CN110283755B

CN110283755B - 一株土地戈登氏菌rl-jc02及其在降解有机污染物方面的应用

Info

Publication number: CN110283755B
Application number: CN201910646810.7A
Authority: CN
Inventors: 任磊; 刘斌; 陈进军; 蔺中; 胡汉桥
Original assignee: Guangdong Ocean University
Current assignee: Guangdong Ocean University
Priority date: 2019-07-17
Filing date: 2019-07-17
Publication date: 2021-01-22
Anticipated expiration: 2039-07-17
Also published as: CN110283755A

Abstract

本发明公开了一株土地戈登氏菌RL‑JC02及其在降解有机污染物方面的应用。本发明首次分离得到了一株能够降解多种邻苯二甲酸酯类、多环芳烃类物质的菌株，该菌株已于2019年6月4日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCC NO：60681。该菌株能够在3天内将无机盐离子培养基中的多环芳烃类物质或邻苯二甲酸酯类物质彻底降解，降解能力稳定；在7天内对污染土壤中的多环芳烃类物质或邻苯二甲酸酯类物质的降解率可高达99.6％。可应用于多环芳烃类物质或邻苯二甲酸酯类物质导致的环境污染的生物修复，是理想的土壤环境污染修复微生物，在控制多环芳烃类物质或邻苯二甲酸酯类物质对环境的污染和生物修复方面具有很好的推广应用前景。

Description

一株土地戈登氏菌RL-JC02及其在降解有机污染物方面的应用

技术领域

本发明属于环境污染物生物处理技术领域。更具体地，涉及一株土地戈登氏菌RL-JC02及其在降解有机污染物方面的应用。

背景技术

随着农业生产的快速发展，农业对农资产品的需求量逐年提升，主要包括常用的农药、化肥和地膜等。其中，农用地膜的大量使用导致的环境污染引起了广泛的关注，一方面是由于地膜自身多聚物难以被降解，另一方面是由于地膜中含有的有毒有害物质，如塑化剂。其中，使用量最大的塑化剂，也是最典型的塑化剂是邻苯二甲酸酯类(PhthalateAcid Esters，简称PAEs)塑化剂；同时，邻苯二甲酸酯类塑化剂对生态环境和人体健康的影响也得到了广泛的关注与研究，研究发现它具有致癌致畸致突变和生殖发育毒性等多种毒性，并且可通过多种途径进入环境。由于农业用地膜的大量使用，使得邻苯二甲酸酯类塑化剂在农田生态系统乃至土壤环境中普遍被检测到，对环境造成了不同程度的污染。塑料产品与我们的日常生活密切相关，塑化剂则可以通过呼吸、饮食、饮水和皮肤接触进入人体，对人体的健康产生不同程度的危害。常见的邻苯二甲酸酯类塑化剂有邻苯二甲酸二(2-乙基已基)酯(DEHP)、邻苯二甲酸二环己酯(DCHP)、邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二正丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二正辛酯(DOP)和邻苯二甲酸丁基苄酯(BBP)。最近研究指出PAEs具有环境激素的作用，它能干扰生物和人类的内分泌系统，引起精子数量减少、精子形成中止、生殖能力下降、后代数量减少、子宫粘膜组织增生等。DEHP是邻苯二甲酸酯类塑化剂中使用范围最广、使用量最大的一类，被广泛用于食品包装材料、容器、医疗器械以及儿童玩具等领域，也是目前世界范围类广泛检出的有机污染物之一。DEHP为无色透明油状液体，具有较高的流动性、低水溶性以及低挥发性，其自然降解缓慢，且具有较强的生殖毒性、发育毒性、神经毒性、致多器官癌变等毒性。

另外，多环芳烃化合物(polycyclicaromatichydrocarbons，简称PAHs)是指两个以上苯环以稠环形式相连的化合物，是有机化合物不完全燃烧和地球化学过程中产生的一类致癌物质，广泛分布自然环境中，这些化合物具有毒性、致突变性、潜在致癌性等特点，且在被自然环境条件下难降解，由此可以看出，PAHs对人体健康及生态环境安全具有较大的威胁。其中，萘和菲是多环芳烃类化合物的典型代表，萘和菲都具有较低的水溶性和较高的固液分配系数，这使得它们能够抵抗微生物的利用且促进其在土壤中浓度的增加。

