数为0.1mol/L NaOH溶液在100℃下水浴中处理30min至呈白色半透明状取出，再用去离子水反复洗净至中性并在去离子水中浸泡5天，将薄膜取出，吸干表面水分，在液氮中速冻或在低温冰箱里冷冻4h，然后进行冷冻干燥24h，得到白色半透明细菌纤维素干膜；
3)将步骤2)获得的0.1g细菌纤维素干膜加入到5mL的10g/L的5000U/g漆酶中使其浸没，在8℃下温育和70rpm振荡3min，然后静置放在4℃条件下吸附12h，并加入10mL质量百分比为2.5％的戊二醛溶液，在25℃，90rpm条件下交联反应2h，取出细菌纤维素并用pH 5的醋酸钠缓冲溶液清洗3次，吸干表面水分，4℃冰箱保存，得到细菌纤维素固定化漆酶POPs消减材料(b)。
实施例3:
1)将无根瘤菌接种到pH 5的种子培养基(以重量百分比，包含：30g/L葡萄糖、6g/L酵母膏、10g/L蛋白胨、1g/L柠檬酸三钠、2g/L硫酸镁)，在28℃、200r/min条件下进行动态培养20h天制得种子液，以体积百分比10％接种量将种子液转接至pH 4.8的发酵培养基(以重量百分比，包含：30g/L葡萄糖、12g/L酵母膏、12g/L胰蛋白胨、2g/L柠檬酸钠、2g/L硫酸镁、2.7g/L Na2HPO4、2g/L KH2PO4)中，每250mL锥形瓶中含有60mL发酵培养液，27℃静态培养6天，在培养液上层获得细菌纤维素薄膜；
2)将步骤1)获得的细菌纤维素薄膜取出，用去离子水缓慢冲洗多次，去除膜表面的菌体及残留的培养基，用质量分数为0.1mol/L NaOH溶液在85℃下水浴中处理90min至呈白色半透明状取出，再用去离子水反复洗净至中性并在去离子水中浸泡4天，将薄膜取出，吸干表面水分，在液氮中速冻或在低温冰箱里冷冻4h，然后进行冷冻干燥24h，得到白色半透明细菌纤维素干膜；
3)将步骤2)获得的0.3g细菌纤维素干膜加入到7mL的5g/L的7000U/g漆酶中使其浸没，在12℃下温育和60rpm振荡4min，然后静置放在4℃条件下吸附16h，并加入5mL质量百分比为2.5％的戊二醛溶液，在20℃，100rpm条件下交联反应1h，取出细菌纤维素并用pH 5的醋酸钠缓冲溶液清洗2次，吸干表面水分，4℃冰箱保存，得到细菌纤维素固定化漆酶POPs消减材料(c)。
实施例4:
1)将八叠球菌接种到pH 6的种子培养基(以重量百分比，包含：30g/L葡萄糖、6g/L酵母膏、10g/L蛋白胨、1g/L柠檬酸三钠、2g/L硫酸镁)，在27℃、180r/min条件下进行动态培养12h天制得种子液，以体积百分比12％接种量将种子液转接至pH 5的发酵培养基(以重量百分比，包含：30g/L葡萄糖、12g/L酵母膏、12g/L胰蛋白胨、2g/L柠檬酸钠、2g/L硫酸镁、2.7g/L Na2HPO4、2g/L KH2PO4)中，每250mL锥形瓶中含有100mL发酵培养液，28℃静态培养7天，在培养液上层获得细菌纤维素薄膜；
2)将步骤1)获得的细菌纤维素薄膜取出，用去离子水缓慢冲洗多次，去除膜表面的菌体及残留的培养基，用质量分数为0.1mol/L NaOH溶液在75℃下水浴中处理60min至呈白色半透明状取出，再用去离子水反复洗净至中性并在去离子水中浸泡3天，将薄膜取出，吸干表面水分，在液氮中速冻或在低温冰箱里冷冻4h，然后进行冷冻干燥24h，得到白色半透明细菌纤维素干膜；
3)将步骤2)获得的0.5g细菌纤维素干膜加入到8mL的0.4g/L的1000U/g漆酶中使其浸没，在25℃下温育和80rpm振荡5min，然后静置放在4℃条件下吸附24h，并加入10mL质量百分比为2.5％的戊二醛溶液，在30℃，80rpm条件下交联反应3h，取出细菌纤维素并用pH5的醋酸钠缓冲溶液清洗2次，吸干表面水分，4℃冰箱保存，得到细菌纤维素固定化漆酶POPs消减材料(d)。
