CN114164156A - 恶臭假单胞菌株及微生物菌剂、去除降解环境中苯的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物与环境保护领域，尤其涉及恶臭假单胞菌株及微生物菌剂的应用、去除降解环境中苯的方法，本发明的恶臭假单胞菌株(Pseudomonas putida)，其特征在于，其保藏编号为：CGMCC NO.22761。本发明的恶臭假单胞菌株可实现高效降解含苯废水中的苯，该菌株及其微生物菌剂投入到含苯废水中，可以有效耐受高负荷或抑制有害物质的冲击，能够利用生化系统中的苯作为唯一碳源，在无其他碳源的情况下，也可快速降解苯，对苯进行彻底化、无害化降解处理，使用该菌株及其菌剂还可以避免采用物理化学法处理成本高、造成二次污染等缺点，在修复苯污染土壤、净化苯污染空气与含苯污水中具有较好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及微生物与环境保护领域，尤其涉及恶臭假单胞菌株及微生物菌剂、去除降解环境中苯的方法。
背景技术
苯(Benzene)是芳香族化合物的典型代表，苯可作为溶剂、萃取剂和稀释剂、居室的装饰和装修材料、并且是有机化学合成中的一种重要的原料，因此，苯是一种工业用途广泛的职业有害因素，同时也是一种主要的室内空气污染物。鉴于苯生产量大，用途广泛，造成苯在我国部分地区及特定区域内大气、土壤、水以及生物体等环境介质中的高暴露浓度。由于苯是挥发性有机物，具有强烈的“三致”作用，且其毒性是潜在的，在人体内的潜伏期长达十几年，对人体健康带来不可估量的危害。
目前，苯污染的处理技术主要有物理法、化学法和生物法。生物法具有无二次污染、费用低等优点，在国内外受到广泛关注，随着对有机污染物降解过程研究的深入，越来越多的研究逐步转向如何进一步提高其生物处理效率。近年来，国内外学者陆续筛选出一些能够降解苯的微生物，苯系物的主要降解微生物是好氧细菌和厌氧细菌。
因此，提供降解效率高、环境耐受性好的降解苯的菌种，具有重要的现实意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了恶臭假单胞菌株及微生物菌剂、去除降解环境中苯的方法。
本发明的恶臭假单胞菌株具有较好的环境耐受性，且该恶臭假单胞菌株和该菌株制备的微生物菌剂对苯具有高效的降解效果，在修复苯污染土壤、净化苯污染空气与含苯污水中具有较好的应用前景。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了恶臭假单胞菌株(Pseudomonas putida)，该菌株的保藏编号为：CGMCC NO.22761。
本发明还提供了微生物菌剂，包括该恶臭假单胞菌株以及可接受的助剂。
本发明还提供了微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：
S1：取所述恶臭假单胞菌株接种培养，得到液体种子；
S2：取所述液体种子接种后扩大培养，得到培养种子；
S3：取所述培养种子发酵培养，得到微生物菌剂。
作为优选，S2中接种的接种量为8～10％v/v，活菌数为1～10亿CFU/mL。
更优选的，S2中接种的接种量为8％v/v，活菌数为10亿CFU/mL。
作为优选，S3中发酵培养的温度为28～33℃，周期为10～16h，搅拌速度为180～220rpm，无菌空气通气比为：1:0.8～1.5。
更优选的，S3中发酵培养的温度为33℃，周期为10h，搅拌速度为200rpm，无菌空气通气比为：1:0.8。
在本发明一些具体实施方式中，发酵通气比：发酵生产中，一般以通风比来表示空气流量，通常以一分钟内通过单位体积发酵培养基的空气体积比来表示(V/V·m)。1:1是指每分钟通入等发酵培养基体积的无菌空气。
本发明还提供了恶臭假单胞菌株、微生物菌剂和/或制备方法制得的微生物菌剂在降解和/或去除环境中苯的应用。
作为优选，环境为水体和/或土壤。
本发明还提供了降解和/或去除环境中的苯的方法，取恶臭假单胞菌株、微生物菌剂和/或制备方法制得的微生物菌剂接种于所述环境中培养。
作为优选，微生物菌剂的培养温度为28～33℃，时间为10～16h，接种的接种量为8～10％v/v，活菌数为100-150亿CFU/mL，微生物菌剂与环境的体积比为0.1％～10％。
