KR20220159775A - 아산화질소 환원능을 가진 신규한 슈도모나스 속 균주 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 신규한 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) M23 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명을 통해 분리된 상기 신규한 슈도모나스 속 M23 균주는 우수한 디젤 분해능 및 아산화질소 환원능을 가졌으며, 이를 통해 유류 오염 정화 또는 아산화질소 환원을 각각 수행할 수 있을 뿐만 아니라, 유류 오염 정화와 동시에 아산화질소 환원을 동시에 수행할 수 있음을 확인한 바, 본 발명에 따른 슈도모나스 속 M23 균주는 석유계 탄화수소(Petroleum hydrocarbons, PHs)에 의한 오염 정화 및/또는 아산화질소의 배출 저감 방법에 유용하게 활용할 수 있다.
Description
본 발명은 아산화질소 환원능을 가진 신규한 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) M23 균주 및 이를 이용한 유류 오염 정화와 온실가스 배출 저감 방법에 관한 것이다.
원유 또는 정제유 유래 석유계 탄화수소(Petroleum hydrocarbons, PHs)는 인간과 생태계를 위협하는 대표적인 환경오염 물질로, 특히 토양과 지하수로 유입되는 경우 생태적 기능을 심각하게 저하시키는 것으로 알려져 있다. 석유 및 LNG 등의 액체를 저장하는 지하탱크의 누출, 유조선의 해난사고 등으로 인한 기름 유출, 수송 과정 및 산업 공정에서의 배출 등으로 인해 PHs 오염이 발생한다.
독성 및 복잡한 화학 조성을 가지는 PHs에 의해 오염된 토양의 정화 기술은 크게 물리 및 화학적 처리 또는 생물학적 처리로 구분할 수 있다. 물리 및 화학적 처리방법은 오염을 신속하게 처리할 수 있고, 추가적인 오염물질의 확산을 막을 수 있다는 장점이 있다. 그러나 물리 및 화학적 처리는 처리 과정에서 환경이 파괴될 수 있고, 막대한 에너지 및 비용이 소모되는 단점이 있어, 국민 수용성(public acceptance)이 낮은 제한점이 있다.
생물학적 처리기술은 이러한 물리 및 화학적 정화기술의 한계를 극복할 수 있는 기술로서, 친환경적이고 경제적이며 자연경관의 심미성 증대 등과 같은 부가가치가 창출된다는 장점을 지닌다. 더불어 생물의 자연적인 대사활동에 의존하는 방법이기 때문에 투입되는 노동 및 에너지의 양이 적으며, 일반적으로 PHs를 CO2나 H2O로 전환시키는 완전 무기화작용(mineralization)이 촉진되기 때문에 2차 오염물질의 발생 문제가 없다.
상기 생물학적 처리기술은 오염물질의 분해를 담당하는 미생물의 외부공급 여부에 따라 생물 자극법(영양분 및 전자수용체공급, (Biostimulation))과 생물증대법(미생물공급, (Bioaugmentation))으로 분류할 수 있다. 생물 자극법은 영양 염류와 산소를 공급하여 오염 토양 내에 존재하는 토착미생물을 활성화시켜 오염물질 분해를 유도하는 것으로서, 생물증대법에 비하여 처리시간이 길며 이에 소요되는 비용도 대체적으로 높은 편이다. 반면 생물증대법은 유류 분해능을 가진 미생물을 직접 오염현장에 주입함으로써 처리시간을 단축시킬 수 있다.
한편, 상기 기술을 이용한 기존 연구들은 오염물인 PHs 제거 효율에만 초점을 맞추어 기술 개발을 수행하고 있다. 하지만 최근에는 기후변화 대응 및 완화를 위해 에너지 분야뿐 아니라 환경정화기술 개발에 있어 온실가스 배출을 최소화하는 기후변화 대응 기술에 대한 요구도 증대되고 있다. 온실가스 중 아산화질소(nitrous oxide, N2O)는 이산화탄소(Carbon dioxide, CO2)보다 지구온난화지수(global warming potential)가 310배 높은 대표적인 CO2가 아닌 온실가스(non-CO2 Greenhouse gas, non-CO2 GHGs)이다.