测定实施例1、实施例2、实施例3、实施例4制备得到的细菌纤维素固定化漆酶POPs消减材料的酶活特性。表1为由实施例1、实施例2、实施例3、实施例4所制备的细菌纤维素固定化漆酶POPs消减材料的表征结果。由表1中数据可知，采用本发明所述的制备方法获得的细菌纤维素固定化漆酶POPs消减材料(a)、细菌纤维素固定化漆酶POPs消减材料(b)、细菌纤维素固定化漆酶POPs消减材料(c)、细菌纤维素固定化漆酶POPs消减材料(d)固定化酶活力在6.20～10.26U/g，蛋白载量在10.8～18.6mg/g，比活力在0.55～0.71U/mg，其固定化酶活力及蛋白载量相对较高，说明该细菌纤维素薄膜能安全高效地固定化漆酶，最大限度保持酶活性，实现了酶的高效催化特性。
如图1，从实施例1制备的细菌纤维素固定化漆酶POPs消减材料产品的场发射扫描电镜照片可看出，其形貌呈现超细微三维网状结构，因其具有较高的比表面积和丰富的表面羟基，能作为漆酶的结合位点，漆酶可高效的结合在其表面。因此，可以考虑将细菌纤维素作为固定化漆酶的载体，通过酶固定化技术解决漆酶在实际催化过程中重复利用率低、易失活等问题，实现漆酶对自然水体中POPs污染物的高效催化降解。
表1
以上列举的仅是本发明的具体实施例。本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种细菌纤维素固定化漆酶POPs消减材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将斜面菌种接种到pH 4.8～6.8种子培养基，在26～30℃、140～200r/min条件下进行动态培养12～36h天制得种子液，以体积百分比8～15％接种量将种子液转接至pH 4.8～6.8的发酵培养基中，每250mL锥形瓶中含有50～100mL发酵培养液，26～30℃静态培养6～8天，在培养液上层获得细菌纤维素薄膜；
2)将步骤1)获得的细菌纤维素薄膜取出，用去离子水缓慢冲洗多次，去除膜表面的菌体及残留的培养基，用质量分数为0.1mol/L NaOH溶液在60～100℃下水浴中处理30～90min至呈白色半透明状取出，再用去离子水反复洗净至中性并在去离子水中浸泡2～5天，将薄膜取出，吸干表面水分，在液氮中速冻或在低温冰箱里冷冻4h，然后进行冷冻干燥24h，得到白色半透明细菌纤维素干膜；
3)将步骤2)获得的细菌纤维素干膜以细菌纤维素为固定化支架采用吸附-交联法固定化方法固定化漆酶，得到细菌纤维素固定化漆酶POPs消减材料。
2.根据权利要求1所述的一种细菌纤维素固定化漆酶POPs消减材料的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中的菌种选自无色杆菌、产碱杆菌、根瘤菌和八叠球菌中的一种。
3.根据权利要求1所述的一种细菌纤维素固定化漆酶POPs消减材料的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中的种子培养基，以重量百分比，包含：30g/L葡萄糖、6g/L酵母膏、10g/L蛋白胨、1g/L柠檬酸三钠、2g/L硫酸镁。
4.根据权利要求1所述的一种细菌纤维素固定化漆酶POPs消减材料的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中的发酵培养基，以重量百分比，包含：30g/L葡萄糖、12g/L酵母膏、12g/L胰蛋白胨、2g/L柠檬酸钠、2g/L硫酸镁、2.7g/L Na2HPO4、2g/L KH2PO4。
5.根据权利要求1所述的一种细菌纤维素固定化漆酶POPs消减材料的制备方法，其特征在于：所述步骤3)中的吸附-交联法，包括：5～10mL的0.1～10g/L的1000～10000U/g漆酶中加入0.05～0.5g冷冻干燥后的细菌纤维素并使其浸没，在4～25℃下温育和50～80rpm振荡3～5min，然后静置放在4℃条件下吸附8～24h，并加入5～15mL质量百分比为2.5％的戊二醛溶液，在20～30℃，80～100rpm条件下交联反应1～3h，取出细菌纤维素并用pH 5的醋酸钠缓冲溶液清洗1～3次，吸干表面水分，4℃冰箱保存，得到细菌纤维素固定化漆酶POPs消减材料。
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