CN113957004A - 一株金黄杆菌及在制备盐生植物附生修复养护菌剂中的应用 - Google Patents

一株金黄杆菌及在制备盐生植物附生修复养护菌剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明盐生植物附生修复养护菌剂，是由金黄杆菌YTLJ‑E‑II12和不动杆菌YTLJ‑N‑L43分别预培养扩繁后经真空冷冻干燥得到相应的单菌菌粉，将单菌菌粉混合，再与盐生植物提取物等混合制得。所述金黄杆菌YTLJ‑E‑II12和不动杆菌YTLJ‑N‑L43保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号分别为GDMCC 61770和GDMCC 61691。该菌剂可强化高盐环境中多种毒害污染物的联合去除，同时具有促进盐生植物生长的作用，用于治理海洋及海岸带等高盐环境的有机‑无机复合污染。

Description

一株金黄杆菌及在制备盐生植物附生修复养护菌剂中的应用
技术领域
本发明涉及环保技术领域的方法，具体地说是一株金黄杆菌及在制备盐生植物附生修复养护菌剂中的应用。
背景技术
随着经济的迅速发展和人类活动的增强，环境污染已成为限制沿海生态脆弱区发展的重要因素。海岸带环境被称为陆源天然和合成化学品的“终端汇”，目前已经在各种海岸带环境(生活污水、处理厂出水、海水、地表水和地下水)中检测到浓度范围为ng L-1至mgL-1的化学污染物。现阶段，相对于物理化学修复技术，生物修复技术被认为是水体中去除有机污染物和富余氮磷营养元素最为经济有效的方法之一，具有成本低、不会对环境造成二次污染的优势。虽然生物修复能够为环境污染物的去除和控制提供持久和低成本的解决方案，但对于大规模且高盐环境污染的修复仍然是一个挑战。
高盐环境中的藻类等盐生植物表面不可避免地会存在一些附生细菌，形成盐生植物-细菌共生体。盐生植物可以利用细菌呼吸作用产生的CO2进行光合作用，从而为细菌代谢污染物提供氧气和碳源。此外，植物的细胞表面可以为细菌提供稳定的栖息地，细菌在植物细胞表面也可以形成一个富含污染物的区域，促进与植物协同去除污染物。这些都对环境中的有机污染物的降解具有重要作用。除此之外，由于海洋的强烈水动力作用，常规菌剂在修复海域使用过程中容易扩散流失，难以扩繁发挥修复作用。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一株金黄杆菌及在制备盐生植物附生修复养护菌剂中的应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一株金黄杆菌，金黄杆菌YTLJ-E-II12(Chryseobacterium sp.YTLJ-E-II12)保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2021年7月5日，保藏编号为GDMCC 61770。
一种金黄杆菌的应用，所述菌株在盐生植物附生修复养护中的应用。
一株不动杆菌，不动杆菌YTLJ-N-L43(Acinetobacter sp.YTLJ-N-L43)保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2021年5月26日，保藏编号为GDMCC 61691。
一种不动杆菌的应用，所述菌株在净化环境中的应用。进一步的说，所述菌株通过絮凝吸附与生物脱氮的方式净化环境。
一种盐生植物附生修复养护菌剂，菌剂为所述的金黄杆菌和/或所述的不动杆菌。
所述菌剂为金黄杆菌YTLJ-E-II12(Chryseobacterium sp.YTLJ-E-II12)和不动杆菌YTLJ-N-L43(Acinetobacter sp.YTLJ-N-L43)按质量比为10:1-100混合，菌剂总有效活菌数≥1.0×109个/mL。
所述菌剂为金黄杆菌YTLJ-E-II12(Chryseobacterium sp.YTLJ-E-II12)和不动杆菌YTLJ-N-L43(Acinetobacter sp.YTLJ-N-L43)的混合物、盐生植物发酵物、细菌群体感应信号分子、群体感应抑制剂、植物生长素混合，混合比例为100：1-10:0.1-1.0:0.1-1.0:0.01-0.1。
所述细菌群体感应信号分子为酰基高丝氨酸内酯(AHLs)、寡肽(AIP，5-10个氨基酸环内酯)、呋喃硼酸二酯、肾上腺素、AI-3去肾上腺素、喹诺酮类、二酮派嗪类中的一种或几种；
所述群体感应抑制剂为卤代呋喃酮类、邻苯三酚、大环内酯类和罗丹明异硫氰酸酯类似物、茶多酚、取代的HSL类、姜黄素、呋喃香豆素、砜类化合物、噻唑烷二酮类、硼酸、黄酮类化合物中的一种或几种；
所述植物生长素为吲哚乙酸(IAA)、4-氯-IAA、5-羟-IAA、萘乙酸(NAA)、油菜素内脂、吲哚丁酸等中的一种或多种；
