CN116042493B - 蜡样芽孢杆菌、菌剂、其在处理化工废水中的应用和处理装置 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株蜡样芽孢杆菌、菌剂、其在处理化工废水中的应用和处理装置该菌株为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)GD‑1,于2022年11月2日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心,菌种保藏号为:CGMCC NO.26020。本发明的蜡样芽孢杆菌在高盐条件下可高效降解废水中的苯甲酸类化工中间体,并且对其他苯甲酸类化合物也具有降解能力。将本发明的GD‑1菌剂应用到生物处理系统中,强化处理化工中间体废水,实现对实际化工废水的生物处理,不仅处理效率高,而且成本低廉,工艺简单,有良好的经济效益,也为工业废水中有机物的降解提供了高效的微生物种质资源。
Description
技术领域
本发明属于微生物及废水处理技术领域,具体涉及一株蜡样芽孢杆菌、菌剂、生物处理装置,以及以该菌剂在处理含苯甲酸类化合物的高盐废水中的应用。
背景技术
苯甲酸类精细化工产品是一类非常重要的中间体,这类精细化工产品在农药杀虫剂、染料、医药、防腐剂、纺织等生产方面用途很广。我国每年苯甲酸精细化工产品总量达到10万吨,生产总值有几十亿,成为我国精细化工产品生产不可缺少的部分。
2-氨基-5-硝基苯甲酸是一种重要的苯甲酸衍生物,它是合成5-(4-硝基-2-羧基苯基偶氮)-2-硫代-4-噻唑啉酮、苯并嗪唑酮衍生物等染料的重要中间体,同时还可用作合成活性染料、偶氮染料、多种香料、各种酯类、紫外吸收剂等的中间体。2,4,5-三氟-3-甲氧基苯甲酸主要用作医药中间体,是合成巴罗沙星、加替沙星等氟喹诺酮类广谱抗菌素的关键中间体。5-硝基水杨酸又名5-硝基-2-羟基苯甲酸,是合成抗溃疡性结肠炎药马沙拉嗪和奥沙拉嗪的原料中间体,也是合成染料、颜料等精细化学品的重要中间体。苯甲酸类化工中间体,应用广泛,产生的废水毒性大、难降解化合物含量高、COD浓度高、盐含量和色度高。为了避免资源浪费和环境污染,必须对废水进行处理。
苯甲酸类废水处理工艺有萃取法、微电解法、Fenton氧化法,其中,萃取法虽然处理效率高、投资小、操作工艺简单,但纯物理工艺无法对萃取的有机物进行有效降解,仍需增加后处理;微电解、Fenton氧化法工艺流程复杂、运维成本较高,并且处理后出水需再进入到生化系统进行生物处理。与物理化学法相比,应用生物处理系统去除污染物,具有成本效益、减少二次污染等优势。因此,本发明的目的是筛选出具有苯甲酸类化合物高效降解性能的微生物,是应用生物强化法处理这类工业废水的有效途径,对于处理含苯甲酸类化合物的工业废水具有重要的意义。
发明内容
发明目的:本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足,提供一株蜡样芽孢杆菌,所述蜡样芽孢杆菌GD-1在高盐条件下可高效降解废水中的苯甲酸类化工中间体。
本发明还要解决的技术问题在于基于上述蜡样芽孢杆菌制备一种菌剂,并将其用于含有苯甲酸类化工中间体的废水的处理上。
本发明更进一步地提出了一种用于处理含有苯甲酸类化工中间体的废水的的处理设备。
具体地,本发明公开了一株蜡样芽孢杆菌,其分类命名为蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus),菌株名为GD-1,于2022年11月2日保藏于微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,菌种保藏号为:CGMCC NO.26020,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明进一步提出了一种菌剂,其包含上述蜡样芽孢杆菌GD-1。
本发明进一步提出了上述菌剂的制备方法,包括以下具体步骤:
S1、从LB固体培养基平板上挑取菌株GD-1的单菌落,转接至LB液体培养基中,摇床振荡培养至对数生长期;
S2、将处于对数生长期的菌株GD-1菌液转接至种子罐中进行培养;
S3、将种子罐培养后的菌液接种至发酵罐中扩大培养,发酵液出罐后包装即可得菌剂。
其中,所述步骤S1中,LB液体培养基的组份如下:蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L和NaCl 10g/L;LB固体培养基的制备方法为:在LB液体培养基中加入2%的琼脂,即得到LB固体培养基;培养条件为转速160~180r/min,温度30~35℃。