作为优选，恶臭假单胞菌株的培养温度为33℃，搅拌速度为170rpm，时间为20h，所述接种的接种量为8～10％v/v，活菌数为1～10亿CFU/mL。
本发明提供了恶臭假单胞菌株(Pseudomonas putida)，该菌株的保藏编号为：CGMCC NO.22761。
本发明的恶臭假单胞菌株可实现高效降解含苯废水中的苯，该菌株及其微生物菌剂投入到含苯废水中，可以有效耐受高负荷或抑制有害物质的冲击，能够利用生化系统中的苯作为唯一碳源，在无其他碳源的情况下，也可快速降解苯，在温度25～35℃、pH为6.5～7.5条件下处理48h，对初始浓度低于400mg/L的苯降解率能达到97％～100％，对苯进行彻底化、无害化降解处理，使用该菌株及其菌剂还可以避免采用物理化学法处理成本高、造成二次污染等缺点，在修复苯污染土壤、净化苯污染空气与含苯污水中具有较好的应用前景。
生物保藏说明
生物材料：YJY21-06；分类命名：恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)；于2021年06月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏编号：CGMCC No.22761。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示恶臭假单胞菌B06的平板生长形态。
具体实施方式
本发明公开了恶臭假单胞菌株及微生物菌剂的应用、去除降解环境中苯的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。以下实施例中所用试剂均为市售。
实施例1菌株的分离和鉴定
采集滨州市某农药厂污染土壤，土壤呈黑褐色，将采集的土样加入无菌蒸馏水空曝48h，静置后取10％上清液接种于(接种量10％v/v，活菌数10亿CFU/mL)含50mg/L苯的无机盐培养基中，在33℃和150rpm活化培养48h。取培养液(接种量10％v/v，活菌数10亿CFU/mL)转接至含苯50mg/L的无机盐培养基中，同样条件驯化培养48h，然后取10％培养液移接(接种量10％v/v，活菌数10亿CFU/mL)至含苯无机盐培养基(苯的浓度分别为100、150、200、250、300、350、400、450、500mg/L)，每个梯度重复2次。将含苯500mg/L的培养液进行稀释涂布，无机盐平板中加入等浓度的苯，33℃培养2～3d，挑选不同形态的菌落，进行划线纯化获得单菌落，再分别进行降解效果验证，最终选出降解效果较好的菌株。
无机盐培养基：将磷酸氢二钠(终浓度为1.5g/L)，磷酸二氢钾(终浓度为1.5g/L)，硫酸铵(终浓度为1.0g/L)，七水硫酸镁(终浓度为0.2g/L)，七水硫酸亚铁(终浓度为0.02g/L)，氯化钙(终浓度为0.01g/L)，七水硫酸锌(终浓度为0.1mg/L)，四水氯化锰(终浓度为0.005mg/L)，六水氯化铁(终浓度为0.1mg/L)，五水硫酸铜(终浓度为0.005mg/L)，氯化钙(终浓度为0.002mg/L)，0.2％吐温80，混合，调节pH 7.0～7.5，121℃灭菌20min。
经16S rDNA测序鉴定，该菌株为恶臭假单胞(Pseudomonas putida)，该菌株已于2021年06月23日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.22761。
该菌株的细胞形态呈圆形，边缘整齐，杆状，菌落为白色，无芽孢，不透明，表面光滑湿润，形态饱满，呈圆形，为革兰氏阴性菌，如图1所示。
实施例2菌株B06对水体中苯的降解率
将10mL实施例1中的无机盐培养基与10％的实施例1获得的菌株的菌液(菌株接种(接种量10％v/v，活菌数10亿CFU/mL)，在LB液体培养基中置于33℃，170rpm培养20h)置于50mL血清瓶中，分别加入苯(200、400、600mg/L)为唯一碳源，每个梯度做三个平行，加盖密封后，于33℃，170rpm，避光条件下振荡培养48h，测定血清瓶中苯的残留浓度。结果如表1所示。
表1菌株B06对不同初始浓度的苯的降解率
| 苯浓度 | 48h降解率 | 54h降解率 | 72h降解率 |
| 200mg/L | 100％ | ||
| 400mg/L | 97.0％ | 100.0％ | |
| 600mg/L | 79.6％ | 83.7％ | 100.0％ |