为盐生植物粉末添加至金黄杆菌YTLJ-E-II12和不动杆菌YTLJ-N-L43的混合菌中，保持含水率>80％，20-40℃温度条件下经过发酵48-96小时，然后干燥待用；其中，盐生植物粉末占金黄杆菌YTLJ-E-II12和不动杆菌YTLJ-N-L43混合菌质量的1-5％；金黄杆菌YTLJ-E-II12和不动杆菌YTLJ-N-L43混合菌为所述步骤2)混合菌干粉；所述盐生植物为碱蓬、红树、柽柳、海藻、海草、海蓬子中的一种或几种。
一种菌剂的制备方法：
1)菌株扩繁驯化：将金黄杆菌YTLJ-E-II12和不动杆菌YTLJ-N-L43分别按1％-20％的接种量至扩繁培养基，于20-40℃下培养3-7天，培养后离心收集细菌；
2)混合菌干粉：将扩繁获得的单一菌通过冷冻干燥，获得单一菌株干粉，然后将单一菌株干粉金黄杆菌YTLJ-E-II12和不动杆菌YTLJ-N-L43按质量比为10:1-100混合；
3)复合菌剂的制备：将制备的混合菌干粉、盐生植物发酵物、细菌群体感应信号分子、群体感应抑制剂、植物生长素混合，按100：1-10:0.1-1.0:0.1-1.0:0.01-0.1的质量比混合，即得复合菌剂。
所述盐生植物发酵物为盐生植物粉末添加至金黄杆菌YTLJ-E-II12和不动杆菌YTLJ-N-L43的混合菌中，保持含水率>80％，20-40℃温度条件下经过发酵48-96小时，然后干燥待用；其中，盐生植物粉末占金黄杆菌YTLJ-E-II12和不动杆菌YTLJ-N-L43混合菌质量的1-5％；金黄杆菌YTLJ-E-II12和不动杆菌YTLJ-N-L43混合菌为所述步骤2)混合菌干粉；所述盐生植物为碱蓬、红树、柽柳、海藻、海草、海蓬子中的一种或几种。
进一步的说：
1)菌株扩繁驯化：将金黄杆菌YTLJ-E-II12和不动杆菌YTLJ-N-L43分别接种至扩繁培养基。所用扩繁培养基为LB培养基，其组成成分的质量比为胰蛋白胨10g/L、酵母提取物、氯化钠10g/L。同时用于菌株扩繁的LB培养基添加0.1-4.0％的氯化钠、0.1-1.0％的硝酸铵、0.01-0.05％高碳醇脂肪酸酯复合物以及典型有机污染物。温度28℃下培养3-7天，培养时间结束后，收集细菌。驯化培养基含有机毒害污染物的浓度为10-2000μg/L,其中包括抗生素、多环芳烃类和酚类，质量比为1：1-10:1-100。
2)混合菌制备：将扩繁获得的单一菌通过冷冻干燥，获得单一菌株干粉，然后将单一菌株干粉按照一定比例混合制得复合菌干粉，
金黄杆菌YTLJ-E-II12和不动杆菌YTLJ-N-L43的混合比例为10：1-100。
3)复合菌剂的制备：将制备的混合菌干粉、盐生植物发酵物、细菌群体感应信号分子、群体感应抑制剂、植物生长素混合，按100：1-10:0.1-1.0:0.1-1.0:0.01-0.1的质量比混合，即得复合菌剂。
所述扩繁培养基为LB培养基、硝酸铵、高碳醇脂肪酸酯复合物和典型有机污染物；其中，硝酸铵的加入量占扩繁培养基质量的0.1-1.0％，高碳醇脂肪酸酯复合物的加入量占扩繁培养基质量的0.01-0.05％，典型有机污染物加入量是每升扩繁培养基中添加10-2000μg。
所述典型有机污染物为抗生素、多环芳烃类和酚类，质量比为1：1-10:1-100。
一种所述菌剂的应用，所述菌剂与盐生植物形成共生系统在原位修复污染环境中有机-无机复合污染物并促进盐生植物生长中的应用。
本发明所具有的优点：
1)本发明菌株均分离自海岸带盐生植物，其中金黄杆菌YTLJ-E-II12分离自碱蓬根际土壤，对盐生植物生长有促进作用；不动杆菌YTLJ-N-L43离自滨海潮间带海藻表面，为滨海常见土著菌。金黄杆菌YTLJ-E-II12和不动杆菌YTLJ-N-L43优势互补，可与盐生植物形成共生系统。金黄杆菌YTLJ-E-II12可高效降解多种有机污染物，并通过硝化作用去除氨氮和亚硝酸盐，同时金黄杆菌YTLJ-E-II12可产生具有能促进植物生长的激素，促进盐生植物的生长；不动杆菌YTLJ-N-L43可通过好氧反硝化作用去除硝酸盐、亚硝酸盐及有机污染物，还可产生絮凝剂吸附去除多种污染物，同时其易于在盐生植物组织表面形成生物膜，利于所添加金黄杆菌YTLJ-E-II12菌株在盐生植物根际或叶表定殖并强化其修复功能的发挥。
2)本发明由两种菌株复合获得复合菌剂，复合菌剂为从盐生植物表面分离得到的功能菌进行再组装而得，喷洒后易于在盐生植物表面附着并进行扩繁，保证在环境中具有较高的生物量。克服了由于海洋及海岸带强烈的水动力作用，常规菌剂在修复海域使用过程中容易扩散流失，难以发挥修复作用的缺点。具有菌剂用量少、菌种来源广泛和无二次污染的经济生态效益。
3)本发明所得盐生植物附生菌剂是由多功能菌组成的复合菌群，菌剂性质稳定，对投放环境的pH、温度、盐度和含氧量无严格要求，可最大程度保留微生物在原位污染处理过程中的功能活性，实现有机污染物和氮素等营养元素的同时去除，属于多用途的环境友好型菌剂。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进一步说明，然而本发明并不局限于以下实施例。