PAEs和PAHs在自然界中的降解方式主要包括非生物降解和生物降解，非生物降解包括光解和水解，生物降解主要是微生物降解，一般情况下非生物降解速率远低于生物降解，因此，微生物降解是PAEs和PAHs在环境中的主要降解途径。筛选高效的PAEs和PAHs降解菌株是目前国内外科学家研究PAEs和PAHs环境降解、探索PAEs和PAHs环境污染修复的重要途径。

戈登氏菌属细菌是一类广泛分布于自然环境中的微生物菌属，种类繁多，在自然生态系统分布广泛，如土壤、水、河口泥沙等，在人类活动系统中，包括产油水井、污水污泥以及临床病例中都有存在。目前，已分离出的戈登氏菌属细菌得到了广泛的应用，为社会发展带来了巨大的经济效益。例如，现有专利CN 105199981 A食碱戈登氏菌YC-RL2及其应用，公开了食碱戈登氏菌YC-RL2在降解邻苯二甲酸酯类物质中的应用，该菌株能够在5天内将无机盐培养基中的邻苯二甲酸酯类物质彻底降解，且在接菌量达到5×10⁵CFU/g土壤、培养10天时，对土壤中的邻苯二甲酸酯类物质的降解率达到最大值。然而，目前分离获得的大多数微生物菌株仅可降解一种或一种类型的环境污染物，这与环境污染的实际情况存在一定差距；另外，现有菌株对环境污染物降解时，存在菌的使用量大、降解所需时间长、降解率低等问题。

因此，分离可同时降解多种类型环境污染物、具有高效PAEs和PAHs降解能力和良好环境适应性的菌株，对于控制PAEs和PAHs对环境的污染和生物修复具有重要的经济价值和现实意义。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一株土地戈登氏菌(Gordonia terrae)RL-JC02。

本发明的第二个目的是提供土地戈登氏菌在制备有机污染物降解制剂方面的应用。

本发明的第三个目的是提供土地戈登氏菌在构建有机污染物降解工程菌方面的应用。

本发明的第四个目的是提供所述土地戈登氏菌、所述降解制剂或所述降解工程菌在降解有机污染物中的应用。

本发明的第五个目的是提供所述土地戈登氏菌、所述降解制剂或所述降解工程菌在制备有机污染物生物降解剂中的应用。

本发明的第六个目的是提供所述土地戈登氏菌、所述降解制剂或所述降解工程菌在修复有机污染物污染的介质中的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明经过长期的筛选和分离，研究发现，土地戈登氏菌具有显著的降解多种邻苯二甲酸酯类、多环芳烃类物质的作用，从广东省湛江市麻章区广东海洋大学附近农田土壤中成功分离到的土地戈登氏菌(Gordonia terrae)RL-JC02降解效果非常显著，该菌株已于2019年6月4日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCC NO：60681，保藏地址是广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

本发明提供的土地戈登氏菌(Gordonia terrae)RL-JC02是首次分离出的一种新的菌株，其实际应用将对环境污染的生物修复提供重要的技术与资源支撑。

所述土地戈登氏菌RL-JC02能够在3天内将无机盐离子培养基中的邻苯二甲酸二(2-乙基已基)酯、邻苯二甲酸二环己酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二甲酯、萘和菲彻底降解，降解能力稳定；且该菌株在7天内对污染土壤中的邻苯二甲酸二(2-乙基已基)酯、邻苯二甲酸二环己酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二甲酯、萘和菲的降解率均大于95％，对有机污染物污染的土壤具有很好的修复效果，是理想的土壤环境污染修复微生物，具有十分广泛的应用前景。