结果表明，菌株B06对含有不同初始浓度的苯废水有一定的降解能力，其中，对初始浓度低于400mg/L的苯48h降解率能达到97％～100％，对初始浓度600mg/L的苯48h降解率能达到84％。
实施例3微生物菌剂的制备
(1)菌种活化
取100μL冻存的实施例1获得的恶臭假单胞菌株接种(接种量0.1％v/v，活菌数10亿CFU/mL)于含有100mL LB液体无菌培养基的三角瓶中，置于33℃，170rpm培养箱中振荡培养至对数期；
(2)液体种子制备
将100mL活化的菌种(接种量10％v/v，活菌数10亿CFU/mL)转接到含有1L LB液体无菌培养基中，于33℃，170rpm培养箱中振荡培养至对数期；
(3)种子罐发酵
将制备好的液体种子(接种量10％v/v，活菌数10亿CFU/mL)接种入装液量为70％的20L种子罐中扩大培养。
(4)生产罐发酵
将种子液(接种量10％v/v，活菌数30亿CFU/mL)接入装液量为70％的生产罐的培养基中培养，发酵结束后菌体数量达到120亿/mL以上，将发酵完成后培养液出罐即得液体菌剂；
上述步骤(3)种子罐发酵和步骤(4)生产罐发酵的培养条件为：无菌空气的通气比均为1:1.5，搅拌速度为220rpm，培养温度为28℃，发酵周期为16h；
以上述步骤中，种子罐和生产罐所用的发酵培养基配方为(单位均为体积比)：蔗糖1.8％，玉米淀粉1.2％，玉米浆干粉1.2％，硫酸镁0.05％，硫酸锰0.06％，氯化钠0.03％，硫酸亚铁0.01％，硫酸铵0.5％，其余为水，pH7.0～7.4。
实施例4微生物菌剂的制备
(1)菌种活化
取100μL冻存的实施例1获得的恶臭假单胞菌株接种(接种量0.1％v/v，活菌数10亿CFU/mL)于含有100mL LB液体无菌培养基的三角瓶中，置于33℃，170rpm培养箱中振荡培养至对数期；
(2)液体种子制备
将100mL活化的菌种(接种量10％v/v，活菌数10亿CFU/mL)转接到含有1L LB液体无菌培养基中，于33℃，170rpm培养箱中振荡培养至对数期；
(3)种子罐发酵
将制备好的液体种子(接种量9％v/v，活菌数10亿CFU/mL)接种入装液量为70％的20L种子罐中扩大培养。
(4)生产罐发酵
将种子液(接种量9％v/v，活菌数30亿CFU/mL)接入装液量为70％的生产罐的培养基中培养，发酵结束后菌体数量达到120亿/mL以上，将发酵完成后培养液出罐即得液体菌剂；
上述步骤(3)种子罐发酵和步骤(4)生产罐发酵的培养条件为：无菌空气的通气比均为1:1.2，搅拌速度为180rpm，培养温度为30℃，发酵周期为13h；
以上述步骤中，种子罐和生产罐所用的发酵培养基配方为(单位均为体积比)：蔗糖1.8％，玉米淀粉1.2％，玉米浆干粉1.2％，硫酸镁0.05％，硫酸锰0.06％，氯化钠0.03％，硫酸亚铁0.01％，硫酸铵0.5％，其余为水，pH7.0～7.4。
实施例5微生物菌剂的制备
(1)菌种活化
取100μL冻存的实施例1获得的恶臭假单胞菌株接种(接种量0.1％v/v，活菌数10亿CFU/mL)于含有100mL LB液体无菌培养基的三角瓶中，置于33℃，170rpm培养箱中振荡培养至对数期；
(2)液体种子制备
将100mL活化的菌种(接种量10％v/v，活菌数10亿CFU/mL)转接到含有1L LB液体无菌培养基中，于33℃，170rpm培养箱中振荡培养至对数期；
(3)种子罐发酵
将制备好的液体种子(接种量8％v/v，活菌数10亿CFU/mL)接种入装液量为70％的20L种子罐中扩大培养。
(4)生产罐发酵
将种子液(接种量8％v/v，活菌数30亿CFU/mL)接入装液量为70％的生产罐的培养基中培养，发酵结束后菌体数量达到120亿/mL以上，将发酵完成后培养液出罐即得液体菌剂；
上述步骤(3)种子罐发酵和步骤(4)生产罐发酵的培养条件为：无菌空气的通气比均为1:0.8，搅拌速度为200rpm，培养温度为33℃，发酵周期为10h；
以上述步骤中，种子罐和生产罐所用的发酵培养基配方为(单位均为体积比)：蔗糖1.8％，玉米淀粉1.2％，玉米浆干粉1.2％，硫酸镁0.05％，硫酸锰0.06％，氯化钠0.03％，硫酸亚铁0.01％，硫酸铵0.5％，其余为水，pH7.0～7.4。
实施例6微生物菌剂对炼化废水中苯的降解效率
