CN114214310A - 一种改性生物炭固定化石油降解菌微球及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种改性生物炭固定化石油降解菌微球的制备方法，该方法包括：取芦苇生物质粉末，进行炭化处理，炭化后置于CO2氛围下进行活化，得到改性生物炭载体；将改性生物炭载体和石油降解菌菌液置于固定化培养基中进行混合吸附，得到吸附菌剂的改性生物炭；以壳聚糖溶液为包埋剂，对吸附菌剂的改性生物炭进行包埋，得到改性生物炭固定化石油降解菌微球。本发明采用CO2活化的方式对芦苇生物炭进行改性，有效增大了固定化载体的比表面积和孔容，采用壳聚糖作为包埋材料，有效提升了石油降解菌对石油的降解效率，并且回收再利用废弃芦苇可以解决人工湿地废弃物处置难题，实现废物的资源化利用。
Description
技术领域
本发明涉及环境修复技术领域，尤其涉及一种改性生物炭固定化石油降解菌微球及其制备方法和应用。
背景技术
近年来，随着社会经济的不断发展，对能源的需求日益紧张，石油开采及其加工行业水涨船高。石油在开采、运输、储存、加工和生产过程中，可经过跑、冒、滴、漏等途径进入环境，进而对水体、土壤以及大气环境造成影响。石油污染特点主要有：(1)大多数污染物在环境中非常稳定；(2)滞留时间长；(3)具有强烈的致畸、致癌和致突变作用；(4)低水溶性和高亲脂性，易通过食物链富集。每年泄漏到水环境中的原油就有成千上万吨，既造成资源的浪费，又严重破坏了人类赖以生存的生态环境。
现有水体石油污染修复方法主要包括物理、化学、微生物修复及这三种方法的集成。物理和化学修复技术存在着一定的局限性，如处理效率低、二次污染以及难以回收和彻底处理等瓶颈。与传统的物理化学技术相比，微生物技术因其经济、高效且环保的优势在降解石油烃污染物上展现出巨大的潜力。然而值得注意的是，游离微生物进入实际污染环境中后，其生存繁殖和降解能力易受外界因素干扰，降解作用难以充分发挥。固定化技术可将微生物固定在独立微环境中，有效克服了传统生物处理技术的不足，降低了外界因素对微生物的影响以提高对石油烃的降解能力。载体是影响固定化石油降解菌剂去除石油的一个关键因素，目前研发使用的固定化载体大多使用寿命较短，载体的再生利用较难，使用时需要频繁地更换，给运行管理造成不便。因此，在修复石油污染时，固定化微生物技术亟需一种低廉高效、制备简单、传质阻力小、生物相容性好的载体材料。
生物炭作为一种新兴功能材料被广泛应用于固定化微生物降解石油烃的研究中，而直接炭化得到的生物炭存在比表面积较低，孔容较小等问题。为了使生物炭的功能更加稳定、处理效率更高，研究人员选择对生物炭进行活化，常见活化手段有物理活化和化学活化，物理活化相对于化学活化，具有简单、清洁等优点。CO2活化是常见的物理活化法之一，可有效提高生物炭的比表面积和孔容。改性生物炭具有较大的比表面积和孔容，这些特性有利于微生物的黏附和增殖,可为微生物提供丰富的附着位点，改性生物炭丰富的孔隙结构同时也为微生物提供稳定的环境，保持微生物的细胞活性，有利于污染物的微生物降解。
壳聚糖是一种来源广泛、成本低廉的绿色高分子材料，因其具有良好的生物相容性、可降解性且安全无毒副作用，常备用作包埋材料，在环保、化工、生物等领域备受关注。人工湿地技术是一种成本低廉且环境友好的水体修复技术，在其运行过程中会产出大量的湿地植物残体，若每年产出的废弃植物残体不能得到妥善处理，不仅造成资源的浪费，还会造成二次污染等环境问题。将湿地植物残体经炭化制备成生物炭材料作为吸附剂、载体材料等用于环境修复，不仅可以有效解决废弃湿地植物处理难题，还可以达到以废治废的目的。
发明内容
基于现有技术存在的局限性和不足，本发明提供了一种改性生物炭固定化石油降解菌微球的制备方法，该方法获得了有较大比表面积和孔容的改性生物炭载体，并且最终获得石油降解效率高的改性生物炭固定化石油降解菌微球，实现了固定化菌剂的靶向制备和水体中石油污染物的高效去除。
具体技术方案如下：
一种改性生物炭固定化石油降解菌微球的制备方法，包括以下步骤：