아산화질소는 성층권 오존층을 파괴하는 물질로, 온실가스 관리 분야뿐 아니라 오존층 연구 분야에서도 아산화질소의 배출 조절 및 저감 방법은 앞으로 점점 더 중요성이 커질 것으로 전망된다. 현재 화석연료 사용량, 농업 등 인위적인 생물학적 질소 고정량이 증가하고 있으며, 화학공정에 의한 비료 생산량도 증가하고 있기 때문에 대기 중 아산화질소 농도가 점점 증가하고 있다. 기후변화 시나리오 예측에 의하면 2100년 대기 중 아산화질소 농도는 345~435 ppb까지 증가할 것으로 전망되고 있어, 아산화질소 배출량을 저감하기 위한 다각적인 측면의 노력이 필요하다.
따라서 PHs 정화뿐만 아니라 아산화질소 저감에도 활용할 수 있는, 다방면에 활용될 수 있는 오염원 정화 기술의 개발이 필요하다.
본 발명자들은 석유계 탄화수소에 의한 오염 정화 및/또는 아산화질소 배출 저감 방법에 대하여 연구하던 중, 신규한 슈도모나스 속 균주를 분리하고, 이의 아산화질소 환원능 및 디젤 분해능을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 신규한 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 유류 오염 정화용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 유류 오염 정화 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 아산화질소 저감용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 아산화질소 저감 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) M23 균주(KCTC14572BP)를 제공한다.
또한 상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) M23 균주(KCTC14572BP)를 유효성분으로 포함하는, 유류 오염 정화용 조성물을 제공한다.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) M23 균주(KCTC14572BP)를 유류 오염원에 처리하는 단계를 포함하는, 유류 오염 정화 방법을 제공한다.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) M23 균주(KCTC14572BP)를 유효성분으로 포함하는, 아산화질소 저감용 조성물을 제공한다.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) M23 균주(KCTC14572BP)를 아산화질소 발생원에 처리하는 단계를 포함하는, 아산화질소 저감 방법을 제공한다.
본 발명은 신규한 슈도모나스 속 M23 균주 및 이의 활성에 대한 것으로, 본 발명에 따른 신규한 슈도모나스 속 M23 균주는 우수한 디젤 분해능 및 아산화질소 환원 능력을 보이며, 이를 동시에 수행할 수 있는 바, 2차 오염물질의 발생 문제없이 석유계 탄화수소(Petroleum hydrocarbons, PHs)에 의한 오염 정화 및/또는 아산화질소의 배출 저감 방법에 유용하게 활용할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 슈도모나스 속 M23 균주의 아산화질소 환원능을 확인한 결과이다.
도 2는 본 발명에 따른 슈도모나스 속 M23 균주의 디젤 분해능을 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명에 따른 슈도모나스 속 M23 균주와 다른 슈도모나스 속 균주의 아산화질소 환원능을 비교한 결과이다.
도 2는 본 발명에 따른 슈도모나스 속 M23 균주의 디젤 분해능을 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명에 따른 슈도모나스 속 M23 균주와 다른 슈도모나스 속 균주의 아산화질소 환원능을 비교한 결과이다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) M23 균주(KCTC14572BP)를 제공한다.
상기 슈도모나스 속 M23 균주는 본 발명자들에 의해 새로이 동정된 미생물로서, 우수한 아산화질소 환원능력 및 디젤 분해능을 가지고 있어, 생물학적인 방법으로 효과적으로 유류 오염 정화 및 아산화질소 저감에 유용하게 활용할 있는 미생물이다.
본 발명자들은 토양 농화배양액으로부터 아산화질소 환원 활성이 현저히 우수한 균주를 분리하고 상기 균체의 DNA를 추출해 동정한 결과, 슈도모나스 속의 신규 균주임을 확인하였으며, 이를 M23균주라 명명하였다. 본 발명의 발명자들은 상기 슈도모나스 속 M23 균주를 2021년 05월 18일자로 생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 기탁하여 기탁번호 KCTC14572BP를 부여받았다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명에 따른 슈도모나스 속 M23 균주는 아산화질소(N2O)가 질소(N2)로 생성되는 과정에 관여하는 nosZI(nitrous oxide reductase gene I) 기능성 유전자를 33.42±1.40 GCN(gene copy number)·mg-dry cell-1 보유하고 있음을 확인하였다.
더불어 본 발명의 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 슈도모나스 속 M23 균주는 최종 농도 1000 ppm의 N2O 가스에 대하여 우수한 N2O 환원 능력을 보여주었고, 1.00 mmol·g-dry cell-1·h-1의 N2O 환원속도를 보여주었다.
또한 본 발명의 또다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 슈도모나스 속 M23 균주는 디젤 150 μL에 대하여, 14일 동안 50%의 디젤 분해능(TPH removal efficiency)을 보여주었다.
