CN108300674B - 一种石油降解菌及其获得方法和在降解原油中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种石油降解菌及其获得方法和在降解原油中的应用，该石油降解菌命名为Mycobacterium sp.CSC‑6，属于革兰氏阴性菌，该菌株在2017年11月27日在中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏编号是：CCTCC No.M 2017726。该菌株呈杆状，颜色为浅黄色，不透明，培养48h后菌落直径为9.0‑11.0mm。该菌株16Sr DNA的GeneBank登录号为MG490974.1。与现有技术相比，本发明提供的菌株降解效率高，不仅对短链烃和中长链烃具有较好的降解效果，而且能够完全降解原油中长链烃，同时降解速度也较快。

Description

一种石油降解菌及其获得方法和在降解原油中的应用
技术领域
本发明涉及一种石油降解菌及其获得方法和在降解原油中的应用。
背景技术
石油作为工业的血液，和人类的生活息息相关。而石油在开采、炼制、储运、使用等过程中，容易进入土壤环境中，引起土壤理化性质的变化。例如：石油会堵塞土壤的孔隙结构使之盐碱化、沥青化、板结化，使土壤的透水性降低；石油富含的反应基团能够与土壤中的无机氮、磷结合并限制硝化作用和脱磷酸作用使土壤的有效氮磷含量降低，导致土壤有机质的碳氮比和碳磷比的变化，从而使土壤中微生物的种类和数量减少，使土壤活性降低甚至失活。同时，土壤中的石油可能会向下渗漏，污染地下水，或被雨水携带污染地表水，影响用水安全和农作物安全。因此石油污染土壤的修复刻不容缓。
目前，石油污染土壤的修复方法可以分为物理修复，化学修复和生物修复。物理修复技术难以彻底消除污染物，不能解决根本问题；化学修复技术难以彻底降解石油，而且会造成二次污染；生物修复技术可以利用特定的生物（植物、微生物、原生动物等）吸收、转化、清除或降解环境污染物，实现环境净化，生态效应恢复，且生物修复费用低、效果好，对环境影响低、无二次污染、不破坏植物生长所需要的土壤环境等，因此具有广阔的应用前景。
中国专利CN 104017747 B公布了一种含油污泥中石油降解菌及其应用，利用谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）降解含油的污泥，在37℃下，降解30天，对饱和烃的降解率为20.74%，对总石油烃的降解率为39.69%；中国专利CN 104877930 A公布了一种耐盐碱石油烃降解菌的分离筛选方法，从油田采集盐碱化石油烃污染的土壤，通过富集分离筛选出降解菌，并加入含有0.5%原油的污染物中，降解7天后，能够降解大部分的短链烃和中长链烃，且对长链烃的降解率能够达到70-80%；中国专利CN 102453678 A公布了一种修复石油污染盐碱土壤的微生物复合菌剂，利用复合微生物菌液，营养物质和表面活性剂组成的微生物复合菌剂用于修复石油污染盐碱土壤，同时可以降低盐碱土壤的pH 值，改善土壤理化性质；以上专利中提供的菌株或者菌剂，在一定条件下对石油污染物有一定的降解作用，但是仅针对低浓度或者稍高浓度的污染物有一定的降解作用，且对长链烃的降解效果还有待提高。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种石油降解菌及其在降解原油中的应用。本发明提供的石油降解菌既能够降解较低浓度和较高浓度石油污染物，又对长链烃具有较高降解作用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明提供一种石油降解菌，分类学命名为分支杆菌（Mycobacterium sp.），命名为Mycobacterium sp. CSC-6 ，属于革兰氏阴性菌，该菌株在2017年11月27日在中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏编号是：CCTCC No. M 2017726。中国典型培养物保藏中心的地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内（武汉大学第一附小对面），武汉大学保藏中心；邮编：430061。
