CN113604407A

CN113604407A - 一种复合微生物除藻菌剂及其制备方法和应用

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Publication number: CN113604407A
Application number: CN202111035670.3A
Authority: CN
Inventors: 崔倩倩; 费晓昕; 骆守鹏; 朱红生
Original assignee: Huatian Engineering and Technology Corp MCC
Current assignee: Huatian Engineering and Technology Corp MCC
Priority date: 2021-09-03
Filing date: 2021-09-03
Publication date: 2021-11-05
Anticipated expiration: 2041-09-03
Also published as: CN113604407B

Abstract

本发明公开了一种复合微生物除藻菌剂及其制备方法和应用，涉及微生物工程技术领域，为解决单一微生物除藻时间长，而多组分的生物制剂成分复杂、制备过程繁琐、成本较高的问题；本发明包括Z‑1溶藻菌和XN‑1絮凝菌，制备方法包括分别活化Z‑1溶藻菌和XN‑1絮凝菌；分别将活化后的Z‑1溶藻菌和XN‑1絮凝菌扩大培养获得种子液；取Z‑1溶藻菌和XN‑1絮凝菌的种子液共同发酵培养得到菌剂，本发明可用于处理藻类污染水体，36h后溶藻率可达91.2％；本发明XN‑1絮凝菌与Z‑1溶藻菌产生了较好地协同作用，使除藻速率更快，效率更高，且本发明的物料使用少，仅需少量菌种自行简单培养，成本较低，能够更好地适应市场需求，容易推广应用。

Description

一种复合微生物除藻菌剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及微生物工程技术领域，具体为一种复合微生物除藻菌剂及其制备方法和应用。

背景技术

随着工业进步和科技发展，各种生活污水和城市废水排入江河湖海，导致水体富营养化，藻类大量繁殖，水华和赤潮爆发。藻类的主要危害表现为：藻类大面积覆盖水面，引起水质腐败，致使鱼类等窒息；许多蓝-绿藻可产生藻毒素会造成神经系统的损伤，引起人或者动物惊厥、呼吸困难甚至呼吸衰竭，还有可能导致腹泻、呕吐以及对肝肾等器官的损害；影响水体透明度、溶解氧等环境指标，导致水质恶化，严重影响了水体功能，甚至对饮用水的安全性产生了威胁。影响水资源的合理利用，使之成为全球严重的环境灾害之一。

目前常用的除藻方法主要有物理法、化学法与生物法三种，物理方法不能从根本上解决问题并且成本较高。化学除藻法见效快，但是化学药剂容易产生二次污染，对生态系统造成不利影响。微生物控藻技术是一种新兴生态修复技术，具有高效、对环境安全、无污染等优势，应用前景广阔。

20世纪70年代，人们研究发现富营养化水体中藻类叶绿素的含量和溶藻菌的数量之间存在较好相关性。筛选和应用溶藻菌已成为生物控藻领域一个较为活跃的研究方向。目前，已分离的具有溶藻效应的细菌主要有弧菌、假单胞菌、交替单胞菌、芽孢杆菌和球菌等，其主要作用对象包括蓝藻、甲藻和硅藻等淡水或海洋藻类。但是单一微生物除藻时间长，而多组分的生物制剂成分复杂、制备过程繁琐、成本较高；例如公告号为CN105309479B，名称为一种溶藻生物制剂及应用的发明专利，其中公开了一种由枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、粪链球菌、光合细菌、鞘氨醇单胞菌、维生素C、维生素E、乳糖组成的复合生物制剂，其组分复杂繁多、成本较高，且除藻时间仍较长，在实际应用推广中有一定的难度。因此，亟需一种复合微生物除藻菌剂及其制备方法和应用来解决这个问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种复合微生物除藻菌剂及其制备方法和应用，以解决单一微生物除藻时间长，而多组分的生物制剂成分复杂、制备过程繁琐、成本较高的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种复合微生物除藻菌剂，包括Z-1溶藻菌和XN-1絮凝菌；

上述的Z-1溶藻菌的分类命名为耐热芽孢杆菌，拉丁文学名为Bacillussporothermodurans，保藏名称为Z-1溶藻菌，保藏单位全称为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为中国北京，保藏编号为20070，保藏日期为2020年6月11日；

上述的XN-1絮凝菌的分类命名为拉乌尔菌，拉丁文学名为Raoultella sp，保藏名称为XN-1絮凝菌，保藏单位全称为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为中国北京，保藏编号为21338，保藏日期为2020年12月9日。