따라서 본 발명의 슈도모나스 속 M23 균주는 아산화질소 환원능을 가지고 있으며, 유류 분해능 또한 가지고 있음을 특징으로 한다.
더불어 본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 디젤 분해 및 아산화질소 환원 동시 수행에 대하여 확인해 본 바, 본 발명에 따른 슈도모나스 속 M23 균주를 접종한 군에서 85%의 디젤 분해 효율, 95%의 N2O 환원 효율을 확인하였다.
따라서 본 발명에 따른 슈도모나스 속 M23균주는 유류 오염 정화 또는 아산화질소 환원을 각각 수행할 수 있을 뿐만 아니라, 유류 오염 정화와 동시에 아산화질소 환원을 동시에 수행할 수 있음을 확인한 바, 본 발명에 따른 슈도모나스 속 M23 균주는 석유계 탄화수소(Petroleum hydrocarbons, PHs)에 의한 오염 정화 및/또는 아산화질소의 배출 저감 방법에 유용하게 활용할 수 있다.
따라서 본 발명은 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) M23 균주(KCTC14572BP)를 유효성분으로 포함하는, 유류 오염 정화용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 미생물 제제일 수 있다. 본 발명의 미생물 제제는 유효성분으로 슈도모나스 속 M23 균주(KCTC14572BP) 또는 그 배양액을 함유하는 것을 특징으로 하며, 상기 균주 또는 그 배양액을 함유하기만 하면 다양한 형태로, 다양한 부형제를 첨가하여 제조될 수 있다. 즉, 미생물 제제의 제조를 위해 필요하다면 담체 등을 사용할 수 있고, 미생물의 초기 생육을 담보할 수 있는 영양원 등이 같이 첨가될 수 있다. 상기 담체는 균체 흡착, 활성유지, 환경에서의 안정화를 위해 첨가하며, 다공성, 흡착성 및 내구성이 우수한 소재를 사용할 수 있고, 영양물질은 미생물의 활성화를 위해 첨가하는 것으로 질소, 인 또는 황의 무기염류와 아연, 구리, 코발트, 셀레늄 등의 미네랄을 사용할 수 있다. 보조제는 토양 또는 수질의 pH 교정, 수분유지, 염류장해 완화 등의 목적으로 첨가하여 사용할 수 있다. 또한, 제형의 제조에 있어서 필요할 경우, 전분을 비롯한 다양한 형태의 바인더를 사용하여 펠렛 형태로 제조할 수도 있다. 미생물 제제의 제조에 관한 일반적인 사항은 당업계의 통상의 지식을 이용할 수 있음은 당업자에게 자명할 것이다.
상기 유류는 탄소수 10개 이상의 고분자 석유계 탄화수소를 포함하는 것일 수 있으며, 디젤, 항공유, 휘발유, 등유, 경유 및 중유로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 석유계 유류일 수 있다.
더불어 상기 유류는 바람직하게는 탄소수 11 내지 16의 고분자 석유계 탄화수소를 포함하는 유류일 수 있고, 보다 바람직하게는 디젤(disel)일 수 있다.
또한 본 발명은 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) M23 균주(KCTC14572BP)를 유류 오염원에 처리하는 단계를 포함하는, 유류 오염 정화 방법을 제공한다.
보다 구체적으로, 본 발명에 따른 슈도모나스 속 M23 균주(KCTC14572BP)를 유류로 오염된 환경에 적절하게 처리하여 오염을 정화시킬 수 있는데, 사용량은 오염 정도 및 대상 환경에 따라 적절하게 가감할 수 있다. 상기 유류 오염원은 토양, 강, 지하수로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어 상기 유류 오염원이 토양일 경우, 총 석유탄화수소농도로 5,000 내지 30,000 mg/kg 평균 오염도를 가진 유류 오염 토양에 대하여, 오염 토양 1kg 당 M23 균주 농도가 약 108 내지 109 CFU가 되도록 처리하여 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 슈도모나스 속 M23 균주를 이용한 유류 오염 정화 방법에 있어서, 상기 유류 오염원이 토양인 경우 평균 오염도는 15,000 내지 20,000 mg/kg-dry soil일 수 있으며, 유류 분해를 위한 슈도모나스 속 M23 균주의 배양 온도는 28 내지 30℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
투여 방법은 특별한 제한은 없으나, 넓은 면적의 오염원에 적용될 경우 소방차, 헬리콥터 등을 이용하여 골고루 살포할 수 있고, 좁은 면적의 오염원에는 분무기 등을 이용하여 골고루 살포할 수 있다. 오염원이 토양일 경우, 살포 후에는 정기적으로 경작기를 이용하여 토양층을 뒤집어주는 경작법 등을 추가로 수행하여 정화처리할 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) M23 균주(KCTC14572BP)를 유효성분으로 포함하는, 아산화질소 저감용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 미생물 제제일 수 있다. 유효성분으로 슈도모나스 속 M23 균주(KCTC14572BP) 또는 그 배양액을 함유하는 것을 특징으로 하며, 상기 균주 또는 그 배양액을 함유하기만 하면 다양한 형태로, 다양한 부형제를 첨가하여 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 아산화질소 저감용 조성물에 포함될 수 있는 물질은 상기에 서술한 바와 같다.
