CN109486721A

CN109486721A - 一种恶臭假单胞菌及其应用

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Publication number: CN109486721A
Application number: CN201811550779.9A
Authority: CN
Inventors: 蔺中; 任磊; 甄珍; 胡汉桥; 罗舒文; 郑伟鑫
Original assignee: Guangdong Ocean University
Current assignee: Guangdong Ocean University
Priority date: 2018-12-18
Filing date: 2018-12-18
Publication date: 2019-03-19
Anticipated expiration: 2038-12-18
Also published as: CN109486721B

Abstract

本发明公开了一种恶臭假单胞菌及其应用。本发明公开的恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）菌株RL‑JY1，于2018年11月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：60494。该菌株能够降解多种酚类化合物，并且能在3天内将无机盐培养基中含有的100 mg/L对硝基苯酚100%降解，同时还可高效降解1,2,4‑苯三酚、对苯二酚和4‑硝基儿茶酚。该菌株RL‑JY1在高盐、高酸碱、高温或低温逆环境中，能有效处理含盐量大于3%的工业废水，能够直接应用于工业废水中污染物的降解，同时对于上述污染物导致的环境污染的生物修复处理，具有较好的经济价值和应用前景。

Description

一种恶臭假单胞菌及其应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域。更具体地，涉及一种恶臭假单胞菌及其应用。

背景技术

酚类(Phenols)与硝基酚类(Nitrophenols)化合物是重要的工业原料，被广泛用于农药、医药、染料、油漆、橡胶等行业，也是焦化、造纸和石油化工等工业废水的主要组分，部分农药降解过程中也会产生酚类或硝基酚类化合物。很多的酚类和硝基酚类化合物具有多种生理毒性和致癌、致畸、致突变的“三致”效应，如对硝基苯酚、4-4-硝基儿茶酚、对苯二酚和1,2,4-苯三酚等。他们可通过多种途径进入环境，对生态系统造成严重的影响，由此引起的环境问题得到世界的普遍关注。由于人类对酚类和硝基酚类化合物的大量使用，使它们通过不同的途径进入大气、土壤、水环境，对生物圈造成了不同程度的污染。这些化合物与我们的日常生活密切相关，可以通过呼吸、饮食、饮水和皮肤接触进入人体，对人体的健康产生不同程度的危害。常见的有对硝基苯酚、邻硝基苯酚、间硝基苯酚、苯酚、苯二酚、苯三酚等。

最近研究指出硝基苯酚类化合物在土壤及地下水中的残留时间较长且易在生物体内富集，作为呼吸链氧化磷酸化过程解偶联剂，能够改变细胞代谢过程，对人体健康、动物、植物和微生物的生长产生巨大影响。对硝基苯酚(p-nitrophenol,PNP)作为一种重要的硝基酚类化合物，大量应用于染料、医药、农药及木材防腐剂的生产，也是目前世界上应用广泛和生产量大的人工合成的有机污染物之一。对硝基酚常温下为无色或淡黄色结晶，能溶于热水、乙醇、乙醚，不易挥发，自然条件下降解缓慢，早在1988年美国环保署已将对硝基苯酚列为优先控制污染物之一，规定其在自然水体中的浓度应低于10ng/L。

酚类与硝基酚类在环境中可通过非生物和生物两种途径进行降解，前者包括光解和水解，后者主要是微生物降解，大多数情况下前者降解速率远低于后者，因此，微生物降解是酚类和硝基酚类在自然环境中的主要降解途径。目前，国内外的研究主要集中在从活性污泥中筛选高效降解菌株对单一种类酚类或硝基酚类的生物降解。

恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)是环境中最为常见的细菌之一，是一种普遍存在的具有较高遗传适应性的细菌，它存在于很多不同的环境中。根据国内外文献报道，该菌株能够降解多种外源物质，如多氯联苯、酚类化合物、多环芳烃、有机磷农药等，该种菌具有用于生物修复的潜力。污染物的生物降解已有大量的研究报道，然而，能够同时降解多种污染物且能够耐受较高盐浓度的降解菌报道相对较少。