因此，以下均应在本发明的保护范围之内：

土地戈登氏菌在制备有机污染物降解制剂方面的应用。

土地戈登氏菌在构建有机污染物降解工程菌方面的应用。

土地戈登氏菌、所述降解制剂或所述降解工程菌在降解有机污染物中的应用。

土地戈登氏菌、所述降解制剂或所述降解工程菌在制备有机污染物生物降解剂中的应用。

土地戈登氏菌、所述降解制剂或所述降解工程菌在修复有机污染物污染的介质中的应用。

优选地，所述介质为土壤、水或空气。

优选地，所述土地戈登氏菌为所述土地戈登氏菌RL-JC02。

优选地，所述有机污染物为多环芳烃类物质或邻苯二甲酸酯类物质。

更优选地，所述多环芳烃类物质为萘或菲。

更优选地，所述邻苯二甲酸酯类物质为邻苯二甲酸二(2-乙基已基)酯、邻苯二甲酸二环己酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯或邻苯二甲酸二甲酯中的任意一种或几种。

另外，利用土地戈登氏菌RL-JC02及其相关制剂修复有机污染物污染的介质时，土地戈登氏菌RL-JC02的用量可根据实际污染情况进行调整。

当所述多环芳烃类物质或邻苯二甲酸酯类物质的浓度为400～1000mg/L时，降解环境的温度为10℃～50℃时，pH为6～10时，盐离子浓度为0～100g/L时，该菌株降解多环芳烃类物质或邻苯二甲酸酯类物质，且降解效果显著。

因此，所述土地戈登氏菌RL-JC02对降解环境的温度、pH和盐离子浓度均具有较好的耐受能力，具有良好的环境适应性，适用范围广，是理想的环境污染修复微生物。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一株土地戈登氏菌RL-JC02及其在降解有机污染物方面的应用。本发明从土壤中成功分离到一株能够降解多种邻苯二甲酸酯类、多环芳烃类物质的菌株，经形态学、生理生化特征和分子生物学鉴定，该菌株为土地戈登氏菌(Gordonia terrae)RL-JC02。该菌株能够在3天内将无机盐离子培养基中的多环芳烃类物质或邻苯二甲酸酯类物质彻底降解，降解能力稳定；在7天内对污染土壤中的多环芳烃类物质或邻苯二甲酸酯类物质的降解率可高达99.6％，且对降解环境的温度、pH和盐离子浓度均具有较好的耐受能力。另外，该菌株在使用过程中无污染、无公害。

因此，该菌株在使用很少菌量的情况下，即可在短时间内同时降解多种类型环境污染物，具有高效多环芳烃类物质或邻苯二甲酸酯类物质的能力，以及良好的环境适应性，对于控制多环芳烃类物质或邻苯二甲酸酯类物质对环境的污染具有重要意义；且对有机污染物污染的土壤具有很好的修复效果，是理想的土壤环境污染修复微生物，具有十分广泛的应用前景。

附图说明

图1是菌株在电镜下的形态结构图。

图2是菌株在LB固体培养基上的菌落形态图。

图3是菌株的系统发育树结果图。

图4是土地戈登氏菌RL-JC02对浓度分别为100mg/L的DEHP、DCHP、DMP、DBP和DEP的色谱图。

图5是DEHP、DCHP、DMP、DBP和DEP的浓度与315nm处吸收峰面积关系的标准曲线图。

图6是土地戈登氏菌RL-JC02对浓度分别为100mg/L的萘和菲的色谱图。

图7是萘和菲的浓度与气相峰面积关系标准曲线图。

图8是土地戈登氏菌RL-JC02对不同浓度底物的降解率结果图。

图9是土地戈登氏菌RL-JC02在不同反应温度下对各底物的降解率结果图。

图10是土地戈登氏菌RL-JC02在不同反应pH下对各底物的降解率结果图。

图11是土地戈登氏菌RL-JC02在降解环境的不同盐离子浓度对各底物的降解率结果图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

本发明使用的无机盐培养基组成如下：1.0g/L NH₄NO₃，0.5g/L NaCl，0.5g/L(NH₄)₂SO₄，0.5g/L KH₂PO₄，1.5g/L K₂HPO₄和0.005g/L酵母提取物，pH＝7.0±0.2。