(1)取芦苇生物质粉末，进行炭化处理，炭化后置于CO2氛围下进行活化，得到改性生物炭载体；
炭化时，以5～10℃/min升温速率，升温至500～600℃，保温1.5～2h；
活化时，CO2进气速率控制在550～650mL/min，以15～20℃/min的升温速率升温至800～850℃，保温1.5～2h；
(2)将步骤(1)的改性生物炭载体和活化后的石油降解菌菌液置于固定化培养基中进行混合吸附，待充分吸附后，离心洗涤，得到吸附菌剂的改性生物炭；
(3)以壳聚糖溶液为包埋剂，对步骤(2)吸附菌剂的改性生物炭进行包埋，得到改性生物炭固定化石油降解菌微球。
进一步地，步骤(1)中，芦苇生物质粉末的制备方法为：将采集的芦苇洗净自然风干，剪成5～10cm碎段，于60℃条件下烘干，用粉碎机磨成粉末过筛备用。
芦苇生物质粉末的粒径是衡量炭化程度及效果的重要因素，生物质粉末粒径过大，易导致炭化不完全。
步骤(1)中，芦苇生物质粉末过40目筛后进行炭化。上述炭化处理需全程通入氮气保护，氮气进气速率控制在180～220mL/min；炭化后的材料冷却研磨后备用。
进一步地，改性生物炭载体进行固定化前，需研磨过200目筛。固定化技术的关键之一在于固定化载体的选择。能够满足并优化目标菌群的生活环境，可以高效、快速实现目的的载体被视为理想载体。改性生物炭具有较大的比表面积和孔容，这些特性有利于微生物的黏附和增殖,可为微生物提供丰富的附着位点。
进一步地，步骤(2)中，所述石油降解菌为石油降解菌(Falsochrobactrum sp.)TDYN1T，保藏编号为CGMCC No.18061，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。该菌株已经在申请号为CN201910997997.5，公开号为CN110724650A，专利名称为“一种高效石油降解菌TDYN1T及其应用”的中国专利申请公开。
活化石油降解菌的活化培养基为LB培养基，配方为：蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g，加蒸馏水定容至1L，调节pH 7.0～7.4，121℃灭菌20min。取4℃条件下在斜面保存培养基上保存的菌体放入装有100mL LB培养基的锥形瓶中，作为优选，置于37℃，180rpm的恒温摇床中震荡活化，活化至菌液OD600＝1。
进一步地，步骤(2)中，所述改性生物炭载体与OD600＝1的石油降解菌菌液按1:2～1:3的质量体积比进行混合，混合吸附的温度为28～32℃，时间为20～24h，并且在170～190rpm的恒温摇床中震荡培养。
进一步地，步骤(2)中，所述改性生物炭载体与固定化培养基按1:90～110的质量体积比进行混合；固定化培养基为牛肉膏蛋白胨培养基，配方为：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，加蒸馏水定容至1L，调节pH 7.0～7.4，121℃灭菌20min。
步骤(2)中，充分固定化后进行离心，离心后下层沉淀用生理盐水清洗2～3次。进一步地，步骤(2)中，离心的转速为4000r/min，时间为20min，下层沉淀用生理盐水清洗2～3次，4000r/min离心10min。下层即为所得吸附固定化菌剂。
包埋剂的选择对改性生物炭固定化石油降解菌微球的制备和降解石油效果有很大影响，试验发现，采用壳聚糖作为包埋剂制得的微球效果最佳。壳聚糖是甲壳素脱乙酰化的产物，具有良好的生物相容性和生物可降解性，是固定微生物的理想材料。
进一步地，步骤(2)中，所述改性生物炭的的比表面积为310.0～545.0m2/g，孔容为0.200～0.35cc/g，孔径为24.5～26.6nm。这种特性使改性生物炭增强了对石油的吸附截留作用，同时也为微生物提供大量的附着点位，孔容的增大使微生物活动空间大大增加，在一定范围内孔径的增加会提升载体的传质性能，有利于微生物的生长、降解。
