KR20130100532A - 유류 오염물질 분해능을 갖는 슈도모나스 니트로덕션―ｏｃｔｏ１ 균주 및 이를 이용한 유류 오염물질 분해 방법 - Google Patents

유류 오염물질 분해능을 갖는 슈도모나스 니트로덕션―ｏｃｔｏ１ 균주 및 이를 이용한 유류 오염물질 분해 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유류 오염물질 분해능을 갖는 슈도모나스 니트로덕션-OCTO1 균주(Pseudomonas nitrorducens-OCTO1)(기탁번호 :KACC91628P) 및 이를 이용한 유류 오염물질 분해 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, 경제적이고 효과적이며 환경 친화적으로 유류 오염물질을 분해하여 오염된 토양 등을 정화 및 복원할 수 있는 이점이 있다.

Description

유류 오염물질 분해능을 갖는 슈도모나스 니트로덕션―ＯＣＴＯ１ 균주 및 이를 이용한 유류 오염물질 분해 방법{Oil-degrading Pseudomonas nitrorducens-OCTO1 and method for oil degradation using the same}
본 발명은 유류 오염물질 분해능을 갖는 슈도모나스 니트로덕션-OCTO1 균주 및 이를 이용한 유류 오염물질 분해 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게 본 발명은 BTEX(Benzene, Toluene, Ethylbenzene, Xylene) 석유화합물과 같은 탄화수소계 유류 오염물질에 대하여 분해능이 우수한 슈도모나스 니트로덕션-OCTO1 균주, 및 이를 이용하여 경제적이고 효과적이며 환경 친화적으로 유류 오염물질을 분해하여 오염된 토양 등을 정화할 수 있는 토양 등의 복원정화 방법에 관한 것이다.
산업의 고도화와 함께 유기성 유해폐기물의 발생 및 유기성 용매의 사용량이 늘어남에 따라 이에 부적절한 관리 또는 누출 등에 의한 지하수 및 토양의 오염이 중요한 환경문제로 제기되고 있다. 이러한 물질들은 자연에서 분해가 아주 느리게 진행되거나 전혀 분해되지 않아 대부분 난분해성 물질로 분류되고 있다. BTEX (Benzene, Toluene, Ethylbenzene, Xylene) 화합물은 가솔린과 항공기 연료, 그리고 용매제로 폭넓게 이용되고 있어 사용량이 증가하고 있으며, 국내에서도 최근에 유류저장소, 석유관로, 사고로 인한 누출, 불법 폐기물 처리, 침출수 누출 등으로 인한 토양이나 지하수 오염물질로써 관심이 모아지고 있다. 이러한 물질들의 경우 잠재적 발암물질로 분류되고 있으며, 미국 환경청 (EPA)에서는 우선적으로 처리되어야 할 주요 오염 물질로 분류되어 있다 (U. S. EPA, 1997).
특히 현재 유류 등 화학 물질에 의해 오염된 토양을 방치하여 여러 가지 문제가 발생하고 있으며 지구 환경적 문제가 대두하면서 기오염된 토양이나 앞으로 발생될 오염된 토양은 반드시 복원 정화되어야 한다. 국내에서도 일부 시작단계에 있으며 선진국 사례를 참조하면 토양복원 시장이 급격히 성장할 것으로 예상된다.
유류오염지역을 정화하는 방안으로는 물리화학적 공정, 생물학적 공정 등이 있다. 국내에서도 토양환경보전법 및 지하수법이 제정되면서 우선적으로 유류오염지역 복원에 대한 연구가 시작되고 있고, 특히 물리·화학적 처리공정 연구가 주를 이루고 있다. 물리화학적인 토양처리방법은 처리효율 및 비용면에서 한계를 나타내고 있으며 2차 오염의 가능성이 크다. 따라서 그 대안으로서 생물학적 처리방법에 대한 연구가 활발하고, 오염물질 중 탄화수소를 근간으로 하는 유기화합물은 특정 분해미생물의 탄소원 및 에너지원으로 사용됨으로써 별도의 환경오염 없이 생분해(Biodegradation)가 가능한 특성이 있다. 미생물을 이용한 생분해 기술을 동반한 생물학적 정화방법 (Bioremediation)은 강한 물리적인 방법에 의한 것과 비교하여 유류의 분해가 빠르지 못하다는 단점이 있다. 그러나 생물학적 정화방법은 경제성 및 효율성이 비교적 우수하고 2차 피해가 없어 안전하기 때문에 최근 많은 연구가 이루어지고 있으며, 사용빈도도 증가하고 있다. 특히 국내에서는 태안 기름 유출사고시 유류분해 미생물을 주입해 모랫속에 스며들거나 바위틈에 박혀 눈에 보이지 않는 기름을 제거해 환경 복원을 앞당기기 위한 생물정화 기법을 사용하였다. 토양오염의 정화를 위해 다양한 미생물 균주를 사용하였는데 그중 슈도모나스 균주가 토양오염화합물의 분해에 효과가 있다고 알려져 있다.