优选的，上述菌剂还包括Z-1溶藻菌和XN-1絮凝菌二者的代谢产物。

优选的，上述菌剂为液态。

本发明提供的另一技术方案：一种复合微生物除藻菌剂的制备方法，包括以下具体步骤：

S1、分别活化Z-1溶藻菌和XN-1絮凝菌；

S2、分别将活化后的Z-1溶藻菌和XN-1絮凝菌扩大培养获得种子液；

S3、取Z-1溶藻菌和XN-1絮凝菌的种子液共同发酵培养得到菌剂。

在一种较优的方案中，发酵培养基的制备步骤包括：将城镇污水厂的尾水引入发酵培养装置中，按质量比0.2‰加入氯化铵，并开启搅拌和曝气，时间为8小时，待水中余氯消解完全后，停止搅拌，再分别按质量比加入0.5‰葡萄糖、0.5‰氯化铵和0.3‰碳酸氢钠，并调节pH为7-8。

在上述任一方案中较优的，发酵培养的步骤包括：按体积比Z-1溶藻菌种子液：XN-1絮凝菌种子液：发酵培养基＝10:5:100接种，发酵条件为曝气量1L/min，转速100rpm，温度30℃，3天后结束发酵。

在一种较优的方案中，扩大培养的步骤包括：分别将活化后的Z-1溶藻菌和XN-1絮凝菌接种到装有500mL肉汤培养基的1L的锥形瓶中，在30-35℃，100-300rpm/min条件下摇床培养12-24h。

在一种较优的方案中，活化采用LB平板。

本发明提供的还一技术方案：一种复合微生物除藻菌剂在藻类污染水体中的应用。

在一种较优的方案中，在铜绿微囊藻浓度为1×10⁶cell/ml，温度30℃，光照强度为2000lux，光暗周期为12h:12h，pH为7.5的条件下，按照体积比菌剂：污染水体＝1:10的比例，向污染水体中加入菌剂，36h后溶藻率为91.2％。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

该复合微生物除藻菌剂发挥作用极快，溶藻率仅36h就可以达到90％以上，相对于单独采用Z-1溶藻菌，本发明的复合微生物除藻菌剂效果更好，XN-1絮凝菌与Z-1溶藻菌产生了较好地协同作用，使除藻速率更快，效率更高，且本发明的物料使用少，仅需少量菌种自行简单培养，此外本发明还可以增加城镇污水厂的尾水的再利用途径，用其作为发酵培养用水，成本较低，能够更好地适应市场需求，容易推广应用。

附图说明

图1为本发明的Z-1溶藻菌和XN-1絮凝菌按不同比例共培养生长曲线；

图2为本发明的Z-1溶藻菌和XN-1絮凝菌按不同比例发酵培养的溶藻率；

图3为本发明的发酵培养基在不同碳氮比条件下菌剂的溶藻率。

生物材料保藏信息：

耐热芽孢杆菌(Bacillus sporothermodurans)，保藏名称为Z-1溶藻菌，保藏单位全称为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为中国北京，保藏编号为20070，保藏日期为2020年6月11日；

拉乌尔菌(Raoultella sp)，保藏名称为XN-1絮凝菌，保藏单位全称为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为中国北京，保藏编号为21338，保藏日期为2020年12月9日。

具体实施方式

实施例1：

一种复合微生物除藻菌剂的制备方法，包括以下具体步骤：分别活化Z-1溶藻菌和XN-1絮凝菌，可采用LB平板划线活化；分别将活化后的Z-1溶藻菌和XN-1絮凝菌扩大培养获得种子液，具体的，分别将活化后的Z-1溶藻菌和XN-1絮凝菌接种到装有500mL肉汤培养基的1L的锥形瓶中，在30-35℃，100-300rpm/min条件下摇床培养12-24h，较优的，宜在30℃，180rpm/min条件下摇床培养24h；取Z-1溶藻菌和XN-1絮凝菌的种子液共同发酵培养得到菌剂。

实施例2：

将上述实施例1中的Z-1溶藻菌和XN-1絮凝菌的种子液按照1:1，2:1，3:1比例共同发酵培养得到三种菌剂，测试菌种的生长情况和溶藻性能，在不同的接种比例中，两种菌株生长情况见图1，两种菌株生长情况无显著差别，可以在同一条件下共同培养；同时不同接种比例获得的发酵液对铜绿微囊藻进行处理，测试溶藻效果，结果见图2，其中测试采用铜绿微囊藻液，在藻浓度为1×10⁶cell/ml时，各组不同接种比例按相同的菌剂藻液体积比，在温度20-35℃，光照强度为1800-2200lux，优选为1800lux、1900lux、2000lux、2100lux、2200lux；光暗周期为10-15h∶10-15h，优选为10-12h∶10-12h，pH在6-9条件下处理，通过测定藻类叶绿素来计算溶藻率；

