CN109679871A - 一种pam-sa固定化微生物降解含油废水的方法 - Google Patents

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Abstract

一种PAM‑SA固定化微生物降解含油废水的方法，首先进行高效降解含油废水的微生物菌剂的制备：该菌剂从长期受石油污染的土壤中筛选，以原油为唯一碳源，通过筛选富集分离法，最终分离筛选出具有高效石油降解能力的四株菌SEQ1‑BS、SEQ2‑AFS、SEQ3‑PSS和SEQ4‑AS；将四株微生物菌株先进行复活，再扩大培养，发酵生产，备用；固定化微生物：以聚丙烯酰胺—海藻酸钠为载体，建立包埋固定化微生物，用生理盐水洗净，备用；每周检测石油烃降解率、原油各组分及微生物数量，同时通过电镜观察固定化微生物小球的结构，直至含油废水的石油烃含量达标。

Description

一种PAM-SA固定化微生物降解含油废水的方法
技术领域
本发明涉及含油废水的生物降解技术。
背景技术
石油是我国主要的矿产资源，对推动经济的前进和发展尤为重要。但与此同时，在石油开采、运输、储存和使用的过程中，时常由于安全措施不当以及突发事故等原因造成泄露，产生了大量含油废水而引发环境污染，所以治理含油废水刻不容缓。
在含油废水的处理方法中，微生物法因成本低、无二次污染等具有良好前景，然而在传统的处理工艺中，微生物通常以悬浮态生长，系统内降解菌的有效浓度低、菌体易流失、抗污染能力差等特点。有研究表明微生物法处理废水成功的关键在于菌种投放后其活性的保持时间。针对上述问题，近年来研究人员采用固定化微生物技术以提高微生物菌种的处理能力和对环境的适应性。固定化微生物技术是一种用物理或化学方法将游离微生物限制或定位在某一特定的空间范围内，保持微生物密度和活性的现代工程技术。固定化微生物的传统方法主要为吸附法、交联法、共价结合法和包埋法四大类。它们各自有着明显的优势，可也存在着较大的局限性。包埋固定法由于操作简单且对生物活性不会产生显著影响，在水污染处理领域被应用最多。其中聚乙烯醇(PVA)、聚丙烯酰胺(PAM)以及海藻酸钠(SA)、壳聚糖等天然高分子多糖类是固定化微生物技术中常用的材料，作为大自然中广泛分布的有机大分子材料的海藻酸钠（SA）具有传质性能好、无生物毒性、来源广泛价格低廉等优点，但其机械强度低在厌氧条件下容易被微生物分解，而聚丙烯酰胺(PAM)耐生物腐蚀性、机械强度大、可塑性强等优势可与海藻酸钠（SA）进行互补，本发明所采用包埋法固定化降油微生物,包埋材料选择了聚丙烯酰胺(PAM)和海藻酸钠(SA)两种。对于原油族组分的研究目前最普遍的方法是色谱-质谱法（GC-MS）指纹特征分析。本发明以石油族组分中正构烷烃为例进行“指纹图谱”分析和生物演化参数分析，选择使用聚丙烯酰胺（PAM） 以及海藻酸钠(SA) 作为固定化微生物细胞的固定化包埋载体，利用包埋法固定石油烃高效降解菌，提高其降解性能，以便用于实际污染水体的修复。
发明内容
本发明的目的是提供一种PAM-SA固定化微生物降解含油废水的方法。
本发明是一种PAM-SA固定化微生物降解含油废水的方法 ，其步骤为：
（1）首先进行高效降解含油废水的微生物菌剂的制备：该菌剂从长期受石油污染的土壤中筛选，以原油为唯一碳源，通过筛选富集分离法，最终分离筛选出具有高效石油降解能力的四株菌SEQ1-BS、SEQ2-AFS、SEQ3-PSS和SEQ4-AS；
（2）将四株微生物菌株先进行复活，再扩大培养，发酵生产，备用；分离得到的4株优势菌种分别为BS、AFS、PSS和AS；其中SEQ1-BS属于芽孢杆菌属，Bacillusencimensis strain encimensis、SEQ2-AFS 属于粪产碱杆菌，Alcaligenes faecalis strain，SEQ3-PSS属于西图则氏假单胞菌，Pseudomonas stutzeri strain，SEQ4-AS属于不动杆菌属，Acinetobacter sp，将4株菌在无菌条件下分别接种至营养肉汤培养基中，在37℃恒温培养箱中培养1天，然后按体积比1：1：1：1的比例制成一份混合菌悬液，放入37℃、150 r/ min的摇床中培养2～3 d，经平板稀释法检查菌落数≥107个/ml，即可取出放置于4℃冰箱内备用。
（3）固定化微生物：
以聚丙烯酰胺—海藻酸钠为载体，建立包埋固定化微生物的步骤如下：
a．将聚丙烯酰胺—海藻酸钠加热溶于水；
b．将该溶液与SEQ1、SEQ2、SEQ3、SEQ4微生物菌株制作的菌悬液混合均匀，使其菌落数≥108个/ml；
c．将聚丙烯酰胺—海藻酸钠与菌体混合液用针形管滴入5%-10%的CaCl2溶液中，固定7-8h；
d．滤出颗粒，用生理盐水洗净，备用；
（4）每周检测石油烃降解率、原油各组分及微生物数量，同时通过电镜观察固定化微生物小球的结构，直至含油废水的石油烃含量达标。
本发明的有益之处是：从节约能源与使用廉价材料的角度出发，采用了聚丙烯酰胺（PAM）—海藻酸钠（SA）混合包埋法固定化微生物，研究固定微生物小球对含油废水中石油的降解效果。以筛选降解石油组化合物为主的微生物菌群为出发点，获得四株高效降解石油组成分的混合菌群，以GC-MS法测定出残油的原油族组分含量，计算出混合菌剂对作用7d和14d后的正构烷烃的平均降解率，分析其降解难易程度。