本发明借助某些附生菌易于在植物表面附着扩繁特点以及盐生植物附生微生物可以同时发挥污染物生物降解及促进植物生长双重作用的优势，开发了盐生植物附生菌剂并应用于海洋及海岸带等高盐环境的生态修复。制备的菌剂与藻体等盐生植物之间具有良好的协同性，对于治理氮素污染与有机物污染物形成的海洋及海岸带有机-无机复合污染具有重要的现实意义。
实施例1
金黄杆菌的分离及鉴定
1.菌株的分离
从滨海湿地采集碱蓬根系，将质量比为2％的碱蓬根转移到已灭菌的富集培养基中，震荡培养1-7天后，于LB固体培养基中进行稀释培养，挑选单菌落在琼脂固体培养基上进行划线分离，获得纯化后的菌株YTLJ-E-II12。
所述富集培养基为质量比为0.05-0.2％(NH4)SO4、0.2-1％琥珀酸钠、2-5％K2HPO4、1-3％MgSO4、1-3％NaCl，0.01-0.05％FeSO4、0.01-0.05％MnSO4、0.001-0.005％(NH4)2MoO4、0.001-0.005％CoCl2、0.1-1％细菌群体感应抑制剂(具体为氯代呋喃酮)、0.1-1％双酚A和0.02-0.1％高碳醇脂肪酸酯复合物。
2、菌株的鉴定
2.1、形态学鉴定
上述步骤1分离并纯化得到的菌株进行分析比对该菌株属金黄杆菌。
2.2、16S rDNA序列同源性分析
采用菌落PCR方法扩增步骤1所得的菌株的16S rDNA片段，对16S rRNA基因片段进行扩增并克隆测序的结果表明，菌株的16S rDNA具有序列表中序列1的核苷酸序列。菌株的16S rDNA与的16S rRNA基因的相似性。
16S rDNA基因序列为：
GCGGTAGAGATCTTTCGGGATCTTGAGAGCGGCGTACGGGTGCGGAACACGTGTGCAACCTGCCTTTATCTGGGGGATAGCCTTTCGAAAGGAAGATTAATACCCCATAATATACTGGATGGCATCATTCGGTATTGAAAACTCCGGTGGATAGAGATGGGCACGCGCAAGATTAGATAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGTCTACGATCTTTAGGGGGCCTGAGAGGGTGATCCCCCACACTGGTACTGAGACACGGACCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGACAATGGGTGAGAGCCTGATCCAGCCATCCCGCGTGAAGGACGACGGCCCTATGGGTTGTAAACTTCTTTTGTATAGGGATAAACCTACCCTCGTGAGGGTAGCTGAAGGTACTATACGAATAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGTTTAAAGGGTCCGTAGGCGGATCTGTAAGTCAGTGGTGAAATCTCACAGCTTAACTGTGAAACTGCCATTGATACTGCAGGTCTTGAGTGTTGTTGAAGTAGCTGGAATAAGTAGTGTAGCGGTGAAATGCATAGATATTACTTAGAACACCAATTGCGAAGGCAGGTTACTAAGCAACAACTGACGCTGATGGACGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGCTAACTCGTTTTTGGAGCGCAAGCTTCAGAGACTAAGCGAAAGTGATAAGTTAGCCACCTGGGGAGTACGAACGCAAGTTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGATTATGTGGTTTAATTCGATGATACGCGAGGAACCTTACCAAGGCTTAAATGGGAAATGACAGGTTTAGAAATAGACTTTTCTTCGGACATTTTTCAAGGTGCTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGCCGTGAGGTGTTAGGTTAAGTCCTGCAACGAGCGCAACCCCTGTCACTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGGACTCTAGTGAGACTGCCTACGCAAGTAGAGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCACGGCCCTTACGCCTTGGGCCACACACGTAATACAATGGCCGGTACAGAGGGCAGCTACACTGCGAAGTGATGCAAATCTCGAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCTATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGCATCAGCCATGGCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGCCATGGAAGTCTGGGGTACCT
2.3、生理生化特征鉴定
测定菌株的生理生化特征：该金黄杆菌YTLJ-E-II12(Chryseobacteriumsp.YTLJ-E-II12)革兰氏染色阴性，对多环芳烃、抗生素、酚类有较好降解效果。
该金黄杆菌YTLJ-E-II12(Chryseobacterium sp.YTLJ-E-II12)保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2021年7月5日，保藏编号为GDMCC 61770。
实施例2
不动杆菌YTLJ-N-L43的分离及鉴定
1.菌株的分离
采集滨海潮间带海藻按质量比为1％的接种量转移到已灭菌的富集培养基中，震荡培养1-7天后，于LB固体培养基中进行稀释培养，挑选单菌落在琼脂固体培养基上进行划线分离，获得纯化后的菌株YTLJ-N-L43。
所述富集培养基为质量比为0.05-0.2％(NH4)SO4、0.2-1％琥珀酸钠、2-5％K2HPO4、1-3％MgSO4、1-3％NaCl，0.01-0.05％FeSO4、0.01-0.05％MnSO4、0.001-0.005％(NH4)2MoO4、0.001-0.005％CoCl2、0.1-1％细菌群体感应抑制剂(具体为邻苯三酚)、0.1-1％双酚A和0.02-0.1％高碳醇脂肪酸酯复合物。
2、菌株的鉴定
2.1、形态学鉴定
上述步骤1分离并纯化得到的菌株进行分析比对该菌株属不动杆菌。
2.2、16S rDNA序列同源性分析
采用菌落PCR方法扩增步骤1所得的菌株的16S rDNA片段，对16S rRNA基因片段进行扩增并克隆测序的结果表明，菌株的16S rDNA具有序列表中序列1的核苷酸序列。菌株的16S rDNA与的16S rRNA基因的相似性。
16S rDNA基因序列为：
CGGAGAGAGGTAGCTTGCTACTGATCTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCTTAGGAATCTGCCTATTAGTGGGGGACAACATTTCGAAAGGAATGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGATCTTCGGACCTTGCGCTAATAGATGAGCCTAAGTCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCTGTAGCGGGTCTGAGAGGATGATCCGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTATGGTTGTAAAGCACTTTAAGCGAGGAGGAGGCTACTTTAGTTAATACCTAGAGATAGTGGACGTTACTCGCAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGATTTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGCGGCTAATTAAGTCAAATGTGAAATCCCCGAGCTTAACTTGGGAATTGCATTCGATACTGGTTAGCTAGAGTGTGGGAGAGGATGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCATCTGGCCTAACACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCATGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGTCTACTAGCCGTTGGGGCCTTTGAGGCTTTAGTGGCGCAGCTAACGCGATAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGCCTTGACATAGTAAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTTACATACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTTTCCTTATTTGCCAGCGAGTAATGTCGGGAACTTTAAGGATACTGCCAGTGACAAACTGGAGGAAGGCGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGGTTGCTACCTAGCGATAGGATGCTAATCTCAAAAAGCCGATCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGAATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTTGTTGCACCAGA
测定菌株的生理生化特征：该不动杆菌YTLJ-N-L43(Acinetobacter sp.YTLJ-N-L43)革兰氏染色阴性，可产生菌胶团絮凝剂，可通过异养硝化好氧反硝化作用将氨氮、硝态氮、亚硝态氮转化为氮气去除，同时可去除多种有机污染物如多环芳烃、抗生素、酚类等。
该不动杆菌YTLJ-N-L43(Acinetobacter sp.YTLJ-N-L43)保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2021年5月26日，保藏编号为GDMCC 61691。
实施例3
1)金黄杆菌YTLJ-E-II12对含菲污染废水处理：
将上述实施例获得的金黄杆菌YTLJ-E-II12按接种量1％添加至含菲污染废水，该废水菲浓度达到20μg/L。引入金黄杆菌YTLJ-E-II12在30℃好氧条件下降解30天后，菲去除率达到96％。
2)不动杆菌YTLJ-N-L43对高氨氮养殖废水处理：
将上述实施例获得的不动杆菌YTLJ-N-L43按接种量1％添加至水产养殖废水，废水中氨氮浓度达到10mg/L。引入不动杆菌YTLJ-N-L43在25℃条件下处理养殖废水，7天内氨氮去除率可达96％。
实施例4
复合菌剂的制备：
1)菌株扩繁驯化：将上述实施例获得金黄杆菌YTLJ-E-II12和不动杆菌YTLJ-N-L43分别按10wt％的接种量接种至扩繁培养基。
所述扩繁培养基为LB液体培养基中添加培养基质量0.1％的硝酸铵、0.01％高碳醇脂肪酸酯复合物和每升扩繁培养基中含2000μg/L的典型有机污染物。其中，典型有机污染物为抗生素(磺胺嘧啶)、多环芳烃类(菲)和酚类(辛基酚)，质量比为1:10:100。
两菌株分别接种后于28℃下培养7天，培养时间结束后，分离收集细菌。
2)混合菌干粉制备：将扩繁分离获得的单一菌通过冷冻干燥(冷阱温度-60～-45℃)，获得单一菌株干粉，将获得金黄杆菌YTLJ-E-II12干粉和不动杆菌YTLJ-N-L43干粉按质量比为10：1混合。
3)盐生植物发酵物的制备：盐生植物粉末添加金黄杆菌YTLJ-E-II12干粉和不动杆菌YTLJ-N-L43混合菌中，保持含水率>80％，20℃温度条件下经过发酵48小时，然后干燥后待用。其中，盐生植物粉末占金黄杆菌YTLJ-E-II12和不动杆菌YTLJ-N-L43混合菌质量的5％；金黄杆菌YTLJ-E-II12和不动杆菌YTLJ-N-L43混合菌为所述步骤2)混合菌干粉；所用盐生植物为碱蓬。
4)复合菌剂制备：将步骤2)制得混合菌干粉、步骤3)获得盐生植物发酵物、细菌群体感应信号分子、群体感应抑制剂、植物生长素混合，混合按质量比例为100：10:0.1:0.1:0.1。所述细菌群体感应信号分子为酰基高丝氨酸内酯(AHLs)，群体感应抑制剂为卤代呋喃酮，植物生长素为吲哚乙酸(IAA)。
将上述实施例制备的复合菌剂对黄河三角洲石油污染区域进行生态修复，该区域受石油烃及多环芳烃污染，其中石油烃总量为1.03g/kg，典型多环芳烃菲含量为0.10mg/kg。
将上述获得复合菌剂按照1wt％的质量比投入到上述生长有碱蓬的黄河三角洲石油污染区域土壤中，实现污染环境的原位修复，去除有机污染物(石油烃)和亚硝态氮，还可促进碱蓬生长。总石油烃去除率达到95.3％，菲去除率达到96.2％，亚硝态氮去除率达到96.5％。
实施例5
复合菌剂的制备，与实施例4不同之处在于：
1)菌株扩繁驯化：
菌株扩繁驯化：将上述实施例获得金黄杆菌YTLJ-E-II12和不动杆菌YTLJ-N-L43分别按15％的接种至扩繁培养基。
所述扩繁培养基为LB液体培养基中添加培养基质量0.5％的硝酸铵、0.03％高碳醇脂肪酸酯复合物和每升扩繁培养基中添加10μg/L的典型有机污染物。其中，典型有机污染物为抗生素(氟喹诺酮)、多环芳烃类(菲)和酚类(双酚A)，质量比为1:5:50。
两菌株分别接种后于40℃下培养7天，培养时间结束后，分离收集细菌。
2)混合菌干粉制备：将扩繁分离获得的单一菌通过冷冻干燥，获得单一菌株干粉，将获得金黄杆菌YTLJ-E-II12干粉和不动杆菌YTLJ-N-L43干粉按质量比为10：10混合。
3)盐生植物发酵物的制备：盐生植物粉末添加金黄杆菌YTLJ-E-II12干粉和不动杆菌YTLJ-N-L43混合菌中，保持含水率>80％，20℃温度条件下经过发酵96小时，然后干燥后待用。其中，盐生植物粉末占金黄杆菌YTLJ-E-II12和不动杆菌YTLJ-N-L43混合菌质量的1％；金黄杆菌YTLJ-E-II12和不动杆菌YTLJ-N-L43混合菌为所述步骤2)混合菌干粉；所用盐生植物为海藻与海草，两者按质量比为10:1。