铜绿微囊藻的叶绿素a的测定：在藻-菌共培养实验中选取叶绿素a作为铜绿微囊藻的生长指标，主要操作为：取一定体积的藻液(V1)于5,000rpm室温离心10min，收集菌体后反复冻融3次，使细胞完全裂解以利于叶绿素a的提取；用一定体积的95％乙醇(V2)重悬，置于4℃冰箱过夜；5,000rpm室温离心10min，上清液于波长665nm、649nm、750nm处测定吸光值，计算叶绿素a的含量，根据叶绿素a的含量计算溶藻率，公式如下：

Chl-a(mg/L)＝[(A₆₆₅-A₇₅₀)×13.7-(A₆₄₉-A₇₅₀)×5.76]V2/V1

从图2中可知，在Z-1溶藻菌和XN-1絮凝菌的种子液比例为2:1的条件下，溶藻率最好；

在一种较优的实施方式中，发酵培养时按体积比Z-1溶藻菌种子液：XN-1絮凝菌种子液：发酵培养基＝10:5:100接种，发酵条件为曝气量1L/min，转速100rpm，温度30℃，3天后结束发酵；

实施例3：

高密度发酵对基质中营养源的种类和含量比要求较高，碳源与氮源的比例会影响菌株的生长，从而影响溶藻效果；

测试发酵培养基中碳源葡萄糖和氮源氯化铵的比例，选取2:1，1:1，1:2三组比例，在曝气量1L/min，转速100rpm，温度30℃条件下，发酵3d后测试菌剂的溶藻率，结果见图3，碳氮比在1：1条件下，溶藻效果最好，优选浓度为0.5‰；

在一种较优的实施方式中，发酵培养基可以采用以下方法制备：将城镇污水厂的尾水引入发酵培养装置中，按质量比0.2‰加入氯化铵，并开启搅拌和曝气，时间为8小时，待水中余氯消解完全后，停止搅拌，再分别按质量比加入0.5‰葡萄糖、0.5‰氯化铵和0.3‰碳酸氢钠，并调节pH为7-8；本实施例中城镇污水厂的尾水采用安徽省马鞍山市第二污水处理厂的尾水。

实施例4：

本发明的上述实施方式中的菌剂，能够处理的藻类包括铜绿微囊藻、鱼腥藻、拟柱孢藻、微囊藻中一种或多种，同时也不排除其他藻类；本实施例以处理相同的含铜绿微囊藻污染水体为示例，在相同条件下探究菌剂的较佳用量；

本实施例中所采用的菌剂制备方法如下：分别采用LB平板划线活化Z-1溶藻菌和XN-1絮凝菌；分别将活化后的Z-1溶藻菌和XN-1絮凝菌接种到装有500mL肉汤培养基的1L的锥形瓶中，在30℃，180rpm/min条件下摇床扩大培养24h获得种子液；将安徽省马鞍山市第二污水处理厂的尾水引入发酵培养装置中，按质量比0.2‰加入氯化铵，并开启搅拌和曝气，时间为8小时，待水中余氯消解完全后，停止搅拌，再分别按质量比加入0.5‰葡萄糖、0.5‰氯化铵和0.3‰碳酸氢钠，并调节pH为7-8；取Z-1溶藻菌和XN-1絮凝菌的种子液，按体积比Z-1溶藻菌种子液：XN-1絮凝菌种子液：发酵培养基＝10:5:100接种到发酵培养装置中，发酵条件为曝气量1L/min，转速100rpm，温度30℃，3天后结束发酵获得菌剂；

(1)500mL的铜绿微囊藻污染水体，藻浓度为1×10⁶cell/ml，按照体积比菌剂：污染水体＝1:5的比例加入菌剂，在温度30℃，光照强度为2000lux；光暗周期为12h:12h，pH在7.5条件下处理铜绿微囊藻，36h后，通过测定叶绿素a的含量计算铜绿微囊藻的溶藻率，溶藻率为70％。

(2)500mL的铜绿微囊藻污染水体，藻浓度为1×10⁶cell/ml，按照体积比菌剂：污染水体＝1:10的比例加入菌剂，在温度30℃，光照强度为2000lux；光暗周期为12h:12h，pH在7.5条件下处理铜绿微囊藻，36h后，通过测定叶绿素a的含量计算铜绿微囊藻的溶藻率，溶藻率为91.2％。

(3)500mL的铜绿微囊藻污染水体，藻浓度为1×10⁶cell/ml，按照体积比菌剂：污染水体＝1:15的比例加入菌剂，在温度30℃，光照强度为2000lux；光暗周期为12h:12h，pH在7.5条件下处理铜绿微囊藻，36h后，通过测定叶绿素a的含量计算铜绿微囊藻的溶藻率，溶藻率为86.4％。

