CN113462609B - 一种高效降解多环芳烃的分枝杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高效降解多环芳烃的分枝杆菌及其应用，属于微生物技术领域。本发明的分枝杆菌Mycobacteriumsp.DBH‑3，其保藏编号为：CCTCCNO:M2019036。该菌能以多环芳烃为唯一碳源进行生长，实验证实其对多环芳烃具有高效的降解能力，对菲的降解率为100％(3天)，荧蒽和芘的降解率为100％(12天)。在遗传学上证实其具有多环芳烃降解特性。因此，本发明为海洋生态系统去除多环芳烃进行生态修复提供了优良的菌株资源。本发明还提供了提供一种微生物制剂，其包含本发明的分枝杆菌DBH‑3。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株具有高效降解多种多环芳烃功能的分枝杆菌及其应用。
背景技术
多环芳烃(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons,PAHs)是一类在环境中普遍存在持久性有机污染物，其主要由两个及两个以上苯环稠合在一起组成，主要源于石油、煤等化石燃料以及木材、天然气、秸秆等有机物的不完全燃烧或在还原条件下经热分解而生成。多环芳烃具有致癌、致畸、致突变的特性，由于其高疏水性和高立体化学稳定性极易在环境中累积并在食物链中进行富集，对人类的健康和生态环境的安全具有构成极大地威胁。
已有研究表明微生物降解是去除环境中PAHs中的主要方法之一，微生物修复技术具有经济高效、绿色环保等优点，而获得具有高效降解能力的微生物保障微生物修复的重要前提。放线菌门的分枝杆菌属细菌具有降解包括多环芳烃、杀虫剂等在内的多种环境污染物，其具有较强的难受恶劣环境条件的能力，被证实是能够适用于多环芳烃污染场地微生物修复的重要菌种，其能够降解低分子量(2-3环)和高分子量的多环芳烃(四环及以上)。此外，分枝杆菌由于具有特殊的亲脂性表面，因此能够从重污染土壤颗粒中吸收复杂结合污染物(即多环芳烃)。
细胞色素P450广泛存在于动植物、细菌和真菌等细胞内，其能够对许多内源性和外源性的环境有害化学物质存在氧化代谢作用，比如进行多环芳烃的生物转化、甾醇分子的生物转化等。环境中的多环芳烃等污染物会引起细胞色素P450酶基因的表达，从而被降解。分枝杆菌属细菌还具有细胞色素P450酶基因，因此进一步成为环境污染修复的重要备选菌。
因此，本专利旨在通过分离源于海洋生态系统的具有高效降解多种多环芳烃的功能菌株，为生态环境尤其是海洋环境中多环芳烃污染的微生物修复提供可利用的菌株。
发明内容
本发明的目的是提供一株具有高效降解多种多环芳烃功能的分枝杆菌(Mycobacterium sp.)DBH-3，于2019年1月11日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国. 武汉.武汉大学，邮编：430072，保藏编号：CCTCC NO:M 2019036。
本发明中的分枝杆菌DBH-3主要形态和生物学特征：DBH-3为革兰氏阳性、好氧、杆状、无鞭毛，在30℃、在M2固体培养基上培养36h，形成圆形易挑取、橙红色的菌落。将分枝杆菌DBH-3的16S rRNA片段序列与NCBI-BLAST数据库中的序列进行比对分析，结果显示，DBH-3菌株与分枝杆菌(Mycobacterium poriferae)超过99％的相似性。
本发明的第二个目的是提供一种微生物制剂，包含所述的分枝杆菌DBH-3。
在一优选例中，所述微生物制剂仅含有分枝杆菌DBH-3。
在另一优选例中，所述微生物制剂含有分枝杆菌DBH-3，和包括但不限于芽孢杆菌、不动杆菌、微杆菌。
本发明的第三个目的是提供所述的分枝杆菌DBH-3在降解多环芳烃中的应用。如在多环芳烃污染环境的生物修复中的应用。所述污染环境包括但不限于水环境、土壤环境、大气环境。优选地，所述的分枝杆菌DBH-3在多环芳烃污染环境的海洋环境中的生物修复的应用。
优选地，所述多环芳烃为三环菲Phenanthrene、四环荧蒽Fluoranthene或芘Pyrene。
优选地，是将所述的分枝杆菌DBH-3接种到含多环芳烃的培养体系中进行培养。
本发明分枝杆菌DBH-3具有以多环芳烃为唯一碳源进行生长的能力。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明分枝杆菌DBH-3能够通过以多环芳烃为唯一碳源而富集获得；
(2)本发明的分枝杆菌DBH-3能够高效地降解多种多环芳烃(三环和四环等)，对三环菲(3天)、四环荧蒽(12天)和芘(12天)的去除率均为100％；
(3)本发明的分枝杆菌DBH-3具有较强的环境适应能力，来源于海洋环境，可应用于修复多环芳烃污染的海洋生态环境。
本发明的Mycobacterium sp.DBH-3，于2019年1月11日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，保藏编号：CCTCC NO:M2019036。
附图说明
图1是分枝杆菌DBH-3的16S rRNA基因系统发育树
图2是基于COG和KEGG预测DBH-3基因组中多环芳烃分解代谢基因簇(A簇:10 个多环芳烃降解基因；B簇:37个多环芳烃降解基因；C：细胞色素P450酶基因)
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1 DBH-3的分离、纯化