더불어 본 발명은 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) M23 균주(KCTC14572BP)를 아산화질소 발생원에 처리하는 단계를 포함하는, 아산화질소 저감 방법을 제공한다.
상기 아산화질소 발생원은 농업 및 폐수처리 시설과 같은 인위적 아산화질소 배출원 등 아산화질소를 발생시키는 자연적, 인위적 발생원을 제한없이 포함한다.
본 발명의 슈도모나스 속 M23 균주를 이용한 아산화질소 저감 방법에 있어서, 아산화질소 발생원의 C/N 비율은 50 내지 60 mol·mol-1일 수 있다. 더불어 본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 슈도모나스 속 M23 균주의 250 ppm, 500 ppm, 750 ppm, 1000 ppm 또는 1500 ppm의 아산화질소 농도에 따른 아산화질소 환원속도를 확인해 본 바, 1500 ppm의 조건에서 가장 빠른 환원속도를 보임을 확인하였다. 따라서 본 발명의 슈도모나스 속 M23 균주의 아산화질소 환원 속도를 증가시킬 수 있는 최적 아산화질소 농도는 1500 ppm 이상이 바람직하다.
상술한 본 발명의 내용은 상호 모순되지 않는 한, 서로 동일하게 적용되며, 당해 기술분야의 통상의 기술자가 적절한 변경을 가해 실시하는 것 또한 본 발명의 범주에 포함된다.
이하 본 발명을 실시예를 통해 상세하게 설명하나 본 발명의 범위가 하기 실시예로만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. M23 균주 분리
토양 농화배양액을 채취하여 멸균한 증류수로 10배씩 연속희석 후 DifcoTM LB(Lysogeny broth) 아가(Agar) 플레이트(트립톤(Tryptone) 10.0 g·L-1, 효모 추출물(Yeast Extract) 5.0 g·L-1, 소듐 클로라이드(Sodium Chloride) 10.0 g·L-1, 아가(Agar) 15.0 g·L-1)에 도말하였다. 이를 30 ℃에서 48시간 동안 배양한 후, 단일 콜로니(Colony)를 무작위로 선택해 새로운 LB 아가 배지에 사분 도말법으로 배양했다. 최종적으로 24개의 균주를 분리했다.
분리한 24개의 균주 중에서 N2O 환원 능력이 있는 균주를 선별하기 위해 120 mL 혈청병에서 N2O 환원능 평가를 실시하였다. 10 mL의 N2O 배지 (KH2PO4 169.7 mg·L-1, MgSO4·7H2O 571.1 mg·L-1, CaCl2·2H2O 451.6 mg·L-1, EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid) 5.0 mg·L-1, FeSO4·7H2O 5 mg·L-1, 미량원소(Trace element) 용액 1 mL·L-1 )를 혈청병에 넣고, 각각의 균주를 접종하였다. 탄소원으로 글루코오스(glucose)와 소듐 아세테이트(sodium acetate)를 각각 100 mg/L씩 첨가하였다. 혈청병의 내부 공기를 질소 가스로 치환한 후, 부틸고무로 밀폐하였다. 실린지를 이용하여 N2O 가스를 최종 농도가 1000 ppm이 되도록 혈청병에 첨가한 후, 30 ℃, 120 rpm에서 배양하였다. 혈청병 상부 가스를 실린지로 이용하여 주기적으로 채취하여, N2O 농도를 가스크로마토그래피(ECD 검출기)를 이용하여 측정하였다. N2O 환원 능력을 보인 균주 중에서 가장 우수한 활성을 보인 균주를 선별하여 M23으로 명영하였다.