进一步地，步骤(3)中，所述包埋剂为壳聚糖乙酸溶液，溶液中壳聚糖的浓度为30～50g/L，乙酸的体积分数为1％；所述NaOH水溶液的浓度为8～12g/L；所述吸附菌剂的改性生物炭与包埋剂的质量体积比为1:10～1:30；所述包埋的时间为4～8h。包埋后，用无菌水冲洗2次，再用生理盐水冲洗2～3次。
上述涉及微生物的试验过程若无特殊说明，均在无菌环境下进行。
本发明还提供了如上所述的制备方法制得的改性生物炭固定化石油降解菌微球。
改性生物炭固定化石油降解菌微球相较于单菌液和吸附固定化菌剂，具有降解效果好，便于回收，避免二次污染等优点。
本发明还提供了如上述的改性生物炭固定化石油降解菌微球在修复石油污染水体中的应用。
具体的，所述应用，包括：将制备好的改性生物炭固定化石油降解菌微球置于含0.1g原油的100mL无机盐培养基中，在30℃，180rpm条件下恒温震荡7d。测定降解效率。本发明所制微球对水中石油的降解效率可达72.2％～83.7％。所用无机盐培养基配方为：KH2PO41g、K2HPO4 0.5g、NaCl 10g、(NH4)2SO4 1.5g、无水CaCl2 0.1g、FeSO4·7H2O 0.01g、MgSO40.2g、加蒸馏水至1L，调节pH 7.0～7.4，121℃灭菌20min。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明采用CO2活化的方式对来源于芦苇的生物炭进行改性，有效增大了固定化载体的比表面积和孔容，采用壳聚糖作为包埋材料，对菌剂进行包埋，有效提升了石油降解菌对石油的降解效率，并且回收再利用废弃芦苇可以解决人工湿地废弃物处置难题，实现废物的资源化利用。
(2)本发明以湿地植物废弃物芦苇为原料制备CO2改性生物炭，改性后生物炭的比表面积和孔容都明显增大，增强了对石油的吸附截留作用，同时也为微生物提供大量的附着点位，孔容的增大使微生物活动空间大大增加，在一定范围内孔径的增大会提升载体的传质性能，有利于微生物的生长、降解。
(3)以本发明制出的改性生物炭为载体，采用壳聚糖为包埋剂，对微生物进行包埋固定制备出的微球可以广泛应用于受石油等污染水体的净化中。本发明不仅提供了一种绿色、高效、无二次污染的水体中石油污染修复技术，而且能够将废弃芦苇进行回收利用，实现了湿地植物废弃物的资源化利用；本发明以高效廉价、环境友好、简单易行为核心，为石油修复技术提供了可靠理论和实践依据。
(4)本发明采用改性生物炭作为固定化载体应用于修复石油污染；通过对生物炭改性来增强其对微生物的固定能力，同时利用生物炭本身的吸附能力，以达到吸附与降解石油烃的双重目的，以期实现固定化菌剂的靶向制备和水体中石油污染物的高效去除，具有良好的推广应用前景。
(5)本发明采用典型湿地植物—芦苇作为基础原料制备固定化生物炭载体，来源广泛且成本低廉，其制备所得生物炭中羟基、羧基等活性基团丰富，比表面积较大，利于微生物的固定化。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。
实施例1
一、改性生物炭的制备
(1)干燥粉碎：将采集的芦苇洗净自然风干，剪成5～10cm碎段，于60℃条件下烘干，用粉碎机磨成粉末过40目筛备用。
(2)炭化冷却：取一定量的芦苇生物质粉末于镍坩埚中，置于管式炉中进行炭化；在炭化过程中需全程通入氮气保护，氮气进气速率控制在200mL/min，以10℃/min的升温速率升温至500℃，保温2h，冷却研磨备用。该步骤所得芦苇生物炭产率为32％，记为PB500。
(3)改性活化：采用物理活化法对芦苇生物炭进行活化改性，活化剂采用CO2。取一定量生物炭PB500于镍坩埚中，置于管式炉中进行活化。活化时CO2进气速率需控制在600mL/min，以15℃/min的升温速率升温至800℃，保温1.5h，冷却研磨过200目筛，放在干燥皿中备用。该步骤所得改性生物炭产率为24％，记为CPB5-8。
本实施例生产的改性生物炭如表1所示，比表面积为541.793m2/g，孔容为0.3378cc/g，孔径为24.9410nm。