附图说明
图1是核苷酸或氨基酸序列SEQ1的BS菌属系统进化树，图2是核苷酸或氨基酸序列SEQ2的AFS菌属系统进化树，图3是核苷酸或氨基酸序列SEQ3的PSS菌系统进化树，图4是核苷酸或氨基酸序列SEQ4的AS系统进化树，图5是固定化微生物小球，图6、图7分别为降解一周（左）、两周（右）的小球在500倍扫描电镜下的表面图，图8、图9分别为降解一周（左）、两周（右）后小球在1000倍扫描电镜下的表面图，图10、图11分别为降解一周（左）、两周（右）的小球在2000倍扫描电镜下的断面, 图12是空白组原油饱和烃GC-MS总离子流图，图13是2.7d实验组ⅠGC-MS总离子流图，图14是14d实验组ⅠGC-MS总离子流图，图15是7d实验组ⅡGC-MS总离子流图，图16是14d实验组Ⅱ GC-MS总离子流图。
具体实施方式
本发明提供了一种微生物菌剂由聚丙烯酰胺（PAM）—海藻酸钠（SA）混合联用降解含油废水的方法，属于能源生物技术和环境生物技术领域，具体涉及了一种微生物固定化技术。采用固定化微生物降解,包埋材料选择了聚丙烯酰胺(PAM)和海藻酸钠(SA)两种，以及SEQ1菌株（芽孢杆菌属（Bacillus encimensis strain encimensis））、SEQ2菌株（粪产碱杆菌（Alcaligenes faecalis strain））、SEQ3（西图则氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeristrain））、SEQ4（不动杆菌属（Acinetobacter sp）），这4种微生物菌株制作的固体菌剂可有效应用于含油废水的降解。
本发明是一种PAM-SA固定化微生物降解含油废水的方法 ，其步骤为：
（1）首先进行高效降解含油废水的微生物菌剂的制备：该菌剂从长期受石油污染的土壤中筛选，以原油为唯一碳源，通过筛选富集分离法，最终分离筛选出具有高效石油降解能力的四株菌SEQ1-BS、SEQ2-AFS、SEQ3-PSS和SEQ4-AS；
（2）将四株微生物菌株先进行复活，再扩大培养，发酵生产，备用；分离得到的4株优势菌种分别为BS、AFS、PSS和AS；其中SEQ1-BS属于芽孢杆菌属，Bacillusencimensis strain encimensis、SEQ2-AFS 属于粪产碱杆菌，Alcaligenes faecalis strain，SEQ3-PSS属于西图则氏假单胞菌，Pseudomonas stutzeri strain，SEQ4-AS属于不动杆菌属，Acinetobacter sp，将4株菌在无菌条件下分别接种至营养肉汤培养基中，在37℃恒温培养箱中培养1天，然后按体积比1：1：1：1的比例制成一份混合菌悬液，放入37℃、150 r/ min的摇床中培养2～3 d ,经平板稀释法检查菌落数≥107个/ml，即可取出放置于4℃冰箱内备用。
（3）固定化微生物：
以聚丙烯酰胺-PAM—海藻酸钠-SA为载体，建立包埋固定化微生物的步骤如下：
a．将聚丙烯酰胺—海藻酸钠加热溶于水；
b．将该溶液与SEQ1、SEQ2、SEQ3、SEQ4微生物菌株制作的菌悬液混合均匀，使其菌落数≥108个/ml；
c．将聚丙烯酰胺—海藻酸钠与菌体混合液用针形管滴入5%-10%的CaCl2溶液中，固定7-8h；
d．滤出颗粒，用生理盐水洗净，备用；
（4）每周检测石油烃降解率、原油各组分及微生物数量，同时通过电镜观察固定化微生物小球的结构，目的是为了清楚地观察到固定化小球的内部结构变化，直至含油废水的石油烃含量达标。
实施例1-菌株的分离与鉴定：
将石油芳烃污染土壤悬液以15%的接种量接种于以标准油(6g/L)为唯一碳源的营养液中，28℃好氧条件下150 r/ min摇床培养3～4d，相同条件下转接1次。稀释、涂于以石油烃为唯一碳源的固体培养基中,28℃恒温培养4～5 d形成单菌落。挑取生长迅速、边缘整齐的菌落接入营养液中，摇瓶复筛，得到目的菌株。
分子生物学水平鉴定结果如核苷酸或氨基酸序列表所示。
16s rDNA系统发育树分析，图1所示为核苷酸或氨基酸序列SEQ1的BS菌属系统进化树。
用分子进化遗传学分析与序列比对软件MEGA5.2的邻近相接法(Neighbor一JoiningMethod)对clustalx多重比对结果进行系统进化分析，采用Boot strap方法500个重复进行可靠性检验。通过研究所得的16SrDNA序列在GenBank数据库中的位置。
BS菌株与芽孢杆菌相像，且16S rDNA序列及同源性与芽孢杆菌（Bacillus encimensis strain encimensis）的16SrDNA序列有100.0%的同源性，并且在系统进化树上表明它和芽孢杆菌（Bacillusencimensis strain encimensis）具有较进的遗传距离。因此根据以上结果，将BS菌株归属于芽孢杆菌（Bacilluencimensis strain encimensis）菌属，将其初步命名为Bacillusencimensis strain encimensis。