所述步骤S2中,种子罐的培养基成分为:葡萄糖8g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 5g/L、K2HPO4 1g/L、CaCO3 2g/L、MgSO4 0.2g/L,pH值7.2~7.5;控制种子罐温度为30~35℃、搅拌速度为180~250r/min,培养时间24~60h。
所述步骤S3中,菌液的接种量按体积比为5%~10%;发酵罐的培养基成分与种子罐相同,发酵条件为:搅拌速度180~240r/min,培养温度30~35℃,发酵时间96~108h;发酵结束后发酵液中有效活菌数为109个/mL以上。
本发明进一步提出了上述蜡样芽孢杆菌或上述菌剂在处理苯甲酸类化工中间体高盐废水中的应用。
其中,所述苯甲酸类化工中间体为2,4,5-三氟-3-甲氧基苯甲酸、2-氨基-5-硝基苯甲酸、5-硝基水杨酸中的一种或多种;废水中苯甲酸类化工中间体含量为50~1000mg/L;所述化工废水中的盐浓度为1~20g/L。
本发明还提出了一种苯甲酸类化工中间体高盐废水的处理方法,包括以下步骤:
1)将含苯甲酸类化工中间体的废水加入调节池,调节废水中P含量和N含量,如可以选择K2HPO4、KH2PO4、NH4Cl、(NH4)2SO4等来调节,使NP含量为微生物生长最适的C N P比例,优选地,使废水中COD:N:P的浓度比为300:5:1;
(2)废水依次引入厌氧池、好氧池、好氧生物滤池中,并向厌氧池、好氧池、好氧生物滤池中投加所述蜡样芽孢杆菌菌剂进行生物降解;
(3)将步骤(2)处理后的出水引入混凝沉淀池并加入絮凝剂混凝沉淀,出水达标后排放。优选地,所述絮凝剂为聚丙烯酰胺、聚合氯化铝(PAC)、聚合硫酸铁(PFS)中的任意一种,投加量为0.01~10ppm。
其中,所述苯甲酸类化工中间体为2,4,5-三氟-3-甲氧基苯甲酸、2-氨基-5-硝基苯甲酸、5-硝基水杨酸中的一种或多种;废水中苯甲酸类化工中间体含量为50~1000mg/L;所述化工废水中的盐浓度为1~20g/L;
所述厌氧池废水处理条件为:pH 7.5~8.0、温度15~35℃、停留时间16~24h;
好氧池废水处理条件为:pH 7.0~8.0、温度15~35℃、停留时间20~48h、溶氧2~4mg/L;
好氧生物滤池废水处理条件为:pH 8.0~9.0、温度15~35℃、停留时间16~24h、溶氧1~4mg/L;
厌氧池、好氧池和好氧生物滤池中菌剂的投加量均按体积比为5-10%投加。
本发明还提出了一种苯甲酸类化工中间体高盐废水的处理装置,包括依次连接的调节池、厌氧池、好氧池、好氧生物滤池和混凝沉淀池,其中,所述厌氧池、好氧池和好氧生物滤池依次连接,厌氧池、好氧池和好氧生物滤池中均投加所述的蜡样芽孢杆菌或所述的菌剂。
有益效果:本发明获得的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)GD-1能以化工中间体2,4,5-三氟-3-甲氧基苯甲酸、2-氨基-5-硝基苯甲酸、5-硝基水杨酸为唯一碳源在无机盐培养基中生长,在污染物浓度为0.1~1g/L的范围内可高效降解化工中间体,48h时降解率可达95%以上。并且对其他苯甲酸类化合物也具有降解能力。当化工生产废水的盐浓度在1~20g/L范围内时,菌株GD-1对污染物的降解率均在95%以上,表明该菌株可以在高盐条件下高效降解化工生产废水中的有机污染物。应用到生物处理系统强化处理化工中间体废水,不仅处理效率高,而且成本低廉,工艺简单,经济效益大,也为工业废水中有机物的降解提供了高效的微生物种质资源。
附图说明
图1是本发明中菌株GD-1的菌落形态;
图2是本发明中菌株GD-1的系统发育树;
图3是本发明中菌株GD-1对污染物的降解效果;
图4是本发明中菌株GD-1在不同盐浓度下对污染物的降解效果;
图5是本发明菌株GD-1在不同pH下生物降解效果;
图6是本发明中菌株GD-1对不同浓度有机污染物的降解效果;
图7是蜡样芽孢杆菌GD-1生物处理装置示意图;
图8是本发明生物处理系统对实际化工废水的处理效果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明,本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