실시예 2. 슈도모나스 속(
Pseudomona
s sp). M23 균주 동정
M23 균주로부터 DNA를 추출하기 위해 단일 콜로니를 1.5 mL 튜브에 옮긴 후, 15 μL 멸균수와 섞어주었다. 이 후, 95 ℃에서 15분간 열처리를 3회 반복 수행하였다. 추출된 DNA 용액을 PCR 수행을 위한 주형 템플레이트(template) DNA로 사용하였다. PCR 반응을 위하여, 27F(5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3')와 1492R(5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3')의 프라이머(primer)를 사용하였다. PCR은 94 ℃에서 3분간 초기 변성(initial denaturation), 94 ℃에서 30초간 변성(denaturation), 50 ℃에서 30초간 어닐링(anealing), 72 ℃에서 30초간 신장(extension) 과정을 30 사이클(Cycle) 반복한 후, 72 ℃에서 5분간 최종 신장(Final extension)하는 조건으로 수행하였다.
PCR 생성물의 염기서열 분석은 마크로젠(Macrogen (서울, 한국))에 의뢰하여 수행하였다. 분석된 염기서열을 BioEdit v7.2.6.0(Bioedit Sequence Alignment Editor)프로그램을 이용해 정렬하였다. 이 후 NCBI의 Blast 프로그램을 통해 상기 염기서열을 이용하여 M23 균주를 동정한 결과, 슈도모나스 속에 속하는 것으로 판단되었다.
본 발명의 발명자들은 상기 슈도모나스 속 M23 균주를 2021년 05월 18일자로 생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 기탁하여 기탁번호 KCTC14572BP를 부여받았다.
실시예 3. 슈도모나스 속 M23 균주의 N
2
O 환원 속도 측정
슈도모나스 속 M23 균주의 N2O 환원 속도를 측정하기 위하여, M23 균주를 DifcoTM LB 배지(트립톤 10.0 g·L-1, 효모 추출물 5.0 g·L-1, 소듐 클로라이드 10.0 g·L-1)에 접종한 후, 30 ℃, 120 rpm에서 12시간동안 전배양하였다. 전배양액을 4,000 rpm에서 원심분리한 후 회수한 균체를 멸균수로 세척하였다. 인산 완충액(Phosphate buffer(NaCl 8.0 g·L-1, KCl 0.2 g·L-1, Na2HPO4 1.44 g·L-1, KH2PO4 0.24 g·L-1))에 세척한 세포 펠렛(cell pellet)을 현탁하여 최종 OD600nm를 1로 맞추었다. 120 mL 혈청병에 8mL의 N2O 배지(KH2PO4 169.7 mg·L-1, MgSO4·7H2O 571.1 mg·L-1, CaCl2·2H2O 451.6 mg·L-1, EDTA 5.0 mg·L-1, FeSO4·7H2O 5 mg·L-1, 미량원소 1 mL·L-1)를 넣고, 2mL의 균체 현탁액을 접종하였다. 탄소원으로 글루코오스와 소듐 아세테이트를 각각 100 mg/L씩 첨가하였다. 혈청병의 내부 공기를 질소 가스로 치환한 후, 부틸고무로 밀폐하였다. 실린지를 이용하여 N2O 가스의 최종 농도가 1000 ppm이 되도록 혈청병에 첨가한 후, 30 ℃, 120 rpm에서 배양하였다. 혈청병 상부 가스를 실린지로 이용하여 주기적으로 채취하여, N2O 농도를 가스크로마토그래피(ECD 검출기)를 이용하여 측정하였다. 측정된 가스상의 N2O 농도(ppm)를 통해 배양액 중에 용존되어 있는 N2O 농도를 헨리상수(KH)를 이용해 구하였다(하기 수학식 1 참고).
[수학식 1]
Caq,N2O = Cg,N2O ·KH ·RT
상기 수학식 1에 있어서, Caq,N2O는 용존 N2O의 농도, Cg,N2O는 기체상의 N2O의 농도, KH는 헨리상수, R은 기체상수, T는 온도(K)를 의미한다.
상기 수학식 1을 통해 계산한 용존 N2O 농도와 측정된 가스상의 N2O 농도를 합산하여 최종 N2O 농도를 계산하였다.
상기와 같이 시간 경과에 따른 N2O 잔류량 변화를 도 1에 나타내었다. 그 결과, 슈도모나스 속 M23 균주를 접종하지 않은 대조군 대비 M23 균주를 접종한 실험군에서 N2O 잔류량 감소가 명확하게 확인되었다. 더불어 도 1의 그래프의 기울기로부터 산출한 M23 균주의 N2O 환원속도는 1.00 mmol·g-dry cell-1·h-1이었다.