본 발명의 배경이 되는 기술로는 대한민국 공개특허공보 제10-2003-0016437호(2003.03.03)에 광범위한 탄화수소류와 그 혼합물에 대해 분해 능력을 가진 슈도모나스 스투쯔리 균주가 개시되어 있고, 대한민국 등록특허공보 제10-0435231호(2004.06.09)에 신규한 중저온 유류분해 균주 로도코커스 sp. YHLT-2KCTC 10203BP 균주 및 이를 이용한 생물학적 유류 제거방법이 개시되어 있다.
미생물 이용한 생물학적 정화방법은 유류 분해능력이 우수한 미생물 확보가 관건이므로 오염물질 분해능이 우수하고 경제적이고 안전한 새로운 유류 오염물질 분해미생물에 대한 요구가 있어 왔다.
대한민국 공개특허공보 제10-2003-0016437호(2003.03.03) 대한민국 등록특허공보 제10-0435231호(2004.06.09)
본 발명은, 상기 종래 기술의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 유류오염지역에서 채취한 토양샘플을 이용하여, BTEX 석유화합물(Benzene, Toluene, Ethylbenzene, Xylene) 분해에 탁월한 균주를 동정하였으며, 그 능력을 확인하여 실제 오염된 토양에서 복원제를 이용하여 효과적으로 2차적인 피해가 없이 안전하고, 고가의 비용을 들이지 않고 복원이 이루어질 수 있도록 하는 기술을 개발하고자 한다.
따라서 본 발명의 목적은 우수한 탄화수소계 유류분해능을 갖는 신규 미생물 슈도모나스 니트로덕션-OCTO1 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기한 미생물을 이용한 유류 오염물질을 분해하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.
본 발명자들은 유류에 오염된 토양에서 오염물질 분해가 가능한 여러 종류의 미생물을 찾아내고 각각의 미생물들의 분해능을 비교 분석하여 분해능이 우수한 균주를 분리하였는바, 분리된 신균주인 슈도모나스 니트로덕션 OCTO-1(국립농업과학원 농업유전자원센터 기탁번호 KACC91628P)가 유류 오염물질 분해능이 매우 우수함을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 일 양태에 의하면, 본 발명은 유류 오염물질 분해능을 갖는 슈도모나스 니트로덕션-OCTO1 균주(Pseudomonas nitrorducens-OCTO1)(기탁번호 :KACC91628P)을 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 의하면, 본 발명은 슈도모나스 니트로덕션-OCTO1 균주(Pseudomonas nitrorducens-OCTO1)(기탁번호 :KACC91628P)를 유류 오염물질에 접종하는 단계를 포함하는 유류 오염물질을 분해하는 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 이에 한정되는 것은 아니나 상기 유류는 탄화수소계인 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 상기 유류는 벤젠, 톨루엔, 에틸벤젠, 자일렌 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명에 있어서, 이에 한정되는 것은 아니나, 상기 유류는 예를 들어 유류 수송 과정이나 저장시설로부터 유출된 유류로 토양, 퇴적물, 지하수, 해양, 해안가 등에 오염된 유류이다. 바람직하게는 상기 유류는 토양에 오염된 유류 또는 지하수에 오염된 유류이다.