斜面培养基组成如下：10.0g/L蛋白胨，5.0g/L NaCl，10.0g/L酵母提取物，pH＝7.0±0.2。

平板固体培养基为相应的培养基中加入1.5％的琼脂。

实施例1土地戈登氏菌(Gordonia terrae)RL-JC02的分离与鉴定

一、菌株分离与筛选

从广东省湛江市广东海洋大学附近的农田土壤中采集土壤样品，在无菌操作条件下，将5g土壤样品接种到含100mg/L DEHP的50mL无机盐离子培养基中，在30℃，180rpm条件下培养。每培养7天后，取1mL转接至新鲜无机盐培养基中，连续转接3次。

将驯化后的菌液划线到含有100mg/L DEHP的无机盐培养基平板上，30℃培养箱中培养3天。挑取在平板上的单菌落转接到含浓度为100mg/L DEHP的无机盐培中培养3天。重复3次，直至分离获得纯化的单克隆菌株。

二、单克隆菌株的形态学鉴定

1、实验方法

(1)用革兰氏染色试剂盒对上述得到的单克隆菌株进行革兰氏染色，鉴定该菌株为革兰氏阴性菌还是革兰氏阳性菌；

(2)用透射电镜观察单克隆菌株的形态。

2、实验结果

经革兰氏染色试剂盒鉴定，该菌株为革兰氏阳性菌。菌株在电镜下的形态结构图如图1所示，可以看出，菌株为短杆菌，菌体直或微弯、无鞭毛，无芽孢。菌株在LB固体培养基上的菌落形态图如图2所示，可以看出，菌落为粉红色，湿软，圆形凸起，边缘规整，不透明，表面光滑。

三、单克隆菌株的生理生化特征鉴定

1、实验方法

进行接触酶、葡萄糖氧化、乙醇氧化、硝酸盐还原、尿酶、氧化酶活性和吲哚反应检测。

2、实验结果

经检测，接触酶、葡萄糖氧化、乙醇氧化、硝酸盐还原和尿酶均为阳性；氧化酶活性和吲哚反应为阴性。

四、单克隆菌株的分子生物学鉴定

将单克隆菌株接种到LB培养基中，30℃、180rpm条件下过夜培养，取1mL菌液，离心收集菌体，用细菌基因组提取试剂盒提取基因组DNA，得到的基因组DNA用0.8％琼脂糖凝胶电泳进行检测，-20℃保存备用。

设计用于扩增16S rDNA序列的通用引物(如SEQ ID NO：1～2所示)，用单克隆菌株的基因组DNA作为模板，加入Premix TaqTM，进行PCR扩增，PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测后，用DNA纯化回收试剂盒纯化，连接到pMD18-T载体上，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布到含有氨苄青霉素的LB固体培养基平板上，在37℃下培养12h，挑取白色菌落至液体LB培养基中，37℃、180rpm振荡培养过夜，用质粒提取试剂盒提取质粒，送上海生工生物公司进行测序。将测序结果进行序列比对，并构建该菌株16S rRNA基因序列的系统发育树。

引物27F(SEQ ID NO：1)：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；

引物1492R(SEQ ID NO：2)：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。

2、实验结果

依据单克隆菌株16S rRNA基因的序列比对，构建的菌株的系统发育树结果图如图3所示。综合菌株的形态学、生理生化特征和分子生物学鉴定结果，判断该菌株属于Gordonia terrae，命名为土地戈登氏菌(Gordonia terrae)RL-JC02，并于2019年6月4日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCC NO：60681，保藏地址是广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

实施例2土地戈登氏菌RL-JC02的降解性能实验

一、土地戈登氏菌RL-JC02对邻苯二甲酸二(2-乙基已基)酯(DEHP)、邻苯二甲酸二环己酯(DCHP)、邻苯二甲酸二乙酯(DMP)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二甲酯(DEP)、萘、菲的降解实验

采用液相色谱法(HPLC)检测无机盐培养基中DEHP、DCHP、DMP、DBP和DEP的浓度，采用气相色谱法(GC)检测无机盐培养基中萘和菲的浓度，具体实验方法和实验结果如下：