近年来，研究人员对污染物的生物降解进行了广泛细致的研究，并取得了许多成果。然而，微生物在工业废水中污染物的生物降解研究相对较少，主要是工业废水恶劣的条件所制约，如高盐浓度、极端pH、溶氧量低等。由于上述技术瓶颈，微生物在处理工业废水中的大规模应用受限。CN101475925A公开了降解高浓度喹啉化合物的恶臭假单胞菌KT-ql-116及其培养方法和应用，该菌株可以在pH为7.0～7.5，COD为1500～2000mg/L，培养温度为室温(25℃左右)，培养时间为3～5天的有氧条件下降解焦化废水中的苯酚，其中苯酚在焦化废水中浓度为50mg/L；该菌株KT-ql-116具有良好的底物宽泛性，可降解喹啉、苯、甲苯、二甲苯，但其在高盐浓度、高pH、温度范围广泛条件下的耐受性不强，且对于底物苯酚的耐受性不强，极大地限制了其工业应用。

CN104312938A公开了一种用于降解挥发性有机物的恶臭假单胞菌菌株S-1及其菌剂和应用，该挥发性有机物为异丙醇、乙醛、二丙基二硫醚、二乙基二硫醚和丙硫醇。不同的种子液降解底物的速率是不同的。菌株S-1降解各物质的先后顺序为丙硫醇、异丙醇、二乙基二硫醚、乙醛。该菌株为好氧型革兰氏染色阴性菌，在纯培养条件下，该菌株于在pH＝4.0～10.0、温度15℃～37℃、盐浓度0％～3％的条件下有一定的降解能力。但是，在高盐、高酸碱、高温或低温逆环境中，该菌株的降解能力显著下降，其适应程度有限：常规的培养不能用于有效处理含盐量大于3％的废水。耐盐菌处理高含盐废水具有无可比拟的优势，且成本低，会产生较为明显的经济效益和社会效益，可以为相关废水处理达标排放提供技术支撑。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷和不足，提供一种在高盐浓度、高pH、温度范围广泛条件下对酚类和硝基酚类物质具有高效降解能力的恶臭假单胞菌菌株，便于规模化应用和扩大生产，对于治理环境污染具有重要的经济价值和现实意义。

本发明的目的是提供一种在高盐浓度、高pH、温度范围广泛条件下对酚类和硝基酚类物质具有高效降解能力的恶臭假单胞菌菌株RL-JY1。

本发明的第二个目的是提供一种含有上述恶臭假单胞菌菌株RL-JY1的菌剂本发明的第三个目的是提供使用上述恶臭假单胞菌菌株RL-JY1或上述菌剂制备的生物清洁剂。

本发明的第四个目的是提供上述恶臭假单胞菌菌株RL-JY1、上述菌剂或上述生物清洁剂在降解酚类和/或硝基酚类物质中的应用。

本发明的第五个目的是提供上述恶臭假单胞菌菌株RL-JY1、上述菌剂或上述生物清洁剂在修复酚类和/或硝基酚类环境污染中的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明从广东省湛江市霞山区码头附近受石油污染的海水中分离到一株能够降解对硝基苯酚的细菌菌株。该菌株可将无机盐离子培养基中各100mg/L的对苯二酚、1,2,4-苯三酚、4-硝基儿茶酚和对硝基苯酚降解。

对菌株进行连续转接测定降解能力，表明该菌株降解能力稳定。菌落呈圆形，边缘光滑，表面突起，为乳白色；过氧化氢酶活性与脲酶反应均为阳性；菌株革兰氏染色、氧化酶活性和吲哚反应为阴性；菌株在GenBank中16S rDNA序列的注册号为MK101056。基于形态特征、生理生化特征及16S rDNA序列分析，将该菌株鉴定为恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)，命名为RL-JY1。

该恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)菌株RL-JY1，于2018年11月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所；保藏编号为GDMCC No：60494。