二、改性生物炭固定化石油降解菌微球制备
(1)菌液活化：选取低温保存的一种高效石油降解菌TDYN1T进行活化处理，挑取斜管固体保存培养基中的菌体于活化培养基中，在37℃，180rpm恒温摇床中活化，至菌液OD600＝1。
(2)吸附固定：取1.0g改性生物炭CPB5-8加入含100mL固定化培养基的锥形瓶中进行灭菌处理，按照3％接种量接入活化后的目标菌液，将锥形瓶置于30℃，180rpm的恒温摇床中震荡培养，固定24h，使得菌株充分附着在固定化载体上。充分固定后用4000r/min的离心机离心20min，去掉上清液，下层沉淀用生理盐水清洗后再次离心，离心机转速为4000r/min，离心10min。重复清洗2～3次，即得到改性生物炭吸附固定化石油降解菌菌剂。
(3)包埋固定：取20mL 40g/L的壳聚糖乙酸溶液，与基于1g改性生物炭制得的吸附固定化石油降解菌菌剂充分混合，将混合液用注射器缓慢挤入10g/L的NaOH溶液中，将得到的微球于NaOH溶液中静置8h后，用无菌水冲洗，再用生理盐水冲洗2～3次，制得改性生物炭固定化石油降解菌微球。
三、改性生物炭固定化石油降解菌微球降解水体中石油污染试验
(1)降解试验：取基于1.0g改性生物炭固定化石油降解菌的微球加入到含0.1g石油的100mL无机盐培养基中，在30℃，180rpm条件下恒温震荡7d，设置3组重复，测定降解效率。
(2)降解率测定：降解后的培养液用20mL石油醚萃取重复两次，微球用纱布包裹捞出，合并两次提取液于50mL容量瓶中，用石油醚定容，吸取1mL于另一容量瓶中，定容至50mL待测。
经试验测定，如表2所示，本实施例生产的微球对水中石油烃的降解率达83.7％。
实施例2
一、改性生物炭的制备
(1)干燥粉碎：将采集的芦苇洗净自然风干，剪成5～10cm碎段，于60℃条件下烘干，用粉碎机磨成粉末过40目筛备用。
(2)炭化冷却：取一定量的芦苇生物质粉末于镍坩埚中，置于管式炉中进行炭化。在炭化过程中需全程通入氮气保护，氮气进气速率控制在200mL/min，以10℃/min的升温速率升温至600℃，保温2h，冷却研磨备用。该步骤所得芦苇生物炭产率为29％，记为PB600。
(3)改性活化：采用物理活化法对芦苇生物炭进行活化改性，活化剂采用CO2。取一定量生物炭PB600于镍坩埚中，置于管式炉中进行活化。活化时CO2进气速率需控制在600mL/min，以20℃/min的升温速率升温至850℃，保温1.5h，冷却研磨过200目筛，放在干燥皿中备用。该步骤所得改性生物炭产率为24％，记为CPB6-8。
本实施例生产的改性生物炭如表1所示，比表面积为432.77m2/g，孔容为0.2800cc/g，孔径为25.8818nm。
二、改性生物炭固定化石油降解菌微球制备
(1)菌液活化：选取低温保存的一种高效石油降解菌TDYN1T进行活化处理，挑取斜管固体保存培养基中的菌体于活化培养基中，在37℃，180rpm恒温摇床中活化，至菌液OD600＝1。
(2)吸附固定：取1.0g改性生物炭CPB6-8加入含100mL固定化培养基的锥形瓶中进行灭菌处理，按照3％接种量接入活化后的目标菌液，将锥形瓶置于30℃，180rpm的恒温摇床中震荡培养，固定24h，使得菌株充分附着在固定化载体上。充分固定后用4000r/min的离心机离心20min，去掉上清液，下层沉淀用生理盐水清洗后再次离心，离心机转速为4000r/min，离心10min。重复清洗2～3次，即得到改性生物炭吸附固定化石油降解菌菌剂。
(3)包埋固定：取20mL 50g/L的壳聚糖乙酸溶液，与基于1g改性生物炭制得的吸附固定化石油降解菌菌剂充分混合，将混合液用注射器缓慢挤入10g/L的NaOH溶液中，将得到的微球于NaOH溶液中静置6h后，用无菌水冲洗，再用生理盐水冲洗2～3次，制得改性生物炭固定化石油降解菌微球。
三、改性生物炭固定化石油降解菌微球降解水体中石油污染试验