将土地戈登氏菌RL-JC02接种到液体LB培养基中活化，培养到对数生长期OD₆₀₀＝0.8，按照体积比10％的接种量接种到分别含DEHP、DCHP、DMP、DBP、DEP、萘和菲各100mg/L底物的无机盐培养基中，作为处理组，以未接种土地戈登氏菌RL-JC02的含DEHP、DCHP、DMP、DBP、DEP、萘和菲各100mg/L底物的无机盐培养基作为对照组，对照组与处理组各设三个重复。将对照组与处理组在30℃，180rpm摇床振荡避光培养，培养3天停止培养，并测定每种物质的浓度。

1、DEHP、DCHP、DMP、DBP和DEP样品的检测

(1)实验方法

向含DEHP、DCHP、DMP、DBP和DEP样品中加入等体积正己烷，超声波充分振荡抽提10min，静置1小时，取上层有机溶剂，将有机溶剂挥发干后，用等体积的甲醇重溶，然后用0.22μm的有机系滤膜过滤，进行HPLC分析。

HPLC分析条件为：Agilent 1200高效液相色谱仪，色谱柱：Eclipse-C18(150mm×4.6mm×5μm)，流动相为甲醇:乙腈:水＝45:40:15(v/v)，进样量2μL，流速1.0mL/min，使用DAD检测器进行检测，检测波长为315nm。利用DEHP、DCHP、DMP、DBP和DEP的标准品绘制浓度与315nm处吸收峰面积之间的标准曲线。

(2)实验结果

土地戈登氏菌RL-JC02对浓度分别为100mg/L的DEHP、DCHP、DMP、DBP和DEP的色谱图如图4所示，可以看出，DEHP、DCHP、DMP、DBP和DEP的保留时间分别为3.463min、7.232min、27.163min、15.375min和22.194min。DEHP、DCHP、DMP、DBP和DEP的浓度与315nm处吸收峰面积关系的标准曲线图如图5所示，可以看出，标准曲线方程分别如下：

DEHP：y＝7.1566x-74.789(R²＝0.9874)；DCHP：y＝6.1827x-9.8603(R²＝0.9961)；DMP：y＝1.5117x+430.48(R²＝0.9859)；DBP：y＝4.7639x+216.16(R²＝0.981)；DEP：y＝3.4098x+114.63(R²＝0.9906)。

2、萘和菲样品的检测

(1)实验方法

向萘和菲样品中加入等体积正己烷，超声波充分振荡抽提10min，静置1小时，取上层有机溶剂，将有机溶剂挥发干后，用等体积的甲醇重溶，然后用0.22μm的有机系滤膜过滤，进行GC检测、分析。

GC检测条件：岛津2010pro气象色谱仪，色谱柱为WondaCap(10.25mm×30m×0.25μm)，载气为高纯氮气(99.999％)，进样量为1μL，气体流速为2mL/min，使用电子捕获检测器(ECD)。利用萘和菲的标准品绘制浓度与峰面积之间的标准曲线。

(2)实验结果

土地戈登氏菌RL-JC02对浓度分别为100mg/L的萘和菲的色谱图如图6所示，可以看出，萘的保留时间为1.816min，菲的保留时间为3.096min。萘和菲的浓度与气相峰面积关系标准曲线图如图7所示，可以看出，标准曲线方程分别如下：

萘：y＝6109.3x+22803(R²＝0.9946)；菲：y＝5068.4x+15384(R²＝0.9954)。

3、土地戈登氏菌RL-JC02对DEHP、DCHP、DMP、DBP、DEP、萘和菲的降解性能实验

(1)实验方法

根据以上得到的不同底物的标准曲线，计算每种底物每天在无机盐培养基中的残留浓度，再根据以下降解率计算公式，得到土地戈登氏菌RL-JC02对底物的降解率。

降解率％＝(对照组中底物的终浓度-处理组中底物的终浓度)/对照组中底物的终浓度×100％；

自然降解率％＝(底物初始浓度-对照组中底物浓度)/底物初始浓度×100％。

(2)实验结果

土地戈登氏菌RL-JC02对各种底物的降解率与底物的自然降解率结果如表1所示，可以看出，底物的自然降解率非常低(0.9％～3.1％)，而土地戈登氏菌RL-JC02可以彻底的降解DEHP、DCHP、DMP、DBP、DEP、萘和菲。