该菌株呈杆状，颜色为浅黄色，不透明，培养48 h后菌落直径为9.0-11.0 mm，大约1.0 mm。
该菌株16Sr DNA的GeneBank 登录号为MG490974.1。
本发明所提供的微生物来自胜利油田附近石油污染的土壤，经过人工驯化，分离纯化得到的。
本发明还提供上述石油降解菌的获得方法，即提供Mycobacterium sp. CSC-6 的富集分离和纯化方法。
以原油为唯一碳源，从油泥中富集筛选降解原油的细菌，并在LB平板上涂布，划线，分离出单菌株，并将单菌株接入含原油的无机盐培养液中，检验其降解能力，获得具有高效降解作用的菌株。
上述富集分离和纯化方法，具体包括以下步骤：
（1）取油泥样品，加入无机盐培养基中，在30℃摇床上培养7-10 d，待培养液浑浊后，吸取培养液转接入新鲜的无机盐培养基中，连续转接富集培养5-7次；
（2）吸取富集培养5-7次的培养液加入PBS溶液中，连续稀释6次，并分别用不同稀释梯度培养液涂布平板，在20-35℃恒温培养箱中培养3-7 d，分别挑选出不同数量、不同颜色、不同菌落形态的细菌，分别划线，纯化培养得到多株单菌；
（3）将上述获得的纯菌株进一步接入含5.0 g/L原油的无机盐培养液中，在30℃的摇床上振荡培养3-7天，分析降解效率和降解稳定性，最后获得一株对原油有高效、稳定降解作用的菌株CSC-6。
在本发明的一个实施方式中，具体的富集分离和纯化方法为：
（1）称取3-5 g油泥样品，加入50 mL无机盐培养基（0.80-1.20 g/L NH4Cl，0.04-0.06 g/L CaCl2，0.05-0.15 g/L MgSO4 .7H2O，0.08-1.20 g/L K2HPO4，0.08-1.20 g/LKH2PO4），在30℃、120 r/min摇床上培养7-10 d，待培养液浑浊后，吸取5 mL培养液转接入新鲜的50 mL无机盐培养基中，连续转接富集培养5-7次。
（2）吸取富集培养5-7次的培养液1 mL 加入9 mL PBS溶液中，连续稀释 6次，并分别用不同稀释梯度培养液涂布平板，在20-35℃恒温培养箱中培养3-7 d，分别挑选出不同数量、不同颜色、不同菌落形态的细菌，分别划线，纯化培养得到多株单菌；
（3）将上述获得的纯菌株进一步接入含5.0 g/L原油的无机盐培养液中，在30℃，120 r/min的摇床上振荡培养3-7天，分析降解效率和降解稳定性，最后获得一株对原油有高效、稳定降解作用的菌株CSC-6。
将该菌株通过16Sr DNA序列分析（GenBank登录号为：MG490974.1），该序列与NCBI上已报道的16Sr DNA序列进行Blast分析，与CSC-6序列相似性最高的为Mycobacterium属的菌株，选取相关菌株的16S rDNA序列用Neighbour-joining method构建系统发育树（图4），由图4可见，菌株CSC-6位于Mycobacterium分支上。结合表型特征、生理生化特性和16SrDNA序列分析，菌株CSC-6鉴定并命名为Mycobacterium sp. CSC-6。
本发明还提供了所述石油降解菌在降解原油中的应用，将该石油降解菌接种到含原油的待处理对象中，扩大培养，即实现对原油的降解。
本发明进行原油降解实验的具体方法为：
（4）以该菌的基因组DNA为模板，PCR扩增获得烷烃单加氧酶（Alkane 1-monooxygense）基因片段，该烷烃单加氧酶（Alkane 1-monooxygense）的基因碱基序列如SEQ ID NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。从该片段在NCBI上BLAST的结果中选择具有代表性细菌的烷烃单加氧酶基因序列，构建起系统进化树如图5所示。