图2所示为核苷酸或氨基酸序列SEQ2的AFS菌属系统进化树，AFS菌株与粪产碱杆菌相像，16S rDNA序列及同源性与粪产碱杆菌（Alcaligenes faecalis strain）的16SrDNA序列有100.0%的同源性，并且在系统进化树上表明它和粪产碱杆菌（Alcaligenes faecalis strain）具有较进的遗传距离。因此根据以上结果，将AFS菌株归属于粪产碱杆菌（Alcaligenes faecalis strain）菌属，将其初步命名为Alcaligenes faecalis strain。
图3 所示为核苷酸或氨基酸序列SEQ3的PSS菌系统进化树，PSS菌株与西图则氏假单胞菌相像，且16S rDNA序列及同源性与西图则氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri strain ）的16SrDNA序列有100.0%的同源性，并且在系统进化树上表明它和西图则氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri strain ）具有较进的遗传距离。因此根据以上结果，将PSS菌株归属于西图则氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri strain ）菌属，将其初步命名为Pseudomonas stutzeri strain 。
图4所示为核苷酸或氨基酸序列SEQ4的AS系统进化树，AS菌株的16S rDNA序列与Penicillium oxalicum的16S rDNA序列具有99%同源性。属于霉菌属，命名为Penicillium oxalicum。
实施例2-微生物混合菌剂的制备：
1、微生物菌株接种活化
在无菌条件下，将BS、AFS、PSS和AS这四株菌分别接种到装有营养肉汤的三角瓶中（灭菌后），将以上三角瓶放入30℃、200r/min的摇床中培养48h，待用。
2、液体混合菌剂的发酵制备：
（1）由上述培养了48h的芽孢杆菌属（Bacillus encimensis strain encimensis）、粪产碱杆菌（Alcaligenes faecalis strain）、西图则氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri strain）、不动杆菌属（Acinetobacter sp），按照5%的接入量分别接入细菌发酵罐中进行发酵培养24h后，得到细菌种子液。
（2）混合菌剂的制备：
将以上发酵的细菌种子液按体积比为1:1:1:1配成菌悬液，即BS、AFS、PSS和AS四株所占菌悬液体积百分比各为25%，按最优体积比制成液体微生物菌剂。放置4℃冰箱保存，待用。
（3）固定化微生物小球的制备：
称取0.3gPAM、0.5gSA置于50ml小烧杯中，加入17.5ml无菌水充分搅拌，盖上保鲜膜放置12小时，使其完全融合呈凝胶状。在无菌室中将其加热至流动态，称取0.4g玉米秸秆同10ml菌液一同加入其中（注意加热温度不能超过40℃，以免过热使部分菌失活），充分搅拌均匀后吸20ml到医用注射器中,滴入配制好的饱和氯化钙溶液中，利用交联作用制成胶状体菌液，用滴管吸取胶状体菌液，滴加到洁净的表面皿中，使其成球状，放置3-6小时,洗净，置于4℃冰箱中保存备用。菌剂浓度大约在20%左右，制备好的小球见图5所示。
（4）固定化微生物小球的结构电镜分析图：
利用SEM观察合成的微球，对降解一周和两周后的小球结构经过扫描电镜观察，如图6~图11所示：图6、图7分别为降解一周（左）、两周（右）的小球在500倍扫描电镜下的表面图，图8、图9分别为降解一周（左）、两周（右）后小球在1000倍扫描电镜下的表面图，图10、图11分别为降解一周（左）、两周（右）的小球在2000倍扫描电镜下的断面, 由图6、图8、图10可以清楚地观察到固定化小球的内部是相互交联的网状结构，并且空隙致密，大小较为均匀，直径大约在6 μm左右，具有良好的连通性。由于小球上面附着了大量的菌落，可以观察到其表面凹凸不平，也显示出实验制得的包埋材料吸附性能良好。
同时，对比观察图7、图9、图11可得，当降解至第14天时，小球的骨架结构发生破裂，空隙变大且不均匀，孔壁也变得脆弱，小球表面开始出现的塌陷现象。这是由于随着降解时间的加长，制得的PAM-SA杂化凝胶逐渐水解；加之该包埋材料具有良好的生物降解性，可以被微生物分解，进而使固定化小球的浓度减小、交联度降低、稳定性变差，以致其内部结构被破坏表面出现塌陷现象。
实施例3-PAM-SA固定化微生物降解含油废水：
1、聚丙烯酰胺（PAM）—海藻酸钠（SA）固定化微生物降解含油废水技术：
本实施例中，利用实施例3所制备的发酵菌剂对含油废水进行修复处理，按废水体积比添加5.0%的固定化微生物菌剂用于修复1-3%浓度的含油废水。
具体操作如下：
（1）将四株微生物菌株进行复活，扩大培养，发酵生产，备用；