由此可见，在本实施例的条件下，按照体积比菌剂：污染水体＝1:10的比例加入菌剂较优，溶藻率可达90％以上。

对比例：

本对比例中，实施例为本发明的上述实施例4中的溶藻率可达90％以上的菌剂；对比例1采用公开号为CN111826318A，名称为一种铜绿微囊藻溶解菌及其应用的发明专利申请中的实施例4中10％的菌藻液体积比(即最优实施例)；对比例2在对比例1的基础上同时向处理的污染水体中加入20mg/L的PAC絮凝剂；用上述三种产品处理500mL的铜绿微囊藻污染水体，其中藻浓度为1×10⁶cell/ml，在温度30℃，光照强度为2000lux；光暗周期为12h:12h，pH在7.5条件下处理，每隔一段时间，通过测定叶绿素a的含量计算铜绿微囊藻的溶藻率，实验结果如下表1所示：

表1实施例及对比例处理铜绿微囊藻污染水体溶藻率

	24小时溶藻率	36小时溶藻率	3天溶藻率	5天溶藻率	7天溶藻率
						实施例	48.2％	90.4％	91.3％	91.6％	92.7％
对比例1	23.5％	50.8％	76.3％	84.2％	90.6％
						对比例2	37.2％	66.0％	85.1％	90.3％	91.2％

由上表1容易看出，本发明的菌剂发挥作用极快，溶藻率仅36h就可以达到90％以上，相对于对比例1单独采用Z-1溶藻菌，本发明的复合微生物除藻菌剂效果更好，其原因可能为藻类在其生长过程中分泌酸性多糖有机物质，在细胞外形成有机胶质层，使藻表面成电负性，XN-1絮凝菌在生长过程中可产生多糖和蛋白质类物质，使其与藻类产生电中和，或者通过静电吸附作用，破坏藻类在水中的稳定性,使得分散的藻类胶体颗粒脱稳,聚集成团而沉降，沉降到水中后氧浓度和光照减少又能进一步影响其生长；而结合实施例和对比例2不难发现，并不是Z-1溶藻菌与絮凝剂联用就能达到本发明的溶藻速度，虽然二者联用能起到一定的除藻效果加强，XN-1絮凝菌与Z-1溶藻菌之间还产生了较好地协同作用，带来了难以预料的效果，使除藻速率更快，效率更高；此外，本发明的物料使用少，仅需少量菌种自行简单培养，成本较低，能够更好地适应市场需求，容易推广应用。

以上仅为本发明的较佳实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求所界定的保护范围为准。

本发明未详述之处，均为本技术领域技术人员的公知技术。

Claims

1.一种复合微生物除藻菌剂，其特征在于：包括Z-1溶藻菌和XN-1絮凝菌；

所述Z-1溶藻菌的分类命名为耐热芽孢杆菌，拉丁文学名为Bacillussporothermodurans，保藏名称为Z-1溶藻菌，保藏单位全称为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为中国北京，保藏编号为20070，保藏日期为2020年6月11日；

所述XN-1絮凝菌的分类命名为拉乌尔菌，拉丁文学名为Raoultellasp，保藏名称为XN-1絮凝菌，保藏单位全称为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为中国北京，保藏编号为21338，保藏日期为2020年12月9日。

2.根据权利要求1所述的一种复合微生物除藻菌剂，其特征在于：还包括Z-1溶藻菌和XN-1絮凝菌二者的代谢产物。

3.根据权利要求1所述的一种复合微生物除藻菌剂，其特征在于：所述菌剂为液态。

4.一种如权利要求1至3任意一项所述的复合微生物除藻菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下具体步骤：

S1、分别活化Z-1溶藻菌和XN-1絮凝菌；

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中，发酵培养基的制备步骤包括：将城镇污水厂的尾水引入发酵培养装置中，按质量比0.2‰加入氯化铵，并开启搅拌和曝气，时间为8小时，待水中余氯消解完全后，停止搅拌，再分别按质量比加入0.5‰葡萄糖、0.5‰氯化铵和0.3‰碳酸氢钠，并调节pH为7-8。

6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中，发酵培养的步骤包括：按体积比Z-1溶藻菌种子液：XN-1絮凝菌种子液：发酵培养基＝10:5:100接种，发酵条件为曝气量1L/min，转速100rpm，温度30℃，3天后结束发酵。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，扩大培养的步骤包括：分别将活化后的Z-1溶藻菌和XN-1絮凝菌接种到装有500mL肉汤培养基的1L的锥形瓶中，在30-35℃，100-300rpm/min条件下摇床培养12-24h。

8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中，活化采用LB平板。

9.一种如权利要求1至3任意一项所述的复合微生物除藻菌剂在藻类污染水体中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于：在铜绿微囊藻浓度为1×10⁶cell/ml，温度30℃，光照强度为2000lux，光暗周期为12h:12h，pH为7.5的条件下，按照体积比菌剂：污染水体＝1:10的比例，向污染水体中加入菌剂，36h后溶藻率为91.2％。