4)复合菌剂制备：将步骤2)制得混合菌干粉、步骤3)获得盐生植物发酵物、细菌群体感应信号分子、群体感应抑制剂、植物生长素混合，混合比例为100：5:0.5:0.5:0.05。所用细菌群体感应信号分子为呋喃硼酸二酯，群体感应抑制剂为常见大环内酯类化合物——红霉素，植物生长素为油菜素内脂。
将上述实施例制备的复合菌剂对烟台某海洋牧场进行净化，该区域海水氟喹诺酮、双酚A、壬基酚、菲、铜、氨氮、硝态氮、亚硝态氮浓度分别为1.1、0.8、0.3、0.1、240、30、100、60μg/L。
将上述制备获得复合菌剂按照0.1wt％的质量比投入到烟台某海洋牧场中，实现污染海域的原位生态修复，去除有机污染物(氟喹诺酮、双酚A、壬基酚和菲)、铜、氨氮、硝态氮和亚硝态氮等，还可促进海藻及海草的生长，上述污染物去除率分别达到81％、85％、84％、87％、86％、81％、91％、90％，污染物的去除率均超过80％。
实施例6
复合菌剂的制备，与实施例4不同之处在于：
1)菌株扩繁驯化：
菌株扩繁驯化：将上述实施例获得金黄杆菌YTLJ-E-II12和不动杆菌YTLJ-N-L43分别按20％的接种至扩繁培养基。
所述扩繁培养基为LB液体培养基中添加培养基质量1.0％的硝酸铵、0.05％高碳醇脂肪酸酯复合物和每升扩繁培养基中添加500μg/L的典型有机污染物。其中，典型有机污染物为抗生素(诺氟沙星)、多环芳烃类(萘)、酚类(双酚A)，质量比为1:1:1。
两菌株分别接种后于20℃下培养5天，培养时间结束后，分离收集细菌。
2)混合菌干粉制备：将扩繁分离获得的单一菌通过冷冻干燥，获得单一菌株干粉，将获得金黄杆菌YTLJ-E-II12干粉和不动杆菌YTLJ-N-L43干粉按质量比为10：100混合。
3)盐生植物发酵物的制备：盐生植物粉末添加金黄杆菌YTLJ-E-II12干粉和不动杆菌YTLJ-N-L43混合菌中，保持含水率>80％，20℃温度条件下经过发酵72小时，然后干燥后待用。其中，盐生植物粉末占金黄杆菌YTLJ-E-II12和不动杆菌YTLJ-N-L43混合菌质量的2％；金黄杆菌YTLJ-E-II12和不动杆菌YTLJ-N-L43混合菌为所述步骤2)混合菌干粉；所用盐生植物为海藻。
4)菌剂制备：将步骤2)制得混合菌干粉、步骤3)获得盐生植物发酵物、细菌群体感应信号分子、群体感应抑制剂、植物生长素混合，混合比例为100：10:1.0:1.0:0.1。所用细菌群体感应信号分子为寡肽(AIP，5-10个氨基酸环内酯)，群体感应抑制剂为罗丹明异硫氰酸酯类似物，植物生长素为萘乙酸(NAA)。
将上述实施例制备的复合菌剂进行处理养殖尾水：
将上述制备获得复合菌剂按照0.5wt％的质量比投入到生长有盐生植物的养殖尾水中，实现尾水的深度净化。该养殖尾水诺氟沙星、双酚A、氨氮、亚硝态氮和硝态氮浓度分别达到1.9μg/L、1.1μg/L、0.8mg/L、5mg/L、35mg/L。各污染物去除率分别为92％、91％、91％、94％、92％，污染物的去除率均超过90％，该复合菌剂添加还可促进盐生植物(海藻与海蓬子)生长。
序列表
<110> 中国科学院烟台海岸带研究所
<120> 一株金黄杆菌及在制备盐生植物附生修复养护菌剂中的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1348
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcggtagaga tctttcggga tcttgagagc ggcgtacggg tgcggaacac gtgtgcaacc 60
tgcctttatc tgggggatag cctttcgaaa ggaagattaa taccccataa tatactggat 120
ggcatcattc ggtattgaaa actccggtgg atagagatgg gcacgcgcaa gattagatag 180
ttggtgaggt aacggctcac caagtctacg atctttaggg ggcctgagag ggtgatcccc 240
cacactggta ctgagacacg gaccagactc ctacgggagg cagcagtgag gaatattgga 300
caatgggtga gagcctgatc cagccatccc gcgtgaagga cgacggccct atgggttgta 360
aacttctttt gtatagggat aaacctaccc tcgtgagggt agctgaaggt actatacgaa 420
taagcaccgg ctaactccgt gccagcagcc gcggtaatac ggagggtgca agcgttatcc 480
ggatttattg ggtttaaagg gtccgtaggc ggatctgtaa gtcagtggtg aaatctcaca 540