본 발명의 또 다른 양태에 의하면, 본 발명은 유류 오염 물질 분해능을 갖는 슈도모나스 니트로덕션-OCTO1 균주(Pseudomonas nitrorducens-OCTO1)(기탁번호: KACC91628P)를 유효성분으로 포함하는 유류 오염물질 분해 미생물 제제를 제공한다. 유류 오염 물질을 분해하기 위해, 슈도모나스 니트로덕션-OCTO1 균주의 액체 배양액, 동결건조 균체 또는 슈도모나스 니트로덕션-OCTO1 균주를 이용하여 만든 액체 또는 고형물 형태의 미생물 제제를 사용할 수 있다. 이에 한정되는 것은 아니나, 액체 형태의 미생물 제제는 슈도모나스 니트로덕션-OCTO1 균체에 자당, 스킴 밀크 및 효모추출액을 첨가한 다음 물을 첨가하여 제조하고, 고체 형태의 미생물제제는 슈도모나스 니트로덕션-OCTO1 균체를 벤토나이트 혹은 셀라이트에 흡착시켜 제조한다. 또한 분말 형태의 미생물 제제는 고체 형태의 미생물 제제를 볼밀 등을 사용하여 분말형태로 제조한다.
상술한 바와 같이, 본 발명은, 유류에 오염된 토양을 복원하는 방법으로서 유류에 오염된 토양에서 오염물질 분해가 가능한 여러 종류의 미생물을 찾아내고 각각의 종류 중에서 비교 분석결과 분해능이 우수한 균주를 찾아서 이를 통해 효과적인 신균주를 제공하여 이를 이용한 토양오염 정화 효과분석과 동시에 효율을 더욱더 높이기 위한 방법을 제공한다.
상술한 바와 같이, 본 발명에 의한 슈도모나스 니트로덕션-OCTO1 균주는 BTEX(Benzene, Toluene, Ethylbenzene, Xylene) 석유화합물과 같은 탄화수소계 유류 오염물질에 대하여 분해능이 매우 우수하여 이를 이용하여 경제적이고 효과적이며 환경 친화적으로 유류 오염물질을 분해하여 오염된 토양을 정화할 수 있는 효과를 도모할 수 있다.
도 1 및 도 2는 본 발명에 의한 슈도모나스 니트로덕션 OCTO-1(기탁번호 KACC91628P) 의 유류 분해 효율을 대조균과 비교한 결과를 나타낸 도면이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 본 발명의 미생물 균주의 분리 및 동정
본 발명의 미생물 균주는 유류에 오염된 토양 (채취 지역 : 인천오염지역)에서 분리되었다. 상기 분리된 균주는 먼저 그람염색을 통한 현미경 상에서의 형태학적 관찰과 16S rRNA 염기서열 해독을 통한 염기서열 해독을 실시하고 해독된 염기서열은 NCBI의 BLAST database에서 검색을 통해 미생물을 동정했다. 분리균의 형태는 광학현미경(Olympus x40)을 이용하여 관찰하였다. 16S rRNA 염기서열 해독 후 동정결과 슈도모나스 니트로덕션(Pseudomonas nitroreducens) 신규주임을 확인할 수 있었다. 본 발명에 의한 신규한 균주는 슈도모나스 니트로덕션 OCTO-1로 명명하고, 국립농업과학원 농업유전자원센터에 기탁번호 KACC91628P로 기탁하였다.
실시예 2. 미생물 균주의 배양
실시예 1에 따라 오염된 토양에서 추출한 여러 가지 균주 중에서 슈도모나스 균주(Pseudomonas nitroreducens) 등 미생물 균주를 LB 배지 및 R2A 배지에서 37℃에서 배양하였다.
상기 미생물 균주를 다시 100mL의 양으로 24시간 배양한 후 파장 600nm의 광학흡광도(O.D.600) 및 0.7을 나타내는 배양농도에서 세균을 5500rpm의 속도로 원심분리하였다. 이 원심분리된 세균을 동일한 배양액 부피의 PBS로 현탁하였다.
실시예 3. 본 발명에 의한 슈도모나스 니트로덕션 OCTO -1(기탁번호 KACC91628P) 균주의 BTEX 석유화합물 제거능력 측정
본 발명에 의한 슈도모나스 니트로덕션 OCTO-1(기탁번호 KACC91628P) 균주의 유류오염 제거효율을 확인하기 위해서, 대표적인 유류 토양 오염물질인 BTEX 석유화합물에 같이 배양시키면서 그 제거 효율을 알아보았다. 효율을 알아보기 위해 본 발명에 의한 슈도모나스 니트로덕션 OCTO-1(기탁번호 KACC91628P) 균주와 또 다른 슈도모나스 균주의 효율성을 각각 비교 분석하였다. BTEX 혼합물의 양은 크로마토그래피법으로 분석하였다. 그 결과를 도 1, 도 2 및 표 1에 나타내었다. 도 1, 도 2 및 표 1에 나타난 바와 같이, 본 발명에 의한 슈도모나스 니트로덕션 OCTO-1(기탁번호 KACC91628P) 균주는 다른 슈도모나스 균주에 비해 BTEX 석유화합물을 매우 효율적으로 분해할 수 있음을 확인하였다.