喜盐草Halophila ovalis沉积物采集于中国广东省深圳大亚湾(22°33'17"N，114°29'56.4"E)，在低潮期时利用无菌铲采集沉积物样品，并用无菌的聚乙烯袋带回实验室，立即进行多环芳烃降解菌的富集培养。
首先用无机盐培养基(不含碳源)对沉积物进行富集培养，称取适量的菲(美国阿拉丁工业公司，含量>97％)，用丙酮溶解，通过应用0.22μm滤膜过滤灭菌后制成菲的丙酮溶液。取适量菲的丙酮溶液加入100mL的MSM液体培养基的锥形瓶(培养基和锥形瓶均已灭菌)中，菲的终浓度为100mg/L；待锥形瓶中的丙酮挥发完全后，加入10g海草床沉积物样品，用封口膜将锥形瓶封口。沉积物中的微生物以菲为唯一碳源，在180r/min、30℃的摇床中避光培养35天。待培养结束后，用无菌海水对培养液进行梯度为10-3、10-4、10-5、10-6倍的稀释，取200μL涂布于216L固体培养基进行涂布，在30℃恒温培养2周。待生长有明显菌落，挑取菌落进行进一步的纯化，重复三次，然后对获得的菌落进行进一步的形态学分离和纯化，获得能够快速生长形成菌落的DBH-3。
其中，MSM培养基、M2培养基和216L固体培养基的成分分别如下：
MSM培养基的组成为：NH4NO31 g、K2HPO40.5 g、FeSO42.8 mg，过滤海水1L，用1 mol/LNaOH溶液调节培养基pH至7.5。
M2培养基的组成：CH3COONa 5.0g，NH4NO31 g，蛋白胨0.5g，酵母提取物0.5g，葡萄糖0.5g，NH4Cl 0.2g，KH2PO40.5 g，柠檬酸钠0.5g，苹果酸0.05g，KH2PO40.5 g，琼脂15g，1000mL过滤海水；将上述培养基的成分混合，灭菌，即得。
216L固体培养基的组成：蛋白胨10g，酵母提取物2g，柠檬酸钠0.5g，NH4NO30.2 g，琼脂15g，1000mL过滤海水，pH值为7.5；将上述培养基的成分混合，灭菌，即得。
实施例2：DBH-3的形态学和分子生物学鉴定
DBH-3为革兰氏阳性、好氧、杆状、无鞭毛，在30℃、在M2固体培养基上培养36h，形成圆形易挑取、橙红色的菌落。本发明还进一步提取了DBH-3的基因组DNA，以通用引物27F和1492R进行扩增(Weisenburg et al.,1991，16S ribosomal DNA amplification forphylogenetic study.,Journal ofbacteriology,1991,173(2):697-703)，PCR反应体系见表1 。将16S rRNA测序的结果(见SEQ ID NO.1)与EzBioCloud数据库中检索(https://www.ezbiocloud.net/identify)，其与该数据库中最相近的序列分枝杆菌属的MycobacteriumporiferaeATCC 35087(T)(AF480589) 的相似度为99.06％。所述的分枝杆菌的16S rDNA的系统进化发育树见图1。
表1 基因组DNA的PCR反应体系
此外，基于Pacbio大文库构建和Pacbio测序，对DBH-3的测结果进行拼接组装，完成了全基因组的测序分析。结果显示DBH-3基因组大小为5.77Mb，G+C含量为67.89％.，基于COG和 KEGG数据注释分析结果显示，该菌有60个基因参与多环芳烃的降解，包括了常见的多环芳烃降解酶基因如双加氧酶α亚基nidA、双加氧酶β亚基nidB和脱氢酶nidD等，并鉴定出13个细胞P450色素酶基因，为DBH-3具有高效降解多环芳烃在分子生物学水平上提供了相应的证据。
将DBH-3命名为Mycobacterium sp.DBH-3，该菌株于2019年1月11日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，保藏编号：CCTCCNO: M 2019036。
实施例3分枝杆菌DBH-3降解多环芳烃的效率测定
由于自然环境中都是以多种多环芳烃混合形式的状态存在的，所以我们通过将三苯环的菲和四环荧蒽和芘混合(其分别浓度为100mg/L)，然后与分枝杆菌DBH-3(接种量为5％) 进行培养，并且设置实验组和对照组，对照组和实验组均以三苯环的菲和四环荧蒽和芘的液体培养基中培养，区别是对照组中无菌加入，而实验组中接入分枝杆菌DBH-3，每个实验组和对照组设3个重复，将两者放在同样的环境下进行培养，30℃、180rpm、培养12天，分析该菌对PAHs的去除率。使用40mL(2倍的培养液体积)乙酸乙酯对培养期间采取的样品进行萃取取样，收集萃取上清液。将萃取液旋转蒸发后用1mL的甲醇进行溶解，最后使用高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)进行分析。HPLC设置条件如下：使用IntertStill ODs 4.6×150mm色谱柱，流动相为80％甲醇(甲醇：水＝80：20v/v)，流速为1mL/min，UV探测器波长设置为275nm，进样量为10μL，柱温为40℃，结果显示 3天后的结果显示菲的去除率均为100％，12天荧蒽和芘的去除率为100％。
综上所述，本发明的分枝杆菌DHB-3具有高效的多环芳烃降解能力，其能够快速去除环境中的多种常见多环芳烃(二环、三环和四环)，因此有望应用于海洋滨海湿地生态系统的修复中。
序列表
<110> 中国科学院南海海洋研究所
<120> 一种高效降解多环芳烃的分枝杆菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1387
<212> DNA
<213> 分枝杆菌DBH-3(Mycobacterium sp.)