表1土地戈登氏菌RL-JC02对各种底物的降解率与底物的自然降解率结果(3天)

4、土地戈登氏菌RL-JC02在不同时间点对对DEHP、DCHP、DMP、DBP、DEP、萘和菲的降解率测定

(1)实验方法

将土地戈登氏菌RL-JC02接种到液体LB培养基中活化，培养到对数生长期OD600＝0.8，按照体积比10％的接种量接种无机盐离子培养基中，分别以DEHP、DCHP、DMP、DBP、DEP、萘和菲作为唯一碳源加入无机盐离子培养基中(浓度各自为100mg/L)，在30℃条件下，180rpm摇床振荡避光培养。同时，以未接种土地戈登氏菌RL-JC02、分别加入DEHP、DCHP、DMP、DBP、DEP、萘和菲至浓度为100mg/L的相同无机盐离子培养基作为对照组，同样在30℃下，180rpm摇床振荡避光培养。每12小时取样一次，测定各底物浓度，并计算降解率。

(2)实验结果

土地戈登氏菌RL-JC02在不同时间点对各底物的降解率结果如表2所示，可以看出，土地戈登氏菌RL-JC02接入无机盐离子培养基后，可以较快的对DEHP、DCHP、DMP、DBP、DEP、萘和菲进行降解。在48小时内，对各底物的降解率均大于80％；60小时内，对各底物的降解率均大于90％；72小时内，对各底物的降解率均达到100％。

表2土地戈登氏菌RL-JC02在不同时间点对各底物的降解率结果

二、土地戈登氏菌RL-JC02对不同浓度DEHP、DCHP、DMP、DBP、DEP、萘和菲的耐受实验

1、实验方法

分别以DEHP、DCHP、DMP、DBP、DEP、萘和菲作为唯一碳源加入无机盐离子培养基中，设置400mg/L、500mg/L、700mg/L、1000mg/L、2000mg/L和1500mg/L共6个浓度，随后将土地戈登氏菌RL-JC02接种到液体LB培养基中活化，培养到对数生长期OD₆₀₀＝0.8，按照体积比10％的接种量接种到上述培养基中作为处理组，30℃，180rpm摇床振荡避光培养。同时，以含相应浓度底物的无机盐离子培养基、不接种土地戈登氏菌RL-JC02作为对照组。培养3天后，测定各处理底物的浓度。

2、实验结果

土地戈登氏菌RL-JC02对不同浓度底物的降解率结果如图8所示，可以看出，经过3天培养后，当DEHP、DCHP、DMP、DBP、DEP的浓度为400～700mg/L时，被土地戈登氏菌RL-JC02彻底降解(降解率为100％)；当底物浓度大于700mg/L时，随着底物浓度升高，降解率逐渐降低。同样，经过3天培养后，萘和菲的浓度在400～500mg/L时，被土地戈登氏菌RL-JC02彻底降解(降解率为100％)；当底物浓度大于500mg/L时，随着底物浓度升高，降解率逐渐降低。

三、土地戈登氏菌RL-JC02对反应温度的耐受实验

1、实验方法

将土地戈登氏菌RL-JC02接种到液体LB培养基中活化，培养到对数生长期OD₆₀₀＝0.8，按照体积比10％的接种量接种无机盐离子培养基中，分别以DEHP、DCHP、DMP、DBP、DEP、萘和菲作为唯一碳源加入无机盐离子培养基中(浓度各自为100mg/L)，分别在10℃、20℃、30℃、40℃、50℃条件下，180rpm摇床振荡避光培养。同时，以未接种土地戈登氏菌RL-JC02、分别加入DEHP、DCHP、DMP、DBP、DEP、萘和菲至浓度为100mg/L的相同无机盐离子培养基作为对照组，同样在10℃、20℃、30℃、40℃、50℃下，180rpm摇床振荡避光培养。培养3天后，测定各底物浓度。