实施例1降解菌株的分离、纯化与鉴定。
取某污水处理厂生化曝气池的活性污泥10mL,转入90mL无机盐液体培养基中,培养基中2,4,5-三氟-3-甲氧基苯甲酸、2-氨基-5-硝基苯甲酸、5-硝基水杨酸浓度均为500mg/L,30℃、160r/min恒温摇床振荡富集培养5天。5天后,以5%的接种量接入到新鲜无机盐培养基中继续培养,每次转接培养基中有机污染物浓度增加100mg/L,连续富集转接5次,使无机盐培养基中污染物浓度达到1000mg/L,获得富集液。
取1mL富集的菌液,经梯度稀释后,涂布至固体LB培养基平板上,于30℃下恒温培养,待菌落长出后,根据菌落的形态、大小及颜色进行分离筛选,分离纯化后接至LB培养基斜面上,于4℃冰箱保存备用。
将纯化后的菌株再次转接到无机盐液体培养基中,于30℃,160r/min振荡培养,验证不同菌株的降解效果,筛选出有高效降解效果的优势菌株。经分离纯化得到了一株能够高效降解苯甲酸类化工中间体的菌株,命名为GD-1。
菌株GD-1的主要生理学特征为革兰氏染色阳性,菌体杆状,在LB固体培养基上菌落白色、光滑、凸起、湿润、不透明,表面有光泽,边缘整齐,菌落直径2~4mm,能够以化工中间体为唯一碳源进行生长,菌落形态如图1所示。经鉴定,菌株GD-1为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus),于2022年11月2日保藏于微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,菌种保藏号为:CGMCC NO.26020。菌株GD-1的系统发育树如图2所示。
无机盐培养基组分为:NaCl 1.0g/L、(NH4)2SO4 1.0g/L、K2HPO4 1.5 g/L、KH2PO40.5g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L和水1L,pH 7.0,培养基121℃灭菌20min。
LB固体培养基组分为:酵母浸粉5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L,pH 7.0,固体培养基中加入2%的琼脂,培养基121℃灭菌20min。
实施例2菌株GD-1对污染物的降解。
配置无机盐液体培养基,使培养基中污染物2,4,5-三氟-3-甲氧基苯甲酸、2-氨基-5-硝基苯甲酸、5-硝基水杨酸浓度均为500mg/L,调至培养基pH为7。挑取实施例1中筛选获得的降解菌株GD-1单菌落接种于50mL LB培养基中,于30℃、160r/min条件下培养至对数生长期,将所得菌液8000r/mim离心5min,收集菌体细胞,用无菌水重悬后,制成OD600nm=1.0的菌悬液作为种子液。将种子液按体积5%(V/V)的接种量接种到无机盐培养基中,30℃、160rpm的恒温震荡箱中培养,定时取样,检测降解情况,降解效果如图3所示。
由图3可知,菌株GD-1可有效降解2,4,5-三氟-3-甲氧基苯甲酸、2-氨基-5-硝基苯甲酸、5-硝基水杨酸,24h时降解率分别为66%、76%和80%,48h时降解率均达到95%以上。由此说明,菌株GD-1可高效的降解污染物。
实施例3菌株GD-1对其他苯甲酸类化合物的降解。
在无机盐液体培养基中分别添加终浓度为200mg/L的苯甲酸类化合物苯甲酸、对羟基苯甲酸、5-甲氧基水杨酸、4-羟基-3-甲氧基苯甲酸和2,4-二甲氧基苯甲酸作为唯一碳源,将实施例2中获得的种子液以5%的接种量接种到含不同碳源的各无机盐培养基中,以不加碳源的无机盐培养基作为对照,30℃、160r/min条件下振荡培养,取样测定OD 600值,与对照相比,如果OD 600值增大,则证明菌株能够利用该底物。
表1菌株GD-1的降解底物谱
底物 | OD 600 | 底物 | OD 600 |
苯甲酸 | + | 5-甲氧基水杨酸 | + |
对羟基苯甲酸 | + | 间羟基苯甲酸 | + |
4-羟基-3-甲氧基苯甲酸 | + | 2,4-二甲氧基苯甲酸 | + |
通过表1可以看出,菌株GD-1除了对2,4,5-三氟-3-甲氧基苯甲酸、2-氨基-5-硝基苯甲酸、5-硝基水杨酸具有高效的降解效果外,对其他苯甲酸类化合物也能利用,也具有降解性。
实施例4菌株GD-1对盐浓度的耐受性。
