CN104946556A - 一种节杆菌属细菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种节杆菌属细菌及其应用。该菌为YC-RL1，保藏编号为CGMCC No.10611，其能够在4天内将无机盐中萘、芴、联苯、1,2,3,4-四氯苯和对硝基苯酚各100mg/L的混合物同时100％降解。该菌对于盐离子浓度具有较宽的耐受范围，能在NaCl浓度为0～60g/L的无机盐离子培养基中的上述5种化合物的各100mg/L的混合物在5天内同时100％降解。YC-RL1能够应用于萘、芴、联苯、1,2,3,4-四氯苯和对硝基苯酚污染环境及多种污染物共同污染环境的生物修复，同时对于上述污染物的高盐工业生产废水处理具有良好的应用潜质，具有较好的经济价值和应用前景。

Description

一种节杆菌属细菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物及生物降解领域，具体地，涉及一种节杆菌(Arthrobacter sp.)YC-RL1及其应用。
背景技术
工业和农业的迅速发展，导致了多种多样的污染物进入环境中。常见的有机污染物包括多环芳烃，如萘、芴、菲、蒽等；苯及苯酚类，如甲苯、对二甲苯、联苯、苯酚、对硝基苯酚等；卤代物，如六氯丙烷、三氯吡啶酚、1,2,3,4-四氯苯等。环境中污染物的多样性大大增加了污染环境修复的难度。因此，如何实现同时对多种污染物高效的降解，成为人们亟待解决的问题。
萘(naphthalene)和芴(fluorene)是较为常见的两种多环芳烃(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons,PAHs)，均被美国环保署列入优先控制的16种PAHs污染物，在环境中普遍存在。联苯(biphenyl)作为重要的工业原料，被广泛的应用于医药、农药、染料、液晶材料等领域，同时也广泛的存在于环境中，其对人体健康及环境的危害受到广泛的关注。1,2,3,4-四氯苯作为卤代芳香族化合物，由于其自身特性，不仅对人体健康与生态环境存在潜在威胁，而且在环境中很难被降解。对硝基苯酚(p-nitrophenol,PNP)作为一种重要的单硝基芳香族化合物，被大量应用于染料、医药、农药及木材防腐剂的生产。对硝基苯酚在深层土壤和地下水中的残留时间很长且易在生物体内富集，因而对人体健康、动物和植物及微生物的生长产生巨大威胁。早在1988年美国环保署已将对硝基苯酚列为优先控制污染物之一，规定其在自然水体中的浓度应低于10ng/L。
节杆菌属细菌(Arthrobacter sp.)是土壤中最为常见的细菌之一，是一种普遍存在的具有较高遗传适应性的细菌，它广泛存在于环境中，该种菌具有用于生物修复的潜力。污染物的生物降解已有大量的研究报道，然而，能够同时降解多种类型污染物且能够耐受较高盐浓度的降解菌报道相对较少。
近几十年来，人们对污染物的生物降解进行了相当详细的研究，并取得了许多成果。然而，微生物在工业废水中污染物的生物降解研究相对较少，主要是工业废水恶劣的条件所制约，如高盐度、极端pH、溶氧量低等。因此，若能提供一种在高盐浓度下依然保持对多种类型污染物的降解能力的菌株对于治理环境污染具有重要的经济价值和现实意义。
发明内容
本发明的目的在于弥补现有技术中的缺陷，提供一种降解底物谱广的节杆菌属细菌及其在萘、芴、联苯、1,2,3,4-四氯苯和对硝基苯酚降解中的应用。