실시예 4. 슈도모나스 속 M23 균주의 N
2
O 환원에 관여하는 기능성 유전자의 정량 평가
슈도모나스 속 M23 균주의 N2O 환원에 관여하는 기능성 유전자인 nosZI를 정량 평가하기 위해 M23 균주를 LB 배지에서 30 ℃, 120 rpm 조건에서 12시간 배양하였다. 균주 배양액 2mL를 원심 분리하여 세포 펠렛을 수득하였다. 수득한 세포 펠렛으로부터 NucleoSpin® DNA soil kit의 방법에 따라 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA를 이용해 실시간 PCR(real-time PCR, qPCR)을 수행하였다. qPCR은 하기 표 1의 조건에 따라 수행하였으며, 이를 위하여 nosZI-F(5'-WCSYTGTTCMTCGACAGCCAG-3')와 nosZI-R(5'-ATGTCGATCARCTGVKCRTTYTC-3') 프라이머를 사용하였다.
| 온도 ( o C) | 시간 | ||
| 초기 변성 | 95 | 5 분 | |
| 변성 | 95 | 30 초 | |
| 어닐링 | 56 | 30 초 | 40 사이클 (cycle) |
| 신장 | 72 | 1 분 | |
| Reading step | 82 | 30 초 |
탈질화 반응은 질산(NO3-), 아질산(NO2-), 산화질소(NO), 아산화질소(N2O), 질소(N2)의 순서대로 진행된다. 여기서, nosZI 유전자는 아산화질소(N2O)가 질소(N2)로 생성되는 과정에 관여한다. qPCR 결과, 본 발명에 따른 슈도모나스 속 M23 균주는 nosZI 기능성 유전자를 33.42±1.40 GCN(gene copy number)·mg-dry cell-1 보유하고 있음을 확인하였다.
실시예 5. 슈도모나스 속 M23 균주의 N
2
O 농도에 따른 N
2
O 환원 속도 측정
본 발명에 따른 슈도모나스 속 M23 균주의 N2O 농도에 따른 환원 속도를 측정하기 위하여, M23 균주를 DifcoTM LB 배지(트립톤 10.0 g·L-1, 효모 추출물 5.0 g·L-1, 소듐 클로라이드 10.0 g·L-1)에 접종한 후, 30 ℃, 120 rpm에서 12시간동안 전배양하였다. 전배양액을 4,000 rpm으로 원심분리한 후 회수한 균체를 멸균수로 세척하였다. PBS 버퍼(NaCl 8.0 g·L-1, KCl 0.2 g·L-1, Na2HPO4 1.44 g·L-1, KH2PO4 0.24 g·L-1)에 세척한 세포 펠렛(cell pellet)을 현탁하여 최종 OD600nm를 1로 맞추었다. 120 mL 혈청병에 8mL의 N2O 배지(KH2PO4 169.7 mg·L-1, MgSO4·7H2O 571.1 mg·L-1, CaCl2·2H2O 451.6 mg·L-1, EDTA 5.0 mg·L-1, FeSO4·7H2O 5 mg·L-1, 미량원소 1 mL·L-1)를 넣고, 2mL의 균체 현탁액을 접종하였다. 탄소원으로 글루코오스와 소듐 아세테이트를 각각 100 mg/L씩 첨가하였다. 혈청병의 내부 공기를 질소 가스로 치환한 후, 부틸고무로 밀폐하였다. 실린지를 이용하여 N2O 가스의 최종 농도가 각각 250 ppm, 500 ppm, 750 ppm, 1000 ppm, 1500 ppm이 되도록 혈청병에 첨가한 후, 30 ℃, 120 rpm에서 배양하였다. N2O 농도를 다르게 한 각 혈청병들의 상부 가스를 실린지로 이용하여 주기적으로 채취하여, N2O 잔류량을 가스크로마토그래피(ECD 검출기)를 이용하여 측정하였다. 측정된 가스상의 N2O 농도(ppm)를 통해 배양액 중에 용존되어 있는 N2O 농도를 헨리상수를 이용해 계산하였다. 용존 N2O 잔류량과 측정된 가스상의 N2O 잔류량을 합산하여 혈청병 내 총 N2O 잔류량을 계산하였다. 배양 시간과 총 N2O 감소량을 이용하여 슈도모나스 속 M23 균주의 N2O 환원속도를 산출해 하기 표 2에 나타내었다.