（5）分别配制含原油浓度为150-1500 mg/L的无机盐培养基，按体积比1-3%的比例接种经过扩大培养离心后，并用PBS调节OD值为0.5-2.0的分支杆菌，置于30℃，120 r/min的摇床上振荡培养0-3天后，用正己烷萃取剩余石油烃。通过GC-MS分别分析实验组和空白组，计算降解率。
（6）分别配制含原油浓度为10-100 g/L的无机盐培养基，按体积比1-3%的比例接种经过扩大培养离心后，并用PBS调节OD值为0.5-2.0的分支杆菌，置于20-35℃，120 r/min的摇床上振荡培养0-7天后，用正己烷萃取剩余石油烃，通过比较石油烃含量的变化得到石油烃的降解率。
通过降解原油实验表明，该菌对浓度为150-1500 mg/L的原油降解1-3 d后，降解率为63.70-78.45%，GC-MS分析结果显示，该菌不仅能够高效降解C10-C16和C17-C28，同时也能够降解C29-C36的长链烷烃（图2）。对浓度为10-100 g/L的原油降解0-7 d，降解率为18.25-50.10%（图3）。
与现有技术相比，本发明提供的菌株在扩大培养的过程中，对石油污染物有一定的分散作用，推测能够产生表面活性剂；本发明提供的菌株不仅能够降解低浓度的石油烃，且对高浓度的石油烃也具有一定的降解效果。本发明提供的菌株降解浓度为150-1500 mg/L的原油，1-3 d后，降解率为63.70-78.45%，降解浓度为10-100 g/L的原油降解0-7 d，降解率为18.25-50.10%。本发明提供的菌株降解效率高，不仅对短链烃和中长链烃具有较好的降解效果，而且能够完全降解原油中长链烃，同时降解速度也较快。
附图说明
图1：菌株CSC-6降解初始浓度为1500 mg/L原油的总石油烃降解率和分段碳链的降解率；
图2A：初始浓度为1500 mg/L原油的GC-MS分析；
图2B：菌株CSC-6降解初始浓度为1500 mg/L原油1天后的GC-MS分析；
图3：菌株CSC-6降解不同浓度原油的降解特性；
图4：基于菌株CSC-6和亲缘关系相近菌株的16S rDNA序列系统发育树；
图5：基于菌株CSC-6和亲缘关系相近菌株的烷烃羟化酶氨基酸序列发育树。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1：
分支杆菌Mycobacterium sp. CSC-6的富集和分离
（1）现场采集胜利油田附近石油污染的土壤，以原油为唯一碳源，筛选出对原油有高效降解作用的细菌。称取5 g油泥样品，加入盛有50 mL无机盐培养基（1.00 g/L NH4Cl，0.05g/L CaCl2，0.10g/L MgSO4 .7H2O，1.00g/L K2HPO4，1.00g/L KH2PO4）的三角瓶中，在30℃、120 r/min摇床上培养7 d。待培养液浑浊后，吸取5 mL培养液转接入新鲜的50 mL无机盐培养基中，连续转接富集培养6次。
（2）吸取富集培养6次的培养液1 mL 加入9 mL PBS溶液中，连续稀释 6次，并分别用不同稀释梯度培养液涂布平板，在30℃恒温培养箱中培养1-7 d，分别挑选出不同数量、不同颜色、不同菌落形态的细菌，分别划线，纯化培养得到多株单菌。
（3）纯化的菌株进一步接入含5.0 g/L原油的无机盐培养液中，在30℃，120 r/min的摇床上培养7 d后，用正己烷萃取剩余石油，检验其降解能力，最后获得一株原油的高效降解菌CSC-6，并通过16Sr DNA 测序，确定其为分支杆菌属（Mycobacterium sp.）。
实施例2：
分支杆菌Mycobacterium sp. CSC-6的降解性能
用LB培养基扩大培养菌株CSC-6，48 h后离心分离出菌体，并用PBS配制成悬浊液并调节OD值为1.0，按体积比2%的比例将该菌液接种至原油浓度为150 mg/L的无机盐培养基中，以不含有菌