（2）以聚丙烯酰胺（PAM）—海藻酸钠（SA）混合联用作为包埋法固定化微生物用PSM（Polyacrylamide-Sodium Alga Acid-Microorganism）表示。然后使用所制备出的固体菌剂与含油废水均匀混合，测试制备出的材料的降油效果并进行讨论。
表1 实验设计方案：
用0.4g、1.2g标准油分别加入40ml无菌水，配制成1%和3%的含油废水，空白组不加入PSM小球，实验组分别加入10g（5%菌液浓度）的PSM小球。将以上设计好的实验容器放入恒温振荡器，设置转速为150 r/ min，调节温度35，培养15d。
（3）降解动力学研究：
表2降解部分时间残油量（g）
废水中的残油量经分析得出一级降解动力学方程为P油=P0exp（-kt），两边取自然对数得出以下方程：
实验组：lnP油=-0.2021t+lnP0 油
实验组：lnP油=-0.2258t+lnP0 油
在废水受油污染程度相同的条件下，以聚丙烯酰胺（PAM）—海藻酸钠（SA）混合联用作为包埋法固定化微生物的实验组的降解半衰期为3.43天，实验组的降解半衰期为3.07天，实验组的最大降解率达到69.13%，实验组的最大降解率达到74.80%。
（5）正构烷烃生物演化参数分析：
从微生物降解原油的不同浓度、不同时段的GC-MC检测图谱（图12-16）中，可以计算出原油最重要的组分——各种正构烷烃烷烃的含量和对应的以下生物演化参数值。其中，主峰碳和∑C21-／∑C22+两个参数反映了烷烃遭受细菌作用时高碳数烷烃向低碳数烷烃转化的趋势。主峰碳前移越多则表明细菌降解高碳数烷烃的能力越强。∑C21-／∑C22+是低碳数烷烃总和与高碳数烷烃总和的比值，该参数越大则表明细菌降解高碳数烷烃的能力越强。OEP值反映了细菌降解奇偶数碳烷烃的能力，该值越小降解奇数碳烷烃的能力越强，反之该值越大降解偶数碳烷烃的能力越强。姥植比〔w(pr)/w(ph)〕是利用类异戊二烯烃中常见的姥鲛烷与植烷的比值，该值越大表明微生物对较难降解的类异戊二烯烃的氧化作用越明显。
表3正构烷烃生物演化参数值：
从表3正构烷烃演化参数中可以看出，7d-1%-PAM主峰碳为nC25，7d-3%-PAM主峰碳前移为nC15，14d-1%-PAM主峰碳为nC29，14d-3%-PAM主峰碳前移为nC20，主峰碳均明显前移表明细菌降解高碳数烷烃的能力越强。7d-1%-PAM的正构烷烃分布呈∑C21-=∑C22+特征（∑21-／∑22+=1.000），7d-3%-PAM的正构烷烃分布却表现为∑C21-＞∑C22+特征（∑21-／∑22+=1.729），表明：7d-3%-PAM的降解程度明显大于7d-1%-PAM；同上分析14d-1%和3%的∑21-／∑22+ 的值，发现14d-3%-PAM的降解程度明显大于14d-1%-PAM。 0EP值分别为1.060、1.075、1.033、1.075，总体来说实验组Ⅱ的值小于实验组Ⅰ，显示后者的成熟度高于前者（或者后者的降解程度高于前者）。姥鲛烷/植烷的值均为正值，说明样品遭受较为强烈的细菌降解作用，且实验组Ⅱ的值均大于实验组Ⅰ，表明微生物对实验组Ⅱ较难降解的类异戊二烯烃的氧化作用更加明显。
通过以上生物演化参数分析，可以较好地解释3%含油废水（实验组Ⅱ）在PAM-SA固定化微生物作用下的降解率高于1%含油废水（实验组Ⅰ），说明该方法对含量适中的含油废水具有绿色、环保、降解周期短、降解率较高的优势和特点。
以下是四株微生物菌株的核苷酸或氨基酸序列表：
SEQ1-BS属于芽孢杆菌属，Bacillusencimensis strain encimensis：
ACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGACTTGACGGAAGC
TTGCTTCCGTTCAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACC
TGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAT
TCTTTTTCTTCGCATGAAGAAGAATGGAAAGGCGGCTTTTAGCTGTCGCT
TACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACC
AAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGAC
TGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGC
AATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTC
GGATCGTAAAGCTCTGTTGTCAGGGAAGAACAAGTACGGAAGTAACTGTC
CGTACCTTGACGGTACCTGACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGC
AGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTA
AAGCGCGCGCAGGCGGCTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAA
CCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGGCTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGC
GGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAG
TGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGT
GGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGA
GTGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATT
AAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATT
GACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACG
CGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCCGCTGACCGGTCTGGAGACAGG
CCTTTCCCTTCGGGGACAGCGGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGC
TCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGAT
CTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAA
ACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTG
GGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAAAGGGCTGCAAGACCGCAAG
GTTTAGCCAATCCCATAAAACCATTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAAC
TCGCCTGCATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCG
GTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGT
TTGCAACACCCGAAGTCGGTGGGGTAACCCTTACGGGAGCCAGCCGCCTA
AGGTGGG。
SEQ 2 -AFS 属于粪产碱杆菌，Alcaligenes faecalis strain：
ACGCTAGCGGGATGCTTTACACATGCAAGTCGAACGGCAGCACGAGAGAG
CTTGCTCTCTTGGTGGCGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATATATCGGAACG
TGCCCAGTAGCGGGGGATAACTACTCGAAAGAGTGGCTAATACCGCATAC
GCCCTACGGGGGAAAGGGGGGGATTCTTCGGAACCTCTCACTATTGGAGC
GGCCGATATCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCTCACCAAGGCAAC
GATCCGTAGCTGGTTTGAGAGGACGACCAGCCACACTGGGACTGAGACAC
GGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGGACAATGGGGG
AAACCCTGATCCAGCCATCCCGCGTGTATGATGAAGGCCTTCGGGTTGTA
AAGTACTTTTGGCAGAGAAGAAAAGGTATCTCCTAATACGAGATACTGCT
GACGGTATCTGCAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGG
TAATACGTAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGT
GTAGGCGGTTCGGAAAGAAAGATGTGAAATCCCAGGGCTCAACCTTGGAA
CTGCATTTTTAACTGCCGAGCTAGAGTATGTCAGAGGGGGGTAGAATTCC
ACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGATATGTGGAGGAATACCGATGGCGAAG
GCAGCCCCCTGGGATAATACTGACGCTCAGACACGAAAGCGTGGGGAGCA
AACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTAGC
TGTTGGGGCCGTTAGGCCTTAGTAGCGCAGCTAACGCGTGAAGTTGACCG
CCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACC
CGCACAAGCGGTGGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCT
TACCTACCCTTGACATGTCTGGAATGCCGAAGAGATTTGGCAGTGCTCGC
AAGAGAACCGGAACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTG
AGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCATTAGTTGCT
ACGCAAGAGCACTCTAATGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGG
GGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGGGTAGGGCTTCACACGTCAT
ACAATGGTCGGGACAGAGGGTCGCCAACCCGCGAGGGGGAGCCAATCTCA
GAAACCCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGT
CGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGAATGTCGCGGTGAATACGTTCCCG
GGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTTCACCAGAAG
TAGGTAGCCTAACCGTAAGGAGGGCGCTTACCACGGTGGGATTCATGACT
GGG。
SEQ 3 -PSS属于西图则氏假单胞菌，Pseudomonas stutzeri strain：
ACGCTGTGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGATGAGTGGAGCT
TGCTCCATGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCT
GGTAGTGGGGGACAACGTTTCGAAAGGAACGCTAATACCGCATACGTCCT
ACGGGAGAAAGTGGGGGATCTTCGGACCTCACGCTATCAGATGAGCCTAG
GTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGGCGACGATCCGT
AACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAG
ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCT
GATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACT
TTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTAAGTTAATACCTTGCTGTTTTGACGTTA
CCAACAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACG
AAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTG
GTTCGTTAAGTTGGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATC
CAAAACTGGCGAGCTAGAGTATGGCAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTA
GCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCA
CCTGGGCTAATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGA
TTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTAGCCGTTGGG
ATCCTTGAGATCTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTCGACCGCCTGGG
GAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACA
AGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAG
GCCTTGACATGCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAAC
TCTGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTG
GGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTT
AAGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGG
GATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCTGGGCTACACACGTGCTA
CAATGGTCGGTACAAAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCCCAT
AAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTC
GGAATCGCTAGTAATCGTGAATCAGAATGTCACGGTGAATACGTTCCCGG
GCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCTCCAGAAGT
AGCTAGTCTAACCTTCGGGGGGACGGTTACCACGGAGTGATTCATGACTG
GG。
SEQ 4-AS属于不动杆菌属，Acinetobacter sp：
ACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGATGAACCACTTCGGTGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATACTGACCCGCTTGGGCATCCAAGCGGTTCGAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCGAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCGCGTCGGTTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCAGTCGATACGGGCAGGCTAGAGTTCGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCGATACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGCACTAGGTGTGGGCGACATTCCACGTCGTCCGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATACACCGGAAACGTCTGGAGACAGGCGCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCCGTGTTGCCAGCAAGCCCTTCGGGGTGTTGGGGACTCACGGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGATACCGCGAGGTGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGGAGGGAGCTGTCGAAGGTGGGACTGG。

Claims (1)

1.一种PAM-SA固定化微生物降解含油废水的方法 ，其特征在于，其步骤为：
（1）首先进行高效降解含油废水的微生物菌剂的制备：该菌剂从长期受石油污染的土壤中筛选，以原油为唯一碳源，通过筛选富集分离法，最终分离筛选出具有高效石油降解能力的四株菌SEQ1-BS、SEQ2-AFS、SEQ3-PSS和SEQ4-AS；
（2）将四株微生物菌株先进行复活，再扩大培养，发酵生产，备用；分离得到的4株优势菌种分别为BS、AFS、PSS和AS；其中SEQ1-BS属于芽孢杆菌属，Bacillusencimensis strain encimensis、SEQ2-AFS 属于粪产碱杆菌，Alcaligenes faecalis strain，SEQ3-PSS属于西图则氏假单胞菌，Pseudomonas stutzeri strain，SEQ4-AS属于不动杆菌属，Acinetobacter sp，将4株菌在无菌条件下分别接种至营养肉汤培养基中，在37℃恒温培养箱中培养1天，然后按体积比1：1：1：1的比例制成一份混合菌悬液，放入37℃、150 r/ min的摇床中培养2～3 d，经平板稀释法检查菌落数≥107个/ml，即可取出放置于4℃冰箱内备用；
（3）固定化微生物：
以聚丙烯酰胺—海藻酸钠为载体，建立包埋固定化微生物的步骤如下：
a．将聚丙烯酰胺—海藻酸钠加热溶于水；
b．将该溶液与SEQ1、SEQ2、SEQ3、SEQ4微生物菌株制作的菌悬液混合均匀，使其菌落数≥108个/ml；
c．将聚丙烯酰胺—海藻酸钠与菌体混合液用针形管滴入5%-10%的CaCl2溶液中，固定7-8h；
d．滤出颗粒，用生理盐水洗净，备用；
（4）每周检测石油烃降解率、原油各组分及微生物数量，同时通过电镜观察固定化微生物小球的结构，直至含油废水的石油烃含量达标。
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