| 균주 이름 | 가스상 N2O 농도 (ppm) |
총 N2O 주입량 (nmol) |
N2O 환원속도 (mmol·g-dry cell-1·h-1) |
| M23 | 250 | 1248 | 0.50±0.1 |
| 500 | 2496 | 1.03±0.1 | |
| 750 | 3744 | 1.44±0.0 | |
| 1000 | 4991 | 1.47±0.1 | |
| 1500 | 7487 | 3.27±0.7 |
그 결과, 가스상 N2O 농도가 250, 500, 1000, 1500 ppm일 때 슈도모나스 속 M23 균주의 N2O 환원속도는 각각 0.50±0.1, 1.03±0.1, 1.44±0.0, 1.47±0.1, 3.27±0.7 mmol·g-dry cell-1·h-1이었다. 따라서 250, 500, 1000, 1500 ppm의 N2O 농도 중, 1500 ppm일 때 가장 빠른 환원 속도를 보임을 확인하였다. 그러므로 가스상의 N2O 농도가 증가함에 따라 슈도모나스 속 M23 균주의 N2O 환원속도도 증가함을 확인하였다.
실시예 6. 슈도모나스 속 M23 균주의 디젤 분해능 확인
무기염 배지(MgSO4·7H2O 0.25 g·L-1, Na2HPO4·12H2O 17.09 g·L-1, KH2PO4 3 g·L-1, NaCl 0.5 g·L-1, CaCl2 0.01 g·L-1, NH4Cl 1.0 g·L-1) 4350 μL와 디젤 150 μL(3%, v/v)를 튜브에 넣어 혼합하였다. 이후 상기 튜브에 LB 아가 플레이트에서 배양한 슈도모나스 속 M23 균주 단일 콜로니를 접종하였다. 균이 접종된 튜브를 28 ℃, 180 rpm에서 배양하였다. 7일 간격으로 배양한 시료에 헥산(hexane) 5mL(배양액과 1:1 비율)을 넣고 30초간 섞어준 후, 30분간 28 ℃, 180 rpm으로 교반하여 디젤을 추출하였다. 디젤이 추출된 헥산층을 채취하고 이에 포함된 디젤 농도를 가스크로마토그래피(FID 검출기)를 이용해 측정하였다.
그 결과 도 2에 나타낸 바와 같이, 14일 배양시간 동안 본 발명에 따른 슈도모나스 속 M23 균주는 50%의 디젤 분해능(TPH removal efficiency)을 보임을 확인하였다. 반면, 슈도모나스 속 M23 균주를 접종하지 않은 대조군의 경우 10%의 디젤 분해능을 보인 바, 본 발명에 따른 슈도모나스 속 M23 균주는 디젤 분해능을 보유하고 있음을 확인하였다.
실시예 7. 슈도모나스 속 M23 균주에 의한 디젤 분해 및 N
2
O 배출 저감 효과 확인
디젤로 오염된 토양(디젤 농도: 10,000 mg/kg-soil) 1kg에 슈도모나스 속 M23 균주 배양액 10 ml를 접종한 후, 토양 시료를 햇볕이 차단된 상온에서 20일간 보관하였다. 보관하는 동안, 산소 주입을 위해 2일에 한번씩 토양 시료를 2~3분동안 섞어주었고, 5일에 한번씩 수분을 공급하여 토양 수분함량을 50~60%로 유지하였다. 20일 경과 후 토양 시료를 채취하여 잔류 디젤 농도와 N2O 환원(저감)능을 평가하였다. 본 발명에 따른 슈도모나스 속 M23 균주를 접종하지 않는 대조군 실험도 동시에 수행하였다.
상기 잔류 디젤 농도 분석을 위해 상기 토양 시료에 헥산을 1:1 비율(부피비)로 넣고 30초간 섞어준 후, 28 ℃에서 180 rpm으로 30분간 교반하여 디젤을 추출하였다. 디젤이 추출된 헥산층을 채취하여 이에 포함된 디젤 농도를 가스크로마토그래피(FID 검출기)를 이용해 측정하였다.
상기 N2O 환원(저감)능 평가는 다음의 방법으로 수행하였다. 120 mL 혈청병에 8mL의 N2O 배지(KH2PO4 169.7 mg·L-1, MgSO4·7H2O 571.1 mg·L-1, CaCl2·2H2O 451.6 mg·L-1, EDTA 5.0 mg·L-1, FeSO4·7H2O 5 mg·L-1, 미량원소 1 mL·L-1)를 넣고, 2g의 상기 토양 시료를 첨가하였다. 탄소원으로 글루코오스와 소듐 아세테이트를 각각 100 mg/L씩 첨가하였다. 혈청병의 내부 공기를 질소 가스로 치환한 후, 부틸고무로 밀폐하였다. N2O 가스를 최종 농도가 1000 ppm이 되도록 실린지를 이용하여 N2O가스를 혈청병에 첨가한 후, 30 ℃, 120 rpm에서 배양하였다. 혈청병의 상부 가스를 실린지를 이용하여 주기적으로 채취하여, N2O 농도를 가스크로마토그래피(ECD 검출기)를 이용하여 측정하였다.