<400> 1
accatgcaag tcgaacggaa aggccctttc gggggtactc gagtggcgaa cgggtgagta 60
acacgtgggt gatctgccct gcactttggg ataagcctgg gaaactgggt ctaataccga 120
ataggactcc ggactgcatg gtctggggtg gaaagctttt gcggtgtggg atgggcccgc 180
ggcctatcag cttgttggtg gggtgatggc ctaccaaggc gacgacgggt agccggcctg 240
agagggtgtc cggccacact gggactgaga tacggcccag actcctacgg gaggcagcag 300
tggggaatat tgcacaatgg gcgcaagcct gatgcagcga cgccgcgtga gggatgacgg 360
ccttcgggtt gtaaacctct ttcgccaggg acgaagcgca agtgacggta cctggagaag 420
aagcaccggc caactacgtg ccagcagccg cggtaatacg tagggtgcga gcgttgtccg 480
gaattactgg gcgtaaagag ctcgtaggtg gtttgtcgcg ttgttcgtga aaactcacag 540
cttaactgtg ggcgtgcggg cgatacgggc agactggagt actgcagggg agactggaat 600
tcctggtgta gcggtggaat gcgcagatat caggaggaac accggtggcg aaggcgggtc 660
tctgggcagt aactgacgct gaggagcgaa agcgtgggga gcgaacagga ttagataccc 720
tggtagtcca cgccgtaaac ggtgggtact aggtgtgggt ttccttcctt gggatccgtg 780
ccgtagctaa cgcattaagt accccgcctg gggagtacgg ccgcaaggct aaaactcaaa 840
ggaattgacg ggggcccgca caagcggcgg agcatgtgga ttaattcgat gcaacgcgaa 900
gaaccttacc tgggtttgac atgcacagga cgccggcaga gatgtcggtt cccttgtggc 960
ctgtgtgcag gtggtgcatg gctgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc 1020
cgcaacgagc gcaacccttg tctcatgttg ccagcacgtt atggtgggga ctcgtgagag 1080
actgccgggg tcaactcgga ggaaggtggg gatgacgtca agtcatcatg ccccttatgt 1140
ccagggcttc acacatgcta caatggccgg tacaaagggc tgcgatgccg tgaggtggag 1200
cgaatccttt caaagccggt ctcagttcgg atcggggtct gcaactcgac cccgtgaagt 1260
cggagtcgct agtaatcgca gatcagcaac gctgcggtga atacgttccc gggccttgta 1320
cacaccgccc gtcacgtcat gaaagtcggt aacacccgaa gccggtggcc taaccccttt 1380
gtgggag 1387
Claims (7)
1.一种分枝杆菌（Mycobacterium sp.）DBH-3，其保藏编号为：CCTCC NO: M 2019036。
2.一种微生物制剂，其特征在于，所述的微生物制剂包含权利要求1所述的分枝杆菌DBH-3。
3.权利要求1所述的分枝杆菌DBH-3或权利要求2所述的微生物制剂在降解多环芳烃中的应用；所述多环芳烃为菲、荧蒽或芘。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，是将权利要求1所述的分枝杆菌DBH-3接种到含多环芳烃的培养体系中进行培养。
5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的培养，其培养条件为30℃、180rpm，多环芳烃浓度为100mg/L。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用为修复受多环芳烃污染的生态环境。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述生态环境为海洋环境。
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| 降解芘的分枝杆菌M11的分离鉴定和降解特性;李全霞等;《环境科学》;20080331;第29卷(第03期);第763-768页 * |
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