2、实验结果

土地戈登氏菌RL-JC02在不同反应温度下对各底物的降解率结果如图9所示，可以看出，反应温度为10～50℃时，均可降解DEHP、DCHP、DMP、DBP、DEP、萘和菲。在较高的反应温度下(50℃)，对各底物的降解效率均低于50％；反应温度为10～40℃时，对各底物的降解效率均大于70％；反应温度为30℃时，对各底物的降解率达100％。因此，土地戈登氏菌RL-JC02降解DEHP、DCHP、DMP、DBP、DEP、萘和菲的最适温度为30℃。

四、土地戈登氏菌RL-JC02对反应pH的耐受实验

1、实验方法

分别配制不同pH(5～12)的无机盐离子培养基，灭菌备用。将土地戈登氏菌RL-JC02接种到液体LB培养基中活化，培养到对数生长期OD₆₀₀＝0.8，按照体积比10％的接种量接种到上述培养基中，分别以DEHP、DCHP、DMP、DBP、DEP、萘和菲作为唯一碳源加入无机盐离子培养基中(浓度各自为100mg/L)，作为处理组，30℃，180rpm摇床振荡避光培养。同时，以未接种土地戈登氏菌RL-JC02、不同pH(5～12)、同时分别加入DEHP、DCHP、DMP、DBP、DEP、萘和菲至浓度为100mg/L的相同无机盐离子培养基作为对照组，同样于30℃，180rpm摇床振荡避光培养。培养3天后测定各底物浓度。

2、实验结果

土地戈登氏菌RL-JC02在不同反应pH下对各底物的降解率结果如图10所示，可以看出，pH影响土地戈登氏菌RL-JC02对DEHP、DCHP、DMP、DBP、DEP、萘和菲的降解。当pH从5.0增加到7.0，各底物的降解率也逐渐由最低20％增加到均达到100％；在pH为7.0～11.0时，土地戈登氏菌RL-JC02对各底物的降解率由100％逐渐降低至最低31％；当pH为12.0时，各底物基本无降解。因此，土地戈登氏菌RL-JC02降解DEHP、DCHP、DMP、DBP、DEP、萘和菲的最适pH为7.0。

五、土地戈登氏菌RL-JC02对降解环境的盐离子浓度的耐受实验

1、实验方法

分别配制不同NaCl浓度(0～120g/L)的无机盐离子培养基，灭菌备用。向配制的无机盐离子培养基中分别以DEHP、DCHP、DMP、DBP、DEP、萘和菲作为唯一碳源至浓度各自为100mg/L。将土地戈登氏菌RL-JC02接种到液体LB培养基中活化，培养到对数生长期OD₆₀₀＝0.8，按照体积比10％的接种量接种到上述培养基中作为处理组，于30℃，180rpm摇床振荡避光培养。同时，以未接种土地戈登氏菌RL-JC02、不同NaCl浓度分别加入DEHP、DCHP、DMP、DBP、DEP、萘和菲至浓度为100mg/L的相同无机盐培养基作为对照组，同样于30℃，180rpm摇床振荡避光培养。培养3天后测定各底物浓度。

2、实验结果

土地戈登氏菌RL-JC02在降解环境的不同盐离子浓度对各底物的降解率结果如图11所示，可以看出，NaCl浓度为0～70g/L时，土地戈登氏菌RL-JC02对DEHP、DCHP、DMP、DBP和DEP(100mg/L)的降解率均为100％；NaCl浓度为80～110g/L时，降解率显著下降，但也高于50％；NaCl浓度大于110g/L时，降解率显著下降，均低于50％。因此，土地戈登氏菌RL-JC02降解DEHP、DCHP、DMP、DBP、DEP、萘和菲的最适降解环境的盐离子浓度为0～70g/L，土地戈登氏菌RL-JC02对盐离子具有很好的耐受能力。