Figure pat00001
또한 본 발명은 유류 오염물질의 제거가 가능한 균주 중에 5가지를 정하여 어느것이 가장 효과적인지를 알아보는 실험을 하였다. 먼저 석유의 80%를 이루는 유류성분인 BTEX 석유화합물 물질 각각의 성분요소인 (Benzene, Toluene, Ethylbenzene, Xylene)을 M9 배지에 넣어 준 후 하루 정도 섞어준 후 실험을 하였다. BTEX는 잘 섞이지 않는 액체물질이라서 약 24시간 정도 혼합한 후 실험을 하였다.
그리고 나서 섞인 물질에 각각의 토양미생물을 1mL씩 넣어주고, 약 5일 후의 결과를 표 2 ~ 표 8에 나타내었다. 각 4가지의 균주들 중 Pseudomonas taiwaneniss에 의해서는 70~80% 정도가 제거된 것을 알 수 있었고, Micrococcus yunnanensis, Acinetobacter tandoii, 및 Acinetobacter baumannii 3 균주도 BTEX 분해 능력은 보였으나 각각 15~20%, 25~30%의 각각 화합물의 제거효율을 나타낸 것을 알 수 있었다. 이에 비해 본 발명에 의한 슈도모나스 니트로덕션 OCTO1(Pseudomonas nitroreducens OCTO1) 균주에 의해 톨루엔 및 에틸벤젠은 100% 제거되는 모습을 보였고, 벤젠과 자일렌에 대해서도 고효율의 제거율을 보였다(표 5).
Control (Initial)
BTEX Concentration (mg/L)
Benzene 28.1
Toluene 25.4
Ethylbenzene 21.0
Xylene 21.6
Control
BTEX Concentration (mg/L)
Benzene 29.9
Toluene 26.8
Ethylbenzene 21.5
Xylene 21.8
Pseudomonas taiwaneniss BCRC 17751
BTEX Concentration (mg/L) Removal (C/C0)
Benzene 4.0 0.87
Toluene 2.8 0.90
Ethylbenzene 3.1 0.86
Xylene 13.3 0.39
Pseudomonas nitroreducens OCTO1
BTEX Concentration (mg/L) Removal (C/C0)
Benzene 8.9 0.70
Toluene 0.0 1.00
Ethylbenzene 0.0 1.00
Xylene 10.4 0.53
Micrococcus yunnanensis YIM 65004
BTEX Concentration (mg/L) Removal (C/C0)
Benzene 27.4 0.08
Toluene 23.1 0.14
Ethylbenzene 17.7 0.18
Xylene 19.4 0.11
Acinetobacter tandoii 4N13
BTEX Concentration (mg/L) Removal (C/C0)
Benzene 22.9 0.23
Toluene 17.4 0.35
Ethylbenzene 2.2 0,90
Xylene 18.1 0.17
Acinetobacter baumannii DSM 30007
BTEX Concentration (mg/L) Removal (C/C0)
Benzene 22.2 0.26
Toluene 18.9 0.29
Ethylbenzene 12.3 0.43
Xylene 15.3 0.30
이상에서 설명한 본 발명은 전술한 실시예 및 도면에 의해 한정되는 것은 아니고, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 여러 가지 치환, 변형 및 변경이 가능함은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 명백할 것이다.
농업생명공학연구원 KACC91628 20110113

Claims (4)

  1. 유류 오염물질 분해능을 갖는 슈도모나스 니트로덕션-OCTO1 균주(Pseudomonas nitrorducens-OCTO1)(기탁번호 :KACC91628P).
  2. 슈도모나스 니트로덕션-OCTO1 균주(Pseudomonas nitrorducens-OCTO1)(기탁번호 :KACC91628P)를 유류 오염물질에 접종하는 단계를 포함하는 유류 오염물질을 분해하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 유류는 탄화수소계인 것을 특징으로 하는 유류 오염물질을 분해하는 방법.
  4. 유류 오염 물질 분해능을 갖는 슈도모나스 니트로덕션-OCTO1 균주(Pseudomonas nitrorducens-OCTO1)(기탁번호 :KACC91628P)를 유효성분으로 포함하는 유류 오염물질 분해 미생물 제제.
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