本发明还提供了一种包含权利要求1所述恶臭假单胞菌菌株RL-JY1的菌剂。

本发明还提供了一种使用权利要求1所述恶臭假单胞菌菌株RL-JY1或权利要求2所述菌剂制备的生物清洁剂。

本发明还提供了所述恶臭假单胞菌菌株RL-JY1、所述菌剂或所述生物清洁剂在降解酚类和/或硝基酚类物质中的应用。

本发明还提供了所述恶臭假单胞菌菌株RL-JY1、所述菌剂或所述生物清洁剂在修复酚类和/或硝基酚类环境污染中的应用。

本发明进一步提供所述恶臭假单胞菌菌株RL-JY1在制备酚类和/或硝基酚类物质的生物降解剂中的应用。

其中，所述酚类和硝基酚类物质包括对硝基苯酚、1,2,4-苯三酚、对苯二酚或4-4-硝基儿茶酚中的一种或多种。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述降解或修复在盐浓度为0％、或者盐浓度为3％～15％的高盐浓度条件下进行。例如，盐浓度可以为3％、6％、9％、12％、15％等。所述恶臭假单胞菌菌株RL-JY1在盐浓度分别为3％、6％、9％、12％、15％的高盐浓度条件下，对酚类和硝基酚类物质的降解率分别可达100％、100％、90％、75％、40％。说明本发明的恶臭假单胞菌菌株RL-JY1具有优异的高盐耐受性，可直接应用于工业废水的处理。

更进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述降解或修复在盐浓度为6％～12％的高盐浓度条件下进行。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述降解或修复在pH为4～11的条件下进行。例如，pH可以为5、6、7、8、9、10等。所述恶臭假单胞菌菌株RL-JY1在pH分别为5、6、7、8、9、10的条件下，对酚类和硝基酚类物质的降解率大概分别可达50％、90％、100％、100％、90％、80％、。本发明的恶臭假单胞菌菌株RL-JY1在pH为4～11的条件下对酚类和硝基酚类物质具有有效的降解能力，pH范围较宽。

更进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述降解或修复在pH为6～10的条件下进行。本发明的恶臭假单胞菌菌株RL-JY1在pH为6～10的条件下对酚类和硝基酚类物质的降解率在80％以上。

更进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述降解或修复在pH为6～9的条件下进行。本发明的恶臭假单胞菌菌株RL-JY1在pH为6～9的条件下对酚类和硝基酚类物质的降解率在90％以上。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述降解或修复在温度为10℃～50℃的条件下进行。例如，温度可以为10℃、20℃、30℃、40℃、50℃等。

更进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述降解或修复在温度为10℃～40℃的条件下进行。本发明的恶臭假单胞菌菌株RL-JY1在温度为10℃～40℃的条件下对酚类和硝基酚类物质的降解率在70％以上。

更进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述降解或修复在温度为20℃～40℃的条件下进行。本发明的恶臭假单胞菌菌株RL-JY1在温度为20℃～40℃的条件下对酚类和硝基酚类物质的降解率在80％以上。

更进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述降解或修复在温度为30℃～40℃的条件下进行。本发明的恶臭假单胞菌菌株RL-JY1在温度为30℃～40℃的条件下对酚类和硝基酚类物质的降解率可达100％。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述修复中所述恶臭假单胞菌菌株RL-JY1的接菌量为1×10⁶～5×10⁶CFU/L。

本发明的恶臭假单胞菌菌株RL-JY1能够在3天内100％降解无机盐培养基中含有的浓度为100mg/L的PNP，并能够降解对苯二酚、1,2,4-苯三酚和4-硝基儿茶酚。恶臭假单胞菌菌株RL-JY1对上述底物具有较高的浓度耐受，在浓度为800～1200mg/L时，3天内降解率均在70％以上。

另外，本发明的恶臭假单胞菌菌株RL-JY1对环境温度具有较宽范围的耐受能力，在10℃～40℃之间都能高效降解对硝基苯酚、对苯二酚、1,2,4-苯三酚和4-硝基儿茶酚，3天内对上述底物(各100mg/L)的降解率均大于70％；对环境盐离子浓度也具有较高的耐受能力，在NaCl浓度为0～12％时，可生长并降解上述底物，3天内对上述底物(各100mg/L)的降解率均大于75％；同时，对环境pH也具有较强的耐受能力，可耐受的pH范围为pH 6～9，3天内对上述底物(各100mg/L)的降解率均大于90％。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明提供的恶臭假单胞菌菌株RL-JY1及其菌剂在使用过程中无污染、无公害，能够应用于对硝基苯酚、对苯二酚、1,2,4-苯三酚和4-硝基儿茶酚污染的生物修复及具有较高盐浓度、不同pH生产废水的处理，可在较低和较高温度下进行生物修复，可广泛应用于环境水体清洁领域及工业废水的清洁处理，具有较好的经济价值和应用前景。