本发明的菌株YC-RL1是从山东华阳农药厂污水处理池的活性污泥中分离到一株能够降解萘、芴、联苯、1,2,3,4-四氯苯和对硝基苯酚的细菌。该菌可在4天内将无机盐离子培养基中各100mg/L的萘、芴、联苯、1,2,3,4-四氯苯和对硝基苯酚的混合物100％降解，对菌株进行连续转接测定降解能力，降解能力稳定。在电镜下(图1)，该菌为短杆状，有鞭毛，无芽孢。菌落呈圆形，边缘光滑，表面突起，产生黄色素(图2)。菌株革兰氏染色、过氧化氢酶活性及脲酶反应均为阳性；氧化酶活性和吲哚反应为阴性。基于形态特征、生理生化特征，将该菌株鉴定为节杆菌属细菌Arthrobacter sp.，命名为YC-RL1。该菌株于2015年3月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.10611，分类名为节杆菌Arthrobacter sp.。
本发明提供了含有节杆菌YC-RL1的菌剂。
本发明提供了含有节杆菌YC-RL1的生物清洁剂。
本发明提供了节杆菌YC-RL1或含有其的菌剂或含有其的生物清洁剂在清洁环境中的应用。
进一步，本发明提供了节杆菌YC-RL1或含有其的菌剂或含有其的生物清洁剂在降解污染物中的应用。
所述的污染物为萘、芴、联苯、1,2,3,4-四氯苯或对硝基苯酚。
本发明提供了节杆菌YC-RL1在制备生物清洁剂中的应用。
本发明提供了节杆菌YC-RL1在制备生物降解剂中的应用。
本发明发现，节杆菌YC-RL1能够在4天内100％降解无机盐培养基中含有的浓度分别为100mg/L萘、芴、联苯、1,2,3,4-四氯苯和对硝基苯酚的混合物。节杆菌YC-RL1对萘、芴、联苯、1,2,3,4-四氯苯和对硝基苯酚具有较高的浓度耐受，可分别将300mg/L的萘、300mg/L的芴，400mg/L的联苯，500mg/L的1,2,3,4-四氯苯，500mg/L的对硝基苯酚在4天内100％降解。
另外，本发明的节杆菌YC-RL1可耐受较高的盐浓度。在NaCl浓度为0～60g/L时，可将无机盐离子培养基中各100mg/L的萘、芴、联苯、1,2,3,4-四氯苯和对硝基苯酚在5天内100％降解；当NaCl浓度为70g/L时，底物降解率在33～69％；当NaCl浓度为80g/L时，底物降解率在7～21％；当NaCl浓度大于80g/L时，底物降解被完全抑制。
本发明提供的节杆菌YC-RL1及其菌剂在使用过程中无污染，无公害，能够应用于萘、芴、联苯、1,2,3,4-四氯苯和对硝基苯酚污染环境的生物修复及具有较高盐浓度萘、芴、联苯、1,2,3,4-四氯苯和对硝基苯酚生产废水的处理，可广泛应用于环境土壤清洁领域及工业废水的清洁处理，具有较好的经济价值和应用前景。
附图说明
图1为节杆菌YC-RL1在电镜下的形态结构图。
图2为节杆菌YC-RL1在LB固体培养基上的菌落形态。
图3为HPLC法检测含100mg/L对硝基苯酚的色谱图。
图4为HPLC法检测各含100mg/L萘、芴、联苯和1,2,3,4-四氯苯的混合物的色谱图。
图5为萘、芴、联苯和1,2,3,4-四氯苯浓度与300nm处吸收峰面积，对硝基苯酚浓度与320nm处吸收峰面积关系标准曲线图。
图6为节杆菌YC-RL1在不同浓度底物条件下，对各个底物的降解率。
图7为节杆菌YC-RL1在不同盐浓度下对各种底物的降解率。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
本申请使用的无机盐培养基具有以下组成：1.0g/L NH4NO3,0.5g/L NaCl,0.5g/L(NH4)2SO4,0.5g/L KH2PO4,1.5g/L K2HPO4和0.005g/L酵母提取物，pH＝7.0±0.2。
斜面培养基：10.0g/L蛋白胨，5.0g/L NaCl，10.0g/L酵母提取物，pH＝7.0±0.2。