gcttaactgt gaaactgcca ttgatactgc aggtcttgag tgttgttgaa gtagctggaa 600
taagtagtgt agcggtgaaa tgcatagata ttacttagaa caccaattgc gaaggcaggt 660
tactaagcaa caactgacgc tgatggacga aagcgtgggg agcgaacagg attagatacc 720
ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgctaac tcgtttttgg agcgcaagct tcagagacta 780
agcgaaagtg ataagttagc cacctgggga gtacgaacgc aagtttgaaa ctcaaaggaa 840
ttgacggggg cccgcacaag cggtggatta tgtggtttaa ttcgatgata cgcgaggaac 900
cttaccaagg cttaaatggg aaatgacagg tttagaaata gacttttctt cggacatttt 960
tcaaggtgct gcatggttgt cgtcagctcg tgccgtgagg tgttaggtta agtcctgcaa 1020
cgagcgcaac ccctgtcact agttgccatc attaagttgg ggactctagt gagactgcct 1080
acgcaagtag agaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc acggccctta cgccttgggc 1140
cacacacgta atacaatggc cggtacagag ggcagctaca ctgcgaagtg atgcaaatct 1200
cgaaagccgg tctcagttcg gattggagtc tgcaactcga ctctatgaag ctggaatcgc 1260
tagtaatcgc gcatcagcca tggcgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc 1320
cgtcaagcca tggaagtctg gggtacct 1348
<210> 2
<211> 1363
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cggagagagg tagcttgcta ctgatcttag cggcggacgg gtgagtaatg cttaggaatc 60
tgcctattag tgggggacaa catttcgaaa ggaatgctaa taccgcatac gtcctacggg 120
agaaagcagg ggatcttcgg accttgcgct aatagatgag cctaagtcgg attagctagt 180
tggtggggta aaggcctacc aaggcgacga tctgtagcgg gtctgagagg atgatccgcc 240
acactgggac tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc agcagtgggg aatattggac 300
aatgggcgca agcctgatcc agccatgccg cgtgtgtgaa gaaggcctta tggttgtaaa 360
gcactttaag cgaggaggag gctactttag ttaataccta gagatagtgg acgttactcg 420
cagaataagc accggctaac tctgtgccag cagccgcggt aatacagagg gtgcaagcgt 480
taatcggatt tactgggcgt aaagcgcgcg taggcggcta attaagtcaa atgtgaaatc 540
cccgagctta acttgggaat tgcattcgat actggttagc tagagtgtgg gagaggatgg 600
tagaattcca ggtgtagcgg tgaaatgcgt agagatctgg aggaataccg atggcgaagg 660
cagccatctg gcctaacact gacgctgagg tgcgaaagca tggggagcaa acaggattag 720
ataccctggt agtccatgcc gtaaacgatg tctactagcc gttggggcct ttgaggcttt 780
agtggcgcag ctaacgcgat aagtagaccg cctggggagt acggtcgcaa gactaaaact 840
caaatgaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgatgcaacg 900
cgaagaacct tacctggcct tgacatagta agaactttcc agagatggat tggtgccttc 960
gggaacttac atacaggtgc tgcatggctg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt 1020
aagtcccgca acgagcgcaa cccttttcct tatttgccag cgagtaatgt cgggaacttt 1080
aaggatactg ccagtgacaa actggaggaa ggcggggacg acgtcaagtc atcatggccc 1140
ttacggccag ggctacacac gtgctacaat ggtcggtaca aagggttgct acctagcgat 1200
aggatgctaa tctcaaaaag ccgatcgtag tccggattgg agtctgcaac tcgactccat 1260
gaagtcggaa tcgctagtaa tcgcggatca gaatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct 1320
tgtacacacc gcccgtcaca ccatgggagt ttgttgcacc aga 1363

Claims (10)

1.一株金黄杆菌，其特征在于：金黄杆菌YTLJ-E-II12(Chryseobacterium sp.YTLJ-E-II12)保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2021年7月5日，保藏编号为GDMCC 61770。
2.按权利要求1所述的金黄杆菌的应用，其特征在于：所述菌株在盐生植物附生修复养护中的应用。
3.一株不动杆菌，其特征在于：不动杆菌YTLJ-N-L43(Acinetobacter sp.YTLJ-N-L43)保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2021年5月26日，保藏编号为GDMCC 61691。
4.一种权利要求3所述不动杆菌的应用，其特征在于：所述菌株在所述菌株在净化环境中的应用。
5.一种盐生植物附生修复养护菌剂，其特征在于：菌剂为权利要求1所述的金黄杆菌和/或权利要求3所述的不动杆菌。
6.按权利要求3所述菌剂，其特征在于：所述菌剂为金黄杆菌YTLJ-E-II12(Chryseobacterium sp.YTLJ-E-II12)和不动杆菌YTLJ-N-L43(Acinetobacter sp.YTLJ-N-L43)按质量比为10:1-100混合，菌剂总有效活菌数≥1.0×109个/mL。
7.按权利要求5所述菌剂，其特征在于：所述菌剂为金黄杆菌YTLJ-E-II12(Chryseobacterium sp.YTLJ-E-II12)和不动杆菌YTLJ-N-L43(Acinetobacter sp.YTLJ-N-L43)的混合物、盐生植物发酵物、细菌群体感应信号分子、群体感应抑制剂、植物生长素混合，混合比例为100：1-10:0.1-1.0:0.1-1.0:0.01-0.1。
8.一种权利要求5所述菌剂的制备方法，其特征在于
1)菌株扩繁驯化：将金黄杆菌YTLJ-E-II12和不动杆菌YTLJ-N-L43分别按1％-20％的接种量至扩繁培养基，于20-40℃下培养3-7天，培养后离心收集细菌；
2)混合菌干粉：将扩繁获得的单一菌通过冷冻干燥，获得单一菌株干粉，然后将单一菌株干粉金黄杆菌YTLJ-E-II12和不动杆菌YTLJ-N-L43按质量比为10:1-100混合；
3)复合菌剂的制备：将制备的混合菌干粉、盐生植物发酵物、细菌群体感应信号分子、群体感应抑制剂、植物生长素混合，按100：1-10:0.1-1.0:0.1-1.0:0.01-0.1的质量比混合，即得复合菌剂。
9.按权利要求8所述菌剂的制备方法，其特征在于：所述盐生植物发酵物为盐生植物粉末添加至金黄杆菌YTLJ-E-II12和不动杆菌YTLJ-N-L43的混合菌中，保持含水率>80％，20-40℃温度条件下经过发酵48-96小时，然后干燥待用；其中，盐生植物粉末占金黄杆菌YTLJ-E-II12和不动杆菌YTLJ-N-L43混合菌质量的1-5％；金黄杆菌YTLJ-E-II12和不动杆菌YTLJ-N-L43混合菌为所述步骤2)混合菌干粉；所述盐生植物为碱蓬、红树、柽柳、海藻、海草、海蓬子中的一种或几种。
10.一种权利要求5所述菌剂的应用，其特征在于：所述菌剂与盐生植物形成共生系统在原位修复污染环境中有机-无机复合污染物并促进盐生植物生长中的应用。
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