取滨州市炼化污水处理池中含苯废水作为试样，废水中的苯浓度为400mg/L。将废水分成12份，分别设空白对照组和实验组，实验组添加实施例3制备的微生物菌剂(活菌数140亿CFU/mL)，分别按照接种量0.1％、1％、2.5％(v/v)接种至含苯废水中，设空白对照，每组设三个平行，加盖密封后，于33℃，170rpm避光条件下振荡培养48h，测定体系中苯的残留浓度，并计算降解率。降解率＝(苯系物减少量-苯系物挥发量)/(苯系物初始量-苯系物挥发量)×100％。结果如表2所示。
表2不同菌剂添加量对体系中苯的去除效果
结果表明，液体菌剂的添加可以有效去除废水中的苯，菌剂添加量越大越有利于体系中苯的去除，其中，按照0.5％、1％、2.5％的体积比添加液体菌剂在48h内对废水中苯降解率分别达72.2％、95.2％、97.5％，2.5％的液体菌剂添加量效果最佳。
实施例7微生物菌剂对含苯土壤的降解效率
取无苯污染的风干土，过100目筛后混合，取200g过滤后的无苯污染风干土，用无机盐溶液调节土壤含水率至35％后置于500mL血清瓶中，加入苯至浓度为400mg/kg。将实施例5制备的微生物菌剂(活菌数140亿CFU/mL)，以体积质量比1％、5％与10％的接种量分别接入到上述土壤体系中，每个做三个平行实验，并设空白对照，在25℃条件下培养7天，取土壤样品，检测土壤中苯系物的含量，计算降解率。结果如表3所示。
表3不同菌剂添加量对体系中苯的去除效果
| 组别 | 菌剂接种量 | 体系中苯的剩余量(mg/kg) | 降解率(％) |
| 实验组1 | 1％ | 282.9 | 20.6 |
| 实验组2 | 5％ | 205.8 | 42.3 |
| 实验组3 | 10％ | 215.8 | 39.5 |
结果表明，7天后苯的降解率分别为20.6％、42.3％与39.5％。结果表明，该苯降解菌菌株B06能够对受污染土壤中的苯进行有效的降解，可以达到一定程度的土壤净化和修复效果。
无机盐培养基：将磷酸氢二钠(终浓度为1.5g/L)，磷酸二氢钾(终浓度为1.5g/L)，硫酸铵(终浓度为1.0g/L)，七水硫酸镁(终浓度为0.2g/L)，七水硫酸亚铁(终浓度为0.02g/L)，氯化钙(终浓度为0.01g/L)，七水硫酸锌(终浓度为0.1mg/L)，四水氯化锰(终浓度为0.005mg/L)，六水氯化铁(终浓度为0.1mg/L)，五水硫酸铜(终浓度为0.005mg/L)，氯化钙(终浓度为0.002mg/L)，0.2％吐温80，混合，调节pH 7.0～7.5，121℃灭菌20min。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 黄河三角洲京博化工研究院有限公司
<120> 恶臭假单胞菌株及微生物菌剂、去除降解环境中苯的方法
<130> MP21032784
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1396
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgcagtcgag cggatgaggg gtgcttgcac tctgattcag cggcggacgg gtgagtaatg 60
cctaggaatc tgcccgatag tgggggacaa cgtttcgaaa ggaacgctaa taccgcatac 120
gtcctacggg agaaagtggg ggatcttcgg acctcacgct atcggatgag cctaggtcgg 180
attagctagt tggtgaggta atggctcacc aaggcgacga tccgtaactg gtctgagagg 240
atgatcagtc acactggaac tgagacacgg tccagactcc tacgggaggc agcagtgggg 300
aatattggac aatgggcgaa agcctgatcc agccatgccg cgtgtgtgaa gaaggtcttc 360
ggattgtaaa gcactttaag ttgggaggaa gggctgtcgg ctaataccct gcagttttga 420
cgttaccaac agaataagca ccggctaact tcgtgccagc agccgcggta atacgaaggg 480
tgcaagcgtt aatcggaatt actgggcgta aagcgcgcgt aggtggttca gcaagttgga 540