平板培养基为相应的培养基中加入1.5％的琼脂。
实施例1节杆菌YC-RL1的分离和鉴定
1、菌株的分离
活性污泥样品采集于山东华阳农药厂的排污口(山东省泰安市)。在无菌操作条件下，将5g活性污泥样品接种到用100mL含50mg/L芴的无机盐离子培养基中，在30℃，180rpm条件下培养。每培养7天后，取培养体积的10％转接至新鲜无机盐培养基中，且每次将芴的浓度提高100mg/L，连续转接5次，直至无机盐培养基中芴浓度提高到300mg/L。
用无菌水将驯化后的菌液梯度稀释10-5、10-6、10-7后分别涂布到含有100mg/L芴的无机盐培养基平板上，30℃培养箱中培养7天。挑取在平板上的单菌落进行划线后培养，重复三次，直至分离获得纯化的菌株。在含浓度为100mg/L芴的无机盐培养基平板上生长好、传代稳定且降解能力较好的菌株进行斜面保存。菌株命名为YC-RL1。
2、菌株的形态学特征
该菌为革兰氏染色为阳性短杆菌，菌体直或微弯、侧生鞭毛，无芽孢(见图1)；在LB培养基上菌落为黄色，湿软，圆形凸起，边缘规整，不透明，表面光滑(见图2)。
3、菌株生理生化特性
菌株革兰氏染色、过氧化氢酶活性及脲酶反应均为阳性；氧化酶活性和吲哚反应为阴性。
4、16S rDNA鉴定
将菌株YC-RL1接种到LB培养基中，30℃、180rpm条件下过夜培养，取1mL菌液，离心收集菌体，用细菌基因组提取试剂盒提取基因组DNA，得到的基因DNA用0.8％琼脂糖凝胶电泳进行检测，-20℃保存备用。
设计用于扩增16s rDNA序列的一对通用引物：27F5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和1492R5'-GGTTACCTTGTTACG ACTT-3'，用基因组DNA作为模板，加入Premix TaqTM，进行PCR扩增，PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测后，用DNA纯化回收试剂盒纯化，连接到pGM-T载体上，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布到含有氨苄青霉素的LB固体培养基平板上，在37℃下培养12h，挑取白色菌落至液体LB培养基中，37℃、180rpm振荡培养过夜，用质粒提取试剂盒提取质粒，送上海生工生物公司进行测序。将该序列在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上进行Blast比对分析，并利用MEGA6.0软件构建系统发育树可知，菌株YC-RL1为节杆菌，与目前已发表的节杆菌序列具有较高相似性。
综合菌体形态、生理生化特性和16S rDNA基因序列，菌株YC-RL1被鉴定为节杆菌(Arthrobacter sp.)。该菌株YC-RL1于2015年03月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCCNo.10611，分类名为节杆菌Arthrobacter sp.。
实施例2节杆菌YC-RL1的降解性能试验
1、节杆菌YC-RL1对萘、芴、联苯、1,2,3,4-四氯苯和对硝基苯酚的降解
高效液相色谱法检测节杆菌YC-RL1对无机盐培养基中萘、芴、联苯、1,2,3,4-四氯苯和对硝基苯酚的同时降解作用，及对萘、芴、联苯、1,2,3,4-四氯苯和对硝基苯酚的浓度耐受。