(1)降解试验：取基于1.0g改性生物炭固定化石油降解菌的微球加入到含0.1g石油的100mL无机盐培养基中，在30℃，180rpm条件下恒温震荡7d，设置3组重复，测定降解效率。
(2)降解率测定：降解后的培养液用20mL石油醚萃取重复两次，微球用纱布包裹捞出，合并两次提取液于50mL容量瓶中，用石油醚定容，吸取1mL于另一容量瓶中，定容至50mL待测。
经试验测定，如表2所示，本实施例生产的微球对水中石油烃的降解率达72.2％。
对比例1
一、改性生物炭制备
(1)干燥粉碎：将采集的芦苇洗净自然风干，剪成5～10cm碎段，于60℃条件下烘干，用粉碎机磨成粉末过40目筛备用。
(2)炭化冷却：取一定量的芦苇生物质粉末于镍坩埚中，置于管式炉中进行炭化。在炭化过程中需全程通入氮气保护，氮气进气速率控制在200mL/min，以10℃/min的升温速率升温至500℃，保温2h，冷却研磨备用。该步骤所得芦苇生物炭产率为32％，记为PB500。
(3)改性活化：采用物理活化法对芦苇生物炭进行活化改性，活化剂采用CO2。取一定量生物炭PB500于镍坩埚中，置于管式炉中进行活化。活化时CO2进气速率需控制在600mL/min，以20℃/min的升温速率升温至900℃，保温1.5h，冷却研磨过200目筛，放在干燥皿中备用。该步骤所得改性生物炭产率为23％，记为CPB5-9。
本实施例生产的改性生物炭如表1所示，比表面积为412.07m2/g，孔容为0.2733cc/g，孔径为26.5340nm。
二、改性生物炭固定化石油降解菌微球制备
(1)菌液活化：选取低温保存的一种高效石油降解菌TDYN1T进行活化处理，挑取斜管固体保存培养基中的菌体于活化培养基中，在37℃，180rpm恒温摇床中活化，至菌液OD600＝1。
(2)吸附固定：取1.0g改性生物炭CPB5-9加入含100mL固定化培养基的锥形瓶中进行灭菌处理，按照3％接种量接入活化后的目标菌液，将锥形瓶置于30℃，180rpm的恒温摇床中震荡培养，固定24h，使得菌株充分附着在固定化载体上。充分固定后用4000r/min的离心机离心20min，去掉上清液，下层沉淀用生理盐水清洗后再次离心，离心机转速为4000r/min，离心10min。重复清洗2～3次，即得到改性生物炭吸附固定化石油降解菌菌剂。
(3)包埋固定：取10mL 40g/L的壳聚糖乙酸溶液，与基于1g改性生物炭制得的吸附固定化石油降解菌菌剂充分混合，将混合液用注射器缓慢挤入10g/L的NaOH溶液中，将得到的微球于NaOH溶液中静置6h后，用无菌水冲洗，再用生理盐水冲洗2～3次，制得改性生物炭固定化石油降解菌微球。
三、改性生物炭固定化石油降解菌微球降解水体中石油污染试验
(1)降解试验：取基于1.0g改性生物炭固定化石油降解菌的微球加入到含0.1g石油的100mL无机盐培养基中，在30℃，180rpm条件下恒温震荡7d，设置3组重复，测定降解效率。
(2)降解率测定：降解后的培养液用20mL石油醚萃取重复两次，微球用纱布包裹捞出，合并两次提取液于50mL容量瓶中，用石油醚定容，吸取1mL于另一容量瓶中，定容至50mL待测。
经试验测定，如表2所示，本实施例生产的微球对水中石油烃的降解率达51.4％。
对比例2
一、改性生物炭制备
(1)干燥粉碎：将采集的芦苇洗净自然风干，剪成5～10cm碎段，于60℃条件下烘干，用粉碎机磨成粉末过40目筛备用。
(2)炭化冷却：取一定量的芦苇生物质粉末于镍坩埚中，置于管式炉中进行炭化。在炭化过程中需全程通入氮气保护，氮气进气速率控制在200mL/min，以5℃/min的升温速率升温至400℃，保温1.5h，冷却研磨备用。该步骤所得芦苇生物炭产率为36％，记为PB400。
(3)改性活化：采用物理活化法对芦苇生物炭进行活化改性，活化剂采用CO2。取一定量生物炭PB400于镍坩埚中，置于管式炉中进行活化。活化时CO2进气速率需控制在600mL/min，以15℃/min的升温速率升温至750℃，保温2h，冷却研磨过200目筛，放在干燥皿中备用。该步骤所得改性生物炭产率为28％，记为CPB4-7。