调节无机盐培养基中NaCl浓度分别为1g/L、5g/L、10g/L、15g/L、20g/L,培养基pH均为7。按5%的接种量将菌株GD-1的种子液接种到2,4,5-三氟-3-甲氧基苯甲酸、2-氨基-5-硝基苯甲酸、5-硝基水杨酸浓度浓度均为500mg/L的无机盐培养液中,置于恒温振荡器在30℃,160r/min条件下培养24h,取样测定培养基中污染物浓度并计算降解率,结果见图4。
根据图4可知,在1~20g/L的NaCl浓度范围内,菌株GD-1具有较高的降解效率,表明菌株GD-1具有良好的耐盐性,为高盐度工业废水处理提供了有利条件。
实施例5菌株GD-1在不同pH下生物降解效果。
用NaOH或HCl调节无机盐培养基的pH分别为4、5、6、7、8和9。按5%的接种量将菌株GD-1的种子液接种到2,4,5-三氟-3-甲氧基苯甲酸、2-氨基-5-硝基苯甲酸、5-硝基水杨酸浓度浓度均为500mg/L的无机盐培养液中,置于恒温振荡器在30℃,160r/min条件下培养24h,取样测定培养基中污染物浓度并计算降解率,结果见图5。
根据图5可知,pH在4~9的范围内,菌株GD-1具有较高的降解效率,降解率均在80%以上,表明菌株GD-1对pH的适应范围较广。
实施例6菌株GD-1对不同浓度有机污染物的降解效果。
将菌株GD-1种子液以5%的接种量接种至含不同浓度污染物(2,4,5-三氟-3-甲氧基苯甲酸、2-氨基-5-硝基苯甲酸、5-硝基水杨酸)的无机盐培养基中,培养基中污染物的初始浓度分别为50mg/L、200mg/L、400mg/L、600mg/L、800mg/L,1000mg/L于30℃、160r/min条件下摇床振荡培养,24h后测定其浓度,结果如图6所示。
由图6可知,菌株GD-1对浓度为50~1000mg/L污染物的降解率均在95%以上,表明该菌株可有效降解化工生产废水中的有机污染物。
实施例7降解菌剂的制备。
将本发明斜面保存的菌株GD-1,接种至LB固体培养基于30℃活化培养;活化后挑取单菌落接种至LB液体培养基(LB液体培养基组分:蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L和NaCl10g/L),30℃、180r/min振荡培养至对数生长期;将处在对数生长期的GD-1菌液转接至种子罐中进行培养,控制种子罐温度为30℃、搅拌速度为220r/min,溶氧DO控制在4mg/L,培养60h;种子罐的培养基成分为:葡萄糖8g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 5g/L、K2HPO4 1g/L、CaCO32g/L、MgSO4 0.2g/L,pH值7.2;将种子罐培养后的菌液以10%的接种量转接至发酵罐中扩大培养,发酵罐培养基成分与种子罐的相同,控制发酵条件:搅拌速度为220r/min,培养温度为30℃,溶氧DO 6mg/L、发酵108h;发酵结束后发酵液中有效活菌数为109个/mL以上,所得发酵液出罐后包装即可得到降解菌剂。
实施例8降解菌剂在化工废水处理中的应用。
含苯甲酸类化合物废水的生物处理装置,包括依次连接的调节池、厌氧池、好氧池、好氧生物滤池和混凝沉淀池,如图7所示。其中,厌氧池、好氧池和好氧生物滤池中均投加本发明的蜡样芽孢杆菌菌剂,菌剂投加量按照废水体积比为5%投加。
取苯甲酸类化工中间体生产废水,测得废水中2-氨基-5-硝基苯甲酸浓度为698mg/L,2-氨基-5-硝基苯甲酸浓度为600mg/L、5-硝基水杨酸浓度为536mg/L,废水CO D为4200mg/L,色度为256。废中水氯化钠浓度为12.1g/L,pH为6.1。采用上述的生物处理装置对上述废水进行处理,处理过程如下:
(1)将含盐化工中间体生产废水引入调节池,添加尿素和K2HPO4调节使废水中COD:N:P为300:5:1,调节废水含盐量在20wt%以内;
(2)废水调配好后,依次进入厌氧池、好氧池和好氧生物滤池,同时分别在厌氧池、好氧池和好氧生物滤池按废水体积5%的投加量投加蜡样芽孢杆菌菌剂,进行生物降解,其中,厌氧池废水处理条件为:pH 7.5~8.0、温度30℃、停留时间16h;好氧池废水处理条件为:pH 7.0~8.0、温度30℃、停留时间20h、溶氧4mg/L;好氧生物滤池废水处理条件为:pH8.0~9.0、温度30℃、停留时间16h、溶氧控制在4mg/L;
(3)废水进行生物处理后,进一步采用聚丙烯酰胺混凝沉淀,达标后进入污水处理厂。
生物降解后分别测定废水中2,4,5-三氟-3-甲氧基苯甲酸、2-氨基-5-硝基苯甲酸、5-硝基水杨酸浓度、COD浓度及废水色度。