将菌株YC-RL1接种到液体LB培养基中活化，培养到对数生长期OD600＝0.8，按照体积比10％的接种量接种到同时含萘、芴、联苯、1,2,3,4-四氯苯和对硝基苯酚各100mg/L混合物的无机盐培养基中，作为处理组，以未接种菌株的含萘、芴、联苯、1,2,3,4-四氯苯和对硝基苯酚各100mg/L混合物的无机盐培养基作为对照组，对照组与处理组各设三个重复。将对照组与处理组在30℃条件下，180rpm摇床振荡避光培养，在培养的第四天停止培养并测定每种物质的浓度。。
将取得的样品，首先取2mL样品用0.22μm的有机系滤膜过滤,用于对硝基苯酚浓度检测；剩余样品中加入等体积正己烷，超声波充分振荡抽提10min，静置1小时，取上层有机溶剂，将有机溶剂挥发干后，用等体积的甲醇重溶，然后用0.22μm的有机系滤膜过滤，进行HPLC分析。
HPLC分析条件为：Agilent 1200高效液相色谱仪，色谱柱：Eclipse-C18(150×4.6mm×5μm)，流动相1(用于对硝基苯酚检测)为甲醇:乙腈:水＝42:78:10(v/v)，流动相2(用于萘、芴、联苯和1,2,3,4-四氯苯的检测)为甲醇:水＝80:20(v/v)，进样量2μL，流速1.0mL/min，使用DAD检测器进行检测。对硝基苯酚的检测波长为320nm，保留时间为1.59min(图3)；萘、芴、联苯和1,2,3,4-四氯苯的检测波长为300nm，萘的保留时间5.82min，芴的保留时间6.33min，联苯的保留时间6.83min，1,2,3,4-四氯苯的保留时间4.304min(图4)。利用萘、芴、联苯和1,2,3,4-四氯苯的标准品绘制浓度与300nm处吸收峰面积之间的标准曲线，对硝基苯酚标准品绘制浓度与320nm处吸收峰面积之间的标准曲线(图5)
降解率的计算：根据不同底物的标准曲线计算每种底物在无机盐培养基中每天的残留浓度，再根据降解率计算公式得到菌株YC-RL1对底物的降解率。
降解率％＝(对照组中底物的终浓度-处理组中底物的终浓度)/对照组中底物的终浓度×100％
自然降解率％＝(底物初始浓度-对照组中底物浓度)/底物初始浓度×100％
表1各菌株YC-RL1对种底物的降解率与底物的自然降解率
2、节杆菌YC-RL1对萘、芴、联苯、1,2,3,4-四氯苯和对硝基苯酚的耐受
分别以独立的萘、芴、联苯、1,2,3,4-四氯苯和对硝基苯酚为唯一碳源加入无机盐离子培养基中，且各自独立的设置100～800mg/L的梯度浓度，随后将菌株YC-RL1接种到液体LB培养基中活化，培养到对数生长期OD600＝0.8，按照体积比10％的接种量接种到上述培养基中，作为处理组，30℃，180rpm摇床振荡避光培养。同时，以含相应浓度底物的无机盐离子培养基不接菌作为对照组。在培养4天后，分别测定各种底物浓度。
从图6可以看出，经过4天培养后，萘和芴浓度≤300mg/L时被100％降解，随着浓度升高降解率逐渐降低，达到600mg/L时降解率为0；联苯浓度≤400mg/L时被100％，随着浓度升高降解率逐渐降低，达到700mg/L时降解率为0；1,2,3,4-四氯苯和对硝基苯酚浓度≤500mg/L时被100％，随着浓度升高降解率逐渐降低，达到800mg/L时降解率为0。3、节杆菌YC-RL1对盐浓度耐受能力
分别配制不同NaCl浓度(0～100g/L)的无机盐离子培养基，灭菌备用。向配制的无机盐离子培养基中同时加入萘、芴、联苯、1,2,3,4-四氯苯和对硝基苯酚至每种底物浓度100mg/L。将菌株YC-RL1接种到液体LB培养基中活化，培养到对数生长期OD600＝0.8，按照体积比10％的接种量接种到上述培养基中，作为处理组，30℃，180rpm摇床振荡避光培养。
以未接种菌株的同时加入萘、芴、联苯、1,2,3,4-四氯苯和对硝基苯酚各100mg/L的相同培养基作为对照组，同样在30℃下，180rpm摇床振荡避光培养。培养5天后分别测定每种底物浓度。