本实施例生产的改性生物炭如表1所示，比表面积为316.35m2/g，孔容为0.2040cc/g，孔径为25.8002nm。
二、改性生物炭固定化石油降解菌微球制备
(1)菌液活化：选取低温保存的一种高效石油降解菌TDYN1T进行活化处理，挑取斜管固体保存培养基中的菌体于活化培养基中，在37℃，180rpm恒温摇床中活化，至菌液OD600＝1。
(2)吸附固定：取1.0g改性生物炭CPB4-7加入含100mL固定化培养基的锥形瓶中进行灭菌处理，按照2％接种量接入活化后的目标菌液，将锥形瓶置于30℃，180rpm的恒温摇床中震荡培养，固定20h，使得菌株充分附着在固定化载体上。充分固定后用4000r/min的离心机离心20min，去掉上清液，下层沉淀用生理盐水清洗后再次离心，离心机转速为4000r/min，离心10min。重复清洗2～3次，即得到改性生物炭吸附固定化石油降解菌菌剂。
(3)包埋固定：取30mL 30g/L的壳聚糖乙酸溶液，与基于1g改性生物炭制得的吸附固定化石油降解菌菌剂充分混合，将混合液用注射器缓慢挤入10g/L的NaOH溶液中，将得到的微球于NaOH溶液中静置4h后，用无菌水冲洗，再用生理盐水冲洗2～3次，制得改性生物炭固定化石油降解菌微球。
三、改性生物炭固定化石油降解菌微球降解水体中石油污染试验
(1)降解试验：取基于1.0g改性生物炭固定化石油降解菌的微球加入到含0.1g石油的100mL无机盐培养基中，在30℃，180rpm条件下恒温震荡7d，设置3组重复，测定降解效率。
(2)降解率测定：降解后的培养液用20mL石油醚萃取重复两次，微球用纱布包裹捞出，合并两次提取液于50mL容量瓶中，用石油醚定容，吸取1mL于另一容量瓶中，定容至50mL待测。
经试验测定，如表2所示，本实施例生产的微球对水中石油烃的降解率达42.9％。
对比例3
本对比例采用KOH改性制备生物炭载体，制备改性生物炭固定化微球，并应用于水体石油污染降解。具体步骤如下：
(一)改性生物炭制备
一种KOH改性生物炭制备步骤如下：
(1)干燥粉碎：将采集的芦苇洗净自然风干，剪成5～10cm碎段，于60℃条件下烘干，用粉碎机磨成粉末过40目筛备用。
(2)改性炭化：将一定量芦苇生物质粉末与6mol/L的KOH溶液混合，芦苇生物质与KOH质量比为1:3，搅拌2h后置于90～105℃烘干，得到芦苇改性粉末，取一定量改性粉末于镍坩埚中，置于管式炉中，在炭化过程中需全程通入氮气保护，氮气进气速率控制在200mL/min，以10℃/min的升温速率升温至700℃，保温2h，冷却后用1mol/L的过量盐酸溶液浸泡，后用去离子水冲洗至中性，烘干研磨备用，记为KPB7。
本实施例生产的生物炭如表1所示，比表面积为1218.39m2/g，孔容为0.7884cc/g，孔径为25.8824nm。
(二)改性生物炭固定化石油降解菌微球制备
(1)菌液活化：选取低温保存的一种高效石油降解菌TDYN1T进行活化处理，挑取斜管固体保存培养基中的菌体于活化培养基中，在37℃，180rpm恒温摇床中活化，至菌液OD600＝1。
(2)吸附固定：取1.0g生物炭KPB7加入含100mL固定化培养基的锥形瓶中进行灭菌处理，按照3％接种量接入活化后的目标菌液，将锥形瓶置于30℃，180rpm的恒温摇床中震荡培养，固定24h，使得菌株充分附着在固定化载体上。充分固定后用4000r/min的离心机离心20min，去掉上清液，下层沉淀用生理盐水清洗后再次离心，离心机转速为4000r/min，离心10min。重复清洗2～3次，即得到改性生物炭吸附固定化石油降解菌菌剂。
(3)包埋固定：取20mL 40g/L的壳聚糖乙酸溶液，与基于1g改性生物炭制得的吸附固定化石油降解菌菌剂充分混合，将混合液用注射器缓慢挤入10g/L的NaOH溶液中，将得到的微球于NaOH溶液中静置8h后，用无菌水冲洗，再用生理盐水冲洗2～3次，制得改性生物炭固定化石油降解菌微球。
(三)改性生物炭固定化石油降解菌微球降解水体中石油污染试验