2、本发明提供的恶臭假单胞菌菌株RL-JY1及其菌剂在高盐、高酸碱、高温或低温逆环境中，能有效处理含盐量大于3％的工业废水，且成本低，能产生较为明显的经济效益和社会效益，可以为相关废水处理达标排放提供技术支撑。

附图说明

图1为本发明恶臭假单胞菌菌株RL-JY1在LB固体培养基上的菌落形态。

图2为本发明恶臭假单胞菌菌株RL-JY1的系统发育树。

图3为本发明HPLC法检测恶臭假单胞菌菌株RL-JY1对浓度分别为100mg/L的对硝基苯酚、对苯二酚，1,2,4-苯三酚和4-硝基儿茶酚的降解能力。

图4为本发明实施例中对硝基苯酚、对苯二酚、1,2,4-苯三酚和4-硝基儿茶酚浓度与280nm处吸收峰面积关系标准曲线图。

图5为本发明恶臭假单胞菌RL-JY1对不同浓度底物的降解率。

图6为本发明恶臭假单胞菌RL-JY1在不同温度条件下对各底物的降解率。

图7为本发明恶臭假单胞菌RL-JY1在不同pH条件下对各底物的降解率。

图8为本发明恶臭假单胞菌RL-JY1在不同盐浓度条件下对各底物的降解率。

具体实施方式

以下结合附图及具体实施例来进一步说明本发明。以下实施例为本发明较佳的实施方式，但并不对本发明的保护范围做任何形式的限定。本发明主要阐述所述菌株以及基于所述菌株的应用思想，实施方式中简单参数的替换不能一一在实施例中赘述，但并不因此限制本发明，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，应被视为等效的置换方式，都应包含在本发明范围内。

除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

本发明使用的无机盐培养基组成如下：1.0g/L(NH₄)₂SO₃，0.5g/L NaCl，1.0g/LNH₄NO₃，0.5g/L KH₂PO₄，0.01g/L CaCl₂，1.5g/L K₂HPO₄·12H₂O和0.005g/L酵母提取物，pH＝7.0±0.2。

营养培养基组成如下：10.0g/L蛋白胨，5.0g/L NaCl，10.0g/L酵母提取物，pH＝7.0±0.2。

平板固体培养基为相应的培养基中加入1.5％的琼脂。

实施例1恶臭假单胞菌RL-JY1的分离和鉴定

1、菌株的分离

(1)从广东省湛江市霞山区码头附近采集受石油污染的海水样品；在无菌操作条件下，将5mL海水样品接种到含100mg/LPNP的50mL无机盐离子培养基中，在30℃，180rpm条件下培养；每培养7天后，取5mL转接至新鲜无机盐培养基(50mL)中，连续转接3次。

(2)将驯化后的菌液划线到含有100mg/L PNP的无机盐培养基平板上，30℃培养箱中培养3天；挑取在平板上的单菌落转接到含浓度为100mg/L PNP的无机盐培中培养7天；重复3次，直至分离获得纯化的菌株。将该菌株命名为RL-JY1。

2、菌株RL-JY1的形态学特征

该菌株RL-JY1为革兰氏染色为阴性，在LB培养基上菌落为乳白色，湿软，圆形凸起，边缘规整，不透明，表面光滑(图1)。

3、菌株RL-JY1的生理生化特性

该菌株RL-JY1的过氧化氢酶活性与吲哚反应均为阳性；菌株革兰氏染色、氧化酶活性和脲酶反应为阴性。

4、16S rDNA鉴定

(1)将该菌株RL-JY1接种到LB培养基中，30℃、180rpm条件下过夜培养，取1mL菌液，离心收集菌体，用细菌基因组提取试剂盒提取基因组DNA，得到的基因DNA用0.8％琼脂糖凝胶电泳进行检测，-20℃保存备用。