由图8可知,经生物处理系统处理48h后废水中污染物浓度显著降低,2-氨基-5-硝基苯甲酸的浓度为21mg/L,2-氨基-5-硝基苯甲酸浓度为41mg/L,5-硝基水杨酸浓度为15mg/L。废水的COD和废水色度也较处理前降低,处理后COD为345mg/L,色度为64。
本发明提供了一种处理含苯甲酸类化合物的工业废水的思路及方法,具体实现该技术方案的方法和途径很多,以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。
Claims (8)
1.一株蜡样芽孢杆菌,分类命名为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus),菌株名为GD-1,于2022年11月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,菌种保藏号为:CGMCC NO.26020。
2.一种菌剂,其包含权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌。
3.权利要求2所述的菌剂的制备方法,其特征在于,包括以下具体步骤:
S1、从LB固体培养基平板上挑取菌株GD-1的单菌落,转接至LB液体培养基中,摇床振荡培养至对数生长期;
S2、将处于对数生长期的菌株GD-1菌液转接至种子罐中进行培养;
S3、将种子罐培养后的菌液接种至发酵罐中扩大培养,发酵液出罐后包装即可得菌剂。
4.根据权利要求3所述的菌剂的制备方法,其特征在于,所述步骤S1中,LB液体培养基的组份如下:蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L和NaCl 10g/L;LB固体培养基的制备方法为:在LB液体培养基中加入2%的琼脂,即得到LB固体培养基;培养条件为转速160~180r/min,温度30~35℃。
5.根据权利要求4所述的菌剂的制备方法,其特征在于,所述步骤S2中,种子罐的培养基成分为:葡萄糖8g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 5g/L、K2HPO4 1g/L、CaCO3 2g/L、MgSO40.2g/L,pH值7.2~7.5;控制种子罐温度为30~35℃、搅拌速度为180~250r/min,培养时间24~60h;所述步骤S3中,菌液的接种量按体积比为5%~10%;发酵罐的培养基成分与种子罐相同,发酵条件为:搅拌速度180~240r/min,培养温度30~35℃,发酵时间96~108h;发酵结束后发酵液中有效活菌数为109个/mL以上。
6.权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌或权利要求2所述的菌剂在处理苯甲酸类化工中间体高盐废水中的应用;所述苯甲酸类化工中间体为2,4,5-三氟-3-甲氧基苯甲酸、2-氨基-5-硝基苯甲酸、5-硝基水杨酸中的一种或多种;废水中苯甲酸类化工中间体含量为50~1000mg/L;所述化工废水中的盐浓度为1~20g/L。
7.一种苯甲酸类化工中间体高盐废水的处理方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将含苯甲酸类化工中间体的废水加入调节池,调节废水中P含量和N含量,使废水中COD:N:P的浓度比为200~300:5:1;
(2)废水依次引入厌氧池、好氧池、好氧生物滤池中,并向厌氧池、好氧池、好氧生物滤池中投加权利要求2所述的菌剂进行生物降解;
(3)将步骤(2)处理后的出水引入混凝沉淀池并加入絮凝剂混凝沉淀,出水达标后排放。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,苯甲酸类化工中间体为2,4,5-三氟-3-甲氧基苯甲酸、2-氨基-5-硝基苯甲酸、5-硝基水杨酸中的一种或多种;废水中苯甲酸类化工中间体含量为50~1000mg/L;所述化工废水中的盐浓度为1~20g/L;
厌氧池废水处理条件为:pH 7.5~8.0、温度15~35℃、停留时间16~24h;
好氧池废水处理条件为:pH 7.0~8.0、温度15~35℃、停留时间20~48h、溶氧2~4mg/L;
好氧生物滤池废水处理条件为:pH 8.0~9.0、温度15~35℃、停留时间16~24h、溶氧1~4mg/L;
厌氧池、好氧池和好氧生物滤池中菌剂的投加量均按体积比5-10%投加。
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