实施例3土地戈登氏菌RL-JC02在污染土壤的生物修复中的应用

1、实验方法

本实施例中使用的土壤取自广东海洋大学兴农楼内花园(北纬21°9′1″，东经110°17′47″)的土壤。将土地戈登氏菌RL-JC02在LB液体培养基中培养至对数期(OD₆₀₀＝0.8，菌体浓度约为1.0×10⁸CFU/mL)，向土壤中加入制备的菌液至终浓度分别为1×10⁴、5×10⁴、1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶和5×10⁶CFU/g土壤(每个处理为100g土壤)，并向土壤中分别加入DEHP、DCHP、DMP、DBP、DEP、萘和菲至各浓度分别为100mg/kg，作为处理组。同时，以相同条件下加入相同浓度污染物且不接种土地戈登氏菌RL-JC02的土壤作为对照组，将最终获得的培养体系(处理组与对照组)充分混匀。将样品在恒温恒湿培养箱中，于30℃条件下，湿度维持20％进行培养，在培养的第7日取样测定各种底物的浓度。对照组与处理组中每个处理均设3个重复。

取样方法：每个处理组分别取10g土壤，加入20mL正己烷，在摇床中剧烈震荡1小时，4℃静置过夜，取2mL过无水Na₂SO₄柱子收集流出正己烷溶液，以氮气吹扫使正己烷完全挥发，加入甲醇使溶质复溶并经0.22μm的有机相滤膜进行过滤，此样品用于DEHP、DCHP、DMP、DBP、DEP、萘和菲浓度检测。根据最终测定处理组与对照组中底物的浓度，计算土地戈登氏菌RL-JC02在土壤中对底物的降解率。

2、实验结果

土地戈登氏菌RL-JC02对污染土壤中底物的降解率结果如表3所示，可以看出，当接菌量从1×10⁴CFU/g增加至1×10⁵CFU/g土壤时，随着加入土地戈登氏菌RL-JC02菌量的增加，各种底物的降解率逐渐提高，降解率基本达到最大值(96.1％～99.1％)；当接菌量在1×10⁵～5×10⁶CFU/g土壤时，各种底物的降解率基本保持在95.5％～99.6％。因此，在考虑实际用菌量成本的基础上，土地戈登氏菌RL-JC02降解污染土壤中DEHP、DCHP、DMP、DBP、DEP、萘和菲的最适接菌量为1×10⁵CFU/g土壤。

表3土地戈登氏菌RL-JC02对污染土壤中底物的降解率结果(7天)

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一株土地戈登氏菌(Gordonia terrae)RL-JC02，其特征在于，该菌株已于 2019年6月4日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCC NO：60681。

2.土地戈登氏菌在制备有机污染物降解制剂方面的应用；所述土地戈登氏菌为权利要求1 所述土地戈登氏菌 RL-JC02 。

3.土地戈登氏菌在构建有机污染物降解工程菌方面的应用；所述土地戈登氏菌为权利要求1 所述土地戈登氏菌 RL-JC02 ；所述有机污染物为多环芳烃类物质或邻苯二甲酸酯类物质。

4.土地戈登氏菌、权利要求 2 所述降解制剂或权利要求 3 所述降解工程菌在降解有机污染物中的应用；所述土地戈登氏菌为权利要求 1 所述土地戈登氏菌RL-JC02；所述有机污染物为多环芳烃类物质或邻苯二甲酸酯类物质。

5.土地戈登氏菌、权利要求 2 所述降解制剂或权利要求 3 所述降解工程菌在制备有机污染物生物降解剂中的应用；所述土地戈登氏菌为权利要求 1 所述土地戈登氏菌 RL-JC02；所述有机污染物为多环芳烃类物质或邻苯二甲酸酯类物质。

6.土地戈登氏菌、权利要求 2 所述降解制剂或权利要求 3 所述降解工程菌在修复有机污染物污染的介质中的应用；所述土地戈登氏菌为权利要求 1 所述土地戈登氏菌 RL-JC02；所述有机污染物为多环芳烃类物质或邻苯二甲酸酯类物质。

7.根据权利要求3～6任一所述的应用，其特征在于，所述多环芳烃类物质为萘或菲。

8.根据权利要求3～6任一所述的应用，其特征在于，所述邻苯二甲酸酯类物质为邻苯二甲酸二(2-乙基已基)酯、邻苯二甲酸二环己酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯或邻苯二甲酸二甲酯中的任意一种或几种。