(2)设计用于扩增16S rDNA序列的一对通用引物：27F5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和1492R 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。

(3)用菌株RL-JY1的基因组DNA作为模板，加入Premix Taq^TM，进行PCR扩增，PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测后，用DNA纯化回收试剂盒纯化，连接到pGM-19T载体上，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布到含有氨苄青霉素的LB固体培养基平板上，在37℃下培养12h，挑取白色菌落至液体LB培养基中，37℃、180rpm振荡培养过夜，用质粒提取试剂盒提取质粒，送英潍捷基(上海)贸易有限公司进行测序。将测序结果(GenBank：MK101056)进行Blast比对分析，并利用MEGA软件(版本：7.0)构建系统发育树(图2)。

综合菌体形态、生理生化特性、16S rDNA基因序列结果，将菌株RL-JY1鉴定为恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)菌株，并于2018年11月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所；保藏编号为GDMCC No：60494。

实施例2恶臭假单胞菌RL-JY1的降解性能试验

1、恶臭假单胞菌RL-JY1对对硝基苯酚、对苯二酚、1,2,4-苯三酚和4-硝基儿茶酚的降解

(1)方法：采用气相色谱法(HPLC)检测恶臭假单胞菌RL-JY1分别对无机盐培养基中对硝基苯酚、对苯二酚、1,2,4-苯三酚和4-硝基儿茶酚的降解作用，以及对PNP的浓度耐受。

1)将菌株RL-JY1接种到液体LB培养基中活化，培养到对数生长期OD₆₀₀＝0.8，按照体积比10％的接种量接种到分别含对硝基苯酚、对苯二酚，1,2,4-苯三酚和4-硝基儿茶酚各100mg/L底物的无机盐培养基中，作为处理组，以未接种菌株的含对硝基苯酚、对苯二酚、1,2,4-苯三酚和4-硝基儿茶酚各100mg/L底物的无机盐培养基作为对照组，对照组与处理组各设三个重复；将对照组与处理组在30℃，180rpm摇床振荡避光培养，培3天停止培养并测定每种物质的浓度。

2)向取得的样品4mL经10,000rpm离心3min，然后用0.22μm的有机系滤膜过滤，进行HPLC分析；

HPLC分析条件为：Agilent 1260高效液相色谱仪，色谱柱：Eclipse-C18(75mm×4.6mm×3.5μm)，流动相为甲醇:水＝90:10(v/v)，进样量10μL，流速3.0mL/min，使用VMD检测器进行检测，检测波长为280nm。

(2)结果

1)HPLC检测结果为：对硝基苯酚、对苯二酚、1,2,4-苯三酚和4-硝基儿茶酚的保留时间分别为2.962min、8.569min、10.436min和6.275min(图3)。

2)利用对硝基苯酚、对苯二酚，1,2,4-苯三酚和4-硝基儿茶酚的标准品绘制浓度与280nm处吸收峰面积之间的标准曲线，如图4所示。

3)降解率的计算：根据不同底物的标准曲线计算每种底物每天在无机盐培养基中的残留浓度，再根据降解率计算公式得到菌株RL-JY1对底物的降解率(表1)。

降解率％＝(对照组中底物的终浓度-处理组中底物的终浓度)/对照组中底物的终浓度×100％

自然降解率％＝(底物初始浓度-对照组中底物浓度)/底物初始浓度×100％

表1菌株RL-JY1对各种底物的降解率与底物的自然降解率

2、恶臭假单胞菌RL-JY1对不同浓度对硝基苯酚、对苯二酚、1,2,4-苯三酚和4-硝基儿茶酚的耐受分析

(1)方法

1)分别以对硝基苯酚、对苯二酚，1,2,4-苯三酚和4-硝基儿茶酚作为唯一碳源加入无机盐离子培养基中，设置500mg/L、700mg/L、900mg/L、1200mg/L、1500mg/L和2000mg/L共6个浓度，随后将菌株RL-JY1接种到液体LB培养基中活化，培养到对数生长期OD₆₀₀＝0.8，按照体积比10％的接种量接种到上述培养基中作为处理组，30℃，180rpm摇床振荡避光培养；