그 결과를 하기 표 3에 나타내었다. 본 발명에 따른 슈도모나스 속 M23 균주를 접종하지 않은 대조군 토양에서는 디젤 분해 효율이 15%, N2O 환원 효율은 10%이었다. 반면, 본 발명에 따른 슈도모나스 속 M23 균주를 접종한 토양에서는 디젤 분해 효율이 85%이었으며, N2O 환원 효율은 95%로 매우 높았다. 따라서 본 발명에 따른 슈도모나스 속 M23 균주는 우수한 디젤 분해능 및 아산화질소 환원능을 가진 바, 이를 이용하면 유류 오염 정화와 동시에 아산화질소와 같은 온실가스 배출량을 저감할 수 있음을 확인하였다.
| 항목 | 대조군(M23 무접종) | M23 접종균 |
| 디젤 분해(정화) 효율(%) | 15 | 85 |
| N2O 환원 효율(%) | 10 | 95 |
실시예 8. 슈도모나스 속 M23 균주와 다른 슈도모나스 속 균주의 아산화질소 환원능 비교
본 발명에 따른 슈도모나스 속 M23 균주와 다른 슈도모나스 속 균주인 슈도모나스 속 HJ 균주의 아산화질소 환원능을 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 확인하여 비교하였다.
그 결과 도 3과 같이, 본 발명에 따른 슈도모나스 속 M23 균주는 5,000 nmol의 N2O를 5.5 시간 이내에 거의 대부분 분해(환원)하였다. 그러나, 다른 슈도모나스 속 HJ 균주는 5,000 nmol의 N2O를 146시간에 1,072 nmol만 분해(환원)하였다. 따라서 본 발명의 슈도모나스 속 M23 균주는 다른 슈도모나스 속 균주 대비 우수한 아산화질소 환원능을 가짐을 확인하였다.
종합적으로 본 발명의 실시예를 통해 본 발명의 슈도모나스 속 M23 균주가 우수한 디젤 분해능 및 아산화질소 환원능을 가졌으며, 이를 통해 유류 오염 정화 또는 아산화질소 환원을 각각 수행할 수 있을 뿐만 아니라, 유류 오염 정화와 동시에 아산화질소 환원을 동시에 수행할 수 있음을 확인한 바, 본 발명에 따른 슈도모나스 속 M23 균주를 석유계 탄화수소(Petroleum hydrocarbons, PHs)에 의한 오염 정화 및/또는 아산화질소의 배출 저감 방법에 유용하게 활용할 수 있다.
Claims (11)
- 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) M23 균주(KCTC14572BP).
- 제 1항에 있어서,
상기 균주는 nosZ(nitrous oxide reductase gene) 유전자를 발현하는 것을 특징으로 하는, 균주.
- 제 1항에 있어서,
상기 균주는 아산화질소 환원능을 가지는 것을 특징으로 하는, 균주.
- 제 1항에 있어서,
상기 균주는 유류 분해능을 가지는 것을 특징으로 하는, 균주.
- 제 1항에 있어서,
상기 균주는 유류 오염 정화와 아산화질소 환원을 동시에 수행할 수 있는 것을 특징으로 하는, 균주.
- 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따른 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) M23 균주(KCTC14572BP)를 유효성분으로 포함하는, 유류 오염 정화용 조성물.
- 제 6항에 있어서,
상기 유류는 탄소수 10개 이상의 고분자 석유계 탄화수소를 포함하는 것을 특징으로 하는, 유류 오염 정화용 조성물.
- 제 6항에 있어서,
상기 유류는 디젤, 항공유, 휘발유, 등유, 경유 및 중유로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 석유계 유류인 것을 특징으로 하는, 유류 오염 정화용 조성물.
- 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따른 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) M23 균주(KCTC14572BP)를 유류 오염원에 처리하는 단계를 포함하는, 유류 오염 정화 방법.
- 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따른 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) M23 균주(KCTC14572BP)를 유효성분으로 포함하는, 아산화질소 저감용 조성물.
- 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따른 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) M23 균주(KCTC14572BP)를 아산화질소 발생원에 처리하는 단계를 포함하는, 아산화질소 저감 방법.
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| Bioresource Technology.,162: 80-88(2014.4.1.)* * |
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