(1)降解试验：取基于1.0g改性生物炭固定化石油降解菌的微球加入到含0.1g石油的100mL无机盐培养基中，在30℃，180rpm条件下恒温震荡7d，设置3组重复，测定降解效率。
(2)降解率测定：降解后的培养液用20mL石油醚萃取重复两次，微球用纱布包裹捞出，合并两次提取液于50mL容量瓶中，用石油醚定容，吸取1mL于另一容量瓶中，定容至50mL待测。
经试验测定，如表2所示，本对比例生产的微球对水中石油烃的降解率达56.4％。
对比例4
本对比例与实施例1对比，将包埋材料替换为海藻酸钠，其余过程基本相同，并应用于水体石油污染降解。
(一)改性生物炭固定化石油降解菌微球制备
(1)菌液活化：取1.0g改性生物炭CPB5-8加入含100mL固定化培养基的锥形瓶中进行灭菌处理，按照3％接种量接入活化后的目标菌液，将锥形瓶置于30℃，180rpm的恒温摇床中震荡培养，固定24h，使得菌株充分附着在固定化载体上。充分固定后用4000r/min的离心机离心20min，去掉上清液，下层沉淀用生理盐水清洗后再次离心，离心机转速为4000r/min，离心10min。重复清洗2～3次，即得到改性生物炭吸附固定化石油降解菌菌剂。
(2)包埋固定：取20mL 30g/L的海藻酸钠溶液，与基于1g改性生物炭制得的吸附固定化石油降解菌菌剂充分混合，将混合液用注射器缓慢挤入30g/L的CaCl2溶液中，将得到的微球于NaOH溶液中静置6h后，用无菌水冲洗，再用生理盐水冲洗2～3次，制得改性生物炭固定化石油降解菌微球。
(二)改性生物炭固定化石油降解菌微球降解水体中石油污染试验
(1)降解试验：取基于1.0g改性生物炭固定化石油降解菌的微球加入到含0.1g石油的100mL无机盐培养基中，在30℃，180rpm条件下恒温震荡7d，设置3组重复，测定降解效率。
(2)降解率测定：降解后的培养液用20mL石油醚萃取重复两次，微球用纱布包裹捞出，合并两次提取液于50mL容量瓶中，用石油醚定容，吸取1mL于另一容量瓶中，定容至50mL待测。
经试验测定，如表2所示，本对比例生产的微球对水中石油烃的降解率达62.5％。
对比例5
本对比例与实施例2相较，仅制备改性生物炭材料和吸附固定化菌剂，不进行微球的制备，并将吸附固定化菌剂应用于水体石油污染降解。
(一)改性生物炭吸附固定化石油降解菌菌剂制备
菌液活化：取1.0g改性生物炭CPB6-8加入含100mL固定化培养基的锥形瓶中进行灭菌处理，按照3％接种量接入活化后的目标菌液，将锥形瓶置于30℃，180rpm的恒温摇床中震荡培养，固定24h，使得菌株充分附着在固定化载体上。充分固定后用4000r/min的离心机离心20min，去掉上清液，下层沉淀用生理盐水清洗后再次离心，离心机转速为4000r/min，离心10min。重复清洗2～3次，即得到改性生物炭吸附固定化石油降解菌菌剂。
(二)改性生物炭吸附固定化石油降解菌菌剂降解水体中石油污染试验
(1)降解试验：取基于1.0g改性生物炭吸附固定化石油降解菌菌剂加入到含0.1g石油的100mL无机盐培养基中，在30℃，180rpm条件下恒温震荡7d，设置3组重复，测定降解效率。
(2)降解率测定：降解后的培养液用20mL石油醚萃取重复两次，菌剂用纱布包裹捞出，合并两次提取液于50mL容量瓶中，用石油醚定容，吸取1mL于另一容量瓶中，定容至50mL待测。
经试验测定，如表2所示，本对比例生产的菌剂对水中石油烃的降解率达49.1％。
对比例6
本对比例采用KOH改性制备生物炭载体，制备改性生物炭吸附固定化菌剂，并应用于水体石油污染降解。具体步骤如下：
(一)改性生物炭吸附固定化石油降解菌菌剂制备
菌液活化：取1.0g改性生物炭KPB7加入含100mL固定化培养基的锥形瓶中进行灭菌处理，按照3％接种量接入活化后的目标菌液，将锥形瓶置于30℃，180rpm的恒温摇床中震荡培养，固定24h，使得菌株充分附着在固定化载体上。充分固定后用4000r/min的离心机离心20min，去掉上清液，下层沉淀用生理盐水清洗后再次离心，离心机转速为4000r/min，离心10min。重复清洗2～3次，即得到改性生物炭吸附固定化石油降解菌菌剂。