2)以含相应浓度底物的无机盐离子培养基不接菌作为对照组；培养3天后，测定各处理底物的浓度。

(2)结果

从图5可以看出，经过3天培养后，底物浓度500～700mg/L时被100％降解，随着底物浓度升高降解率逐渐降低。

3、恶臭假单胞菌RL-JY1对温度的耐受能力

(1)方法

1)将菌株RL-JY1接种到液体LB培养基中活化，培养到对数生长期OD₆₀₀＝0.8，按照体积比10％的接种量接种无机盐离子培养基中，分别以对硝基苯酚、对苯二酚、1,2,4-苯三酚和4-硝基儿茶酚作为唯一碳源加入无机盐离子培养基中(浓度各自为100mg/L)，分别在10℃、20℃、30℃、40℃、50℃条件下，180rpm摇床振荡避光培养；

2)以未接种菌株的并分别加入对硝基苯酚、对苯二酚、1,2,4-苯三酚和4-硝基儿茶酚至浓度为100mg/L的相同无机盐离子培养基作为对照组，同样在10℃、20℃、30℃、40℃、50℃下，180rpm摇床振荡避光培养；培养3天后测定PNP浓度。

(2)结果

结果如图6所示，恶臭假单胞菌RL-JY1降解底物的最适温度是30～40℃，对酚类和硝基酚类物质的降解率可达100％。

在10℃～50℃对硝基苯酚、对苯二酚、1,2,4-苯三酚和4-硝基儿茶酚均有一定的降解能力。具体地：在较高的温度下(50℃)，对各底物的降解效率大约为40％，低于50％；在10～40℃条件下，对各底物的降解效率均大于70％；在温度为20℃～40℃的条件下对酚类和硝基酚类物质的降解率在80％以上。

4、恶臭假单胞菌RL-JY1对pH耐受能力

(1)方法

1)分别配制不同pH＝4～12的无机盐离子培养基，灭菌备用；向配制的无机盐离子培养基中同时加入PNP至底物浓度100mg/L；将菌株RL-JY1接种到液体LB培养基中活化，培养到对数生长期OD₆₀₀＝0.8，按照体积比10％的接种量接种到上述培养基中，分别以对硝基苯酚、对苯二酚、1,2,4-苯三酚和4-硝基儿茶酚作为唯一碳源加入无机盐离子培养基中(浓度各自为100mg/L)，作为处理组，30℃，180rpm摇床振荡避光培养；

2)以未接种菌株不同pH的同时分别加入对硝基苯酚、对苯二酚、1,2,4-苯三酚和4-硝基儿茶酚至浓度为100mg/L的相同无机盐离子培养基作为对照组，同样于30℃，180rpm摇床振荡避光培养；培养3天后测定PNP浓度。

(2)结果

结果如图7所示，pH影响恶臭假单胞菌RL-JY1对底物的降解能力。当pH值从4增加到7，底物的降解率也逐渐由25％增加到100％。在pH值为7～11时，RL-JY1对底物的降解效率由100％逐渐降低至29％，当pH为12时，底物基本无降解。本发明的恶臭假单胞菌菌株RL-JY1在pH为6～10的条件下对酚类和硝基酚类物质的降解率在80％以上；在pH为6～9的条件下对酚类和硝基酚类物质的降解率在90％以上。

5、恶臭假单胞菌RL-JY1对盐浓度耐受能力

(1)方法

1)分别配制不同盐浓度(NaCl浓度)(0～150g/L，间隔30g/L)的无机盐离子培养基，灭菌备用；向配制的无机盐离子培养基中分别以对硝基苯酚、对苯二酚，1,2,4-苯三酚和4-硝基儿茶酚作为唯一碳源至浓度各自为100mg/L；将菌株RL-JY1接种到液体LB培养基中活化，培养到对数生长期OD₆₀₀＝0.8，按照体积比10％的接种量接种到上述培养基中作为处理组，于30℃，180rpm摇床振荡避光培养；