结果显示，当NaCl浓度在0～60g/L时，对菌株YC-RL1降解底物无明显影响，萘、芴、联苯、1,2,3,4-四氯苯和对硝基苯酚各100mg/L的混合物在5天内所有底物100％降解；当NaCl浓度为70g/L时，底物降解率在33～69％；当NaCl浓度为80g/L时，底物降解率在7～21％；当NaCl浓度大于80g/L时，底物降解被完全抑制。由此说明，菌株YC-RL1具有较好的耐盐能力，能在较高盐浓度(≤60g/L)条件下高效降解萘、芴、联苯、1,2,3,4-四氯苯和对硝基苯酚。NaCl浓度对菌株YC-RL1降解底物的影响如图7所示。
实施例3节杆菌YC-RL1在土壤修复中的应用
本研究中所用的土壤取自中国农业科学院西门花园土壤。将节杆菌YC-RL1在LB液体培养基中培养至对数期(OD600＝0.8,菌体浓度约为2×108CFU/mL)，向土壤中加入制备的菌液至终浓度分别为1×104、5×104、1×105、5×105、1×106和5×106CFU/g土壤(每个处理为100g土壤)，并向土壤中分别加入萘、芴、联苯、1,2,3,4-四氯苯和对硝基苯酚至各自浓度为100mg/kg，作为处理组；同时，以相同条件下加入相同浓度污染物且不接菌的土壤作为对照组，将最终获得的培养体系(处理组与对照组)充分混匀。将样品在恒温恒湿培养箱中，于30℃条件下，湿度维持20％进行培养，在培养的第7日取样测定各种底物的浓度。对照组与处理组中每个处理均设3个重复。
取样方法：每个处理组分别取10g土壤，加入20mL正己烷，在摇床中剧烈震荡1小时，4℃静置过夜，取2mL过无水Na2SO4柱子收集流出正己烷溶液，以氮气吹扫使正己烷完全挥发，加入甲醇使溶质复溶并经0.22μm的有机相滤膜进行过滤，此样品用于萘、芴、联苯和1,2,3,4-四氯苯浓度检测；另取10g土壤，加入20mL灭菌纯水，在摇床中剧烈震荡1小时，4℃静置过夜，以0.22μm的滤膜进行过滤，此样品用对硝基苯酚浓度检测。根据最终测定处理组与对照组中底物的浓度计算节杆菌YC-RL1在土壤中对底物的降解率。
表2节杆菌YC-RL1在土壤中对底物的降解率
节杆菌YC-RL1在土壤中对底物的降解率如表2所示，随着加入菌体量的增加各种底物的降解率逐渐提高，当接菌量达到1×106CFU/g土壤时，各底物的降解率均达到最大值。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种节杆菌属细菌(Arthrobacter sp.)YC-RL1，其保藏编号为CGMCC No.10611。
2.含有权利要求1所述节杆菌属细菌YC-RL1的菌剂。
3.含有权利要求1所述节杆菌属细菌YC-RL1的生物清洁剂。
4.权利要求1所述的节杆菌属细菌YC-RL1或权利要求2所述的菌剂或权利要求3所述的生物清洁剂在清洁环境中的应用。
5.权利要求1所述的节杆菌属细菌YC-RL1或权利要求2所述的菌剂或权利要求3所述的生物清洁剂在净化土壤或工业废水中的应用。
6.权利要求1所述的节杆菌属细菌YC-RL1或权利要求2所述的菌剂或权利要求3所述的生物清洁剂在降解污染物中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的污染物为萘、芴、联苯、1,2,3,4-四氯苯或对硝基苯酚。
8.权利要求1所述的节杆菌属细菌YC-RL1在制备生物清洁剂中的应用。
9.权利要求1所述的节杆菌属细菌YC-RL1在制备生物降解剂中的应用。
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