tgtgaaagcc ccgggctcaa cctgggaact gcatccaaaa ctactgagct agagtacggt 600
agagggtggt ggaatttcct gtgtagcggt gaaatgcgta gatataggaa ggaacaccag 660
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gttaaaactc aaatgaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc 900
gaagcaacgc gaagaacctt acctggcctt gacatgctga gaactttcca gagatggatt 960
ggtgccttcg ggaactcaga cacaggtgct gcatggctgt cgtcagctcg tgtcgtgaga 1020
tgttgggtta agtcccgtaa cgagcgcaac ccttgtcctt agttaccagc acgttatggt 1080
gggcactcta aggagactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaagtca 1140
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cgactgcgtg aagtcggaat cgctagtaat cgtgaatcag aatgtcacgg tgaatacgtt 1320
cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac catgggagtg ggttgctcca gaagtagcta 1380
gtctaacctt cggggg 1396
Claims (10)
1.恶臭假单胞菌株(Pseudomonas putida)，其特征在于，其保藏编号为：CGMCCNO.22761。
2.微生物菌剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的恶臭假单胞菌株以及可接受的助剂。
3.如权利要求2所述微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：取所述恶臭假单胞菌株接种培养，得到液体种子；
S2：取所述液体种子接种后扩大培养，得到培养种子；
S3：取所述培养种子发酵培养，得到微生物菌剂。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，S2中所述接种的接种量为8～10％v/v，活菌数为1～10亿CFU/mL。
5.如权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，S3中所述发酵培养的温度为28～33℃，周期为10～16h，搅拌速度为180～220rpm，无菌空气通气比为：1:0.8～1.5。
6.如权利要求1所述的恶臭假单胞菌株、如权利要求2所述的微生物菌剂和/或如权利要求3～5任一项所述制备方法制得的微生物菌剂在降解和/或去除环境中苯的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述环境为水体和/或土壤。
8.降解和/或去除环境中的苯的方法，其特征在于，取如权利要求1所述的恶臭假单胞菌株、如权利要求2所述的微生物菌剂和/或如权利要求3～5任一项所述制备方法制得的微生物菌剂接种于所述环境中培养。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述微生物菌剂的培养温度为28～33℃，时间为10～16h，接种量为8～10％v/v，活菌数为100-150亿CFU/mL；所述微生物菌剂与所述环境的体积比为0.1％～10％。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述恶臭假单胞菌株的培养温度为33℃，搅拌速度为170rpm，时间为20h，所述接种的接种量为8～10％v/v，活菌数为1～10亿CFU/mL。
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