2)以未接种菌株的不同NaCl浓度分别加入对硝基苯酚、对苯二酚、1,2,4-苯三酚和4-硝基儿茶酚至浓度为100mg/L的相同无机盐培养基作为对照组，同样于30℃，180rpm摇床振荡避光培养；培养3天后测定PNP浓度。

(2)结果

结果如图8所示，恶臭假单胞菌菌株RL-JY1在盐浓度分别为3％、6％、9％、12％、15％的高盐浓度条件下，对酚类和硝基酚类物质的降解率分别可达100％、100％、90％、75％、40％。恶臭假单胞菌RL-JY1能够在NaCl浓度0～12％条件下对PNP降解率均在60％以上，当NaCl浓度大于12％(NaCl浓度＝15％)，降解率显著下降，低于50％。在盐浓度为6％～12％的高盐浓度条件下，降解率均在75％以上，最高可达100％，说明本发明的恶臭假单胞菌菌株RL-JY1具有优异的高盐耐受性，可直接应用于工业废水的处理。

实施例3恶臭假单胞菌RL-JY1在污染海水的生物修复中的应用

1、方法

本实施例中使用的海水取自广东省湛江市霞山区渔港公园附近。

(1)将恶臭假单胞菌RL-JY1在LB液体培养基中培养至对数期(OD₆₀₀＝0.8，菌体浓度约为2×10⁸CFU/mL)，向海水中加入制备的菌液至终浓度分别为1×10⁴、5×10⁴、1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶和5×10⁶CFU/L海水(每个处理为100mL海水)，并向海水样品中分别加入对硝基苯酚、对苯二酚，1,2,4-苯三酚和4-硝基儿茶酚至各浓度分别为100mg/L，作为处理组；

(2)相同条件下，加入相同浓度污染物且不接菌的海水作为对照组，将最终获得的培养体系(处理组与对照组)充分混匀；

(3)将样品在恒温恒湿培养箱中，于30℃条件下，160rpm培养，12小时光照12小时黑暗交替，在培养的第10日取样测定各种底物的浓度；对照组与处理组中每个处理均设3个重复。

(4)取样方法：每个处理组分别取4mL水样，10,000rpm离心5min，将上清液经0.22μm的有机相滤膜进行过滤，此样品用于对硝基苯酚、对苯二酚、1,2,4-苯三酚和4-硝基儿茶酚浓度检测。根据最终测定处理组与对照组中底物的浓度计算恶臭假单胞菌RL-JY1在水样中对底物的降解率。

2、结果

恶臭假单胞菌RL-JY1对污染海水样品中底物的降解率如表2所示。随着加入菌体量的增加各种底物的降解率逐渐提高，当接菌量达到1×10⁶CFU/L水样时，各底物的降解率基本达到最大值。

表2恶臭假单胞菌RL-JY1对污染海水样品中底物的降解率

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种恶臭假单胞菌菌株，其特征在于，该菌株为恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）菌株RL-JY1，于2018年11月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：60494。

2.一种包含权利要求1所述恶臭假单胞菌菌株RL-JY1的菌剂。

3.使用权利要求1所述恶臭假单胞菌菌株RL-JY1或权利要求2所述菌剂制备的生物清洁剂。

4.权利要求1所述恶臭假单胞菌菌株RL-JY1、权利要求2所述菌剂或权利要求3所述生物清洁剂在降解酚类和/或硝基酚类物质中的应用。

5.权利要求1所述恶臭假单胞菌菌株RL-JY1、权利要求2所述菌剂或权利要求3所述生物清洁剂在修复酚类和/或硝基酚类环境污染中的应用。

6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述酚类和硝基酚类物质包括对硝基苯酚、1,2,4-苯三酚、对苯二酚或4-4-硝基儿茶酚中的一种或多种。

7.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，在盐浓度为0%、或者盐浓度为3%～15%的高盐浓度条件下进行。

8.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，在pH为4～11的条件下进行。

9.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，在温度为10℃～50℃的条件下进行。

10.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述恶臭假单胞菌菌株RL-JY1的接菌量为1×10⁶～5×10⁶ CFU/L。