(二)改性生物炭吸附固定化石油降解菌菌剂降解水体中石油污染试验
(1)降解试验：取基于1.0g改性生物炭吸附固定化石油降解菌菌剂加入到含0.1g石油的100mL无机盐培养基中，在30℃，180rpm条件下恒温震荡7d，设置3组重复，测定降解效率。
(2)降解率测定：降解后的培养液用20mL石油醚萃取重复两次，菌剂用纱布包裹捞出，合并两次提取液于50mL容量瓶中，用石油醚定容，吸取1mL于另一容量瓶中，定容至50mL待测。
经试验测定，如表2所示，本对比例生产的菌剂对水中石油烃的降解率达40.9％。
表1不同炭化条件下制得生物炭的理化性质及表观结构比较
表2不同菌剂对水体中石油烃的降解效率对比
Claims (9)
1.一种改性生物炭固定化石油降解菌微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取芦苇生物质粉末，进行炭化处理，炭化后置于CO2氛围下进行活化，得到改性生物炭载体；
炭化时，以5～10℃/min升温速率，升温至500～600℃，保温1.5～2h；
活化时，CO2进气速率控制在550～650mL/min，以15～20℃/min的升温速率升温至800～850℃，保温1.5～2h；
(2)将步骤(1)的改性生物炭载体和活化后的石油降解菌菌液置于固定化培养基中进行混合吸附，待充分吸附后，离心洗涤，得到吸附菌剂的改性生物炭；
(3)以壳聚糖溶液为包埋剂，对步骤(2)吸附菌剂的改性生物炭进行包埋，得到改性生物炭固定化石油降解菌微球。
2.如权利要求1所述改性生物炭固定化石油降解菌微球的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，芦苇生物质粉末过40目筛后进行炭化。
3.如权利要求1所述改性生物炭固定化石油降解菌微球的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述石油降解菌为石油降解菌(Falsochrobactrum sp.)TDYN1T，保藏编号为CGMCCNo.18061。
4.如权利要求1所述改性生物炭固定化石油降解菌微球的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述改性生物炭载体与OD600＝1的石油降解菌菌液按1:2～1:3的质量体积比进行混合，混合吸附的温度为28～32℃，时间为20～24h，并且在170～190rpm的恒温摇床中震荡培养。
5.如权利要求4所述改性生物炭固定化石油降解菌微球的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述改性生物炭载体与固定化培养基按1:90～110的质量体积比进行混合。
6.如权利要求1所述改性生物炭固定化石油降解菌微球的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述改性生物炭的比表面积为310.0～545.0m2/g，孔容为0.20～0.35cc/g，孔径为24.5～26.6nm。
7.如权利要求1所述改性生物炭固定化石油降解菌微球的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述包埋剂为壳聚糖乙酸溶液，溶液中壳聚糖的浓度为30～50g/L，乙酸的体积分数为1％；所述NaOH水溶液的浓度为8～12g/L；所述吸附菌剂的改性生物炭与包埋剂的质量体积比为1:10～1:30；所述包埋的时间为4～8h。
8.如权利要求1～7任一项所述的制备方法制得的改性生物炭固定化石油降解菌微球。
9.如权利要求8所述的改性生物炭固定化石油降解菌微球在修复石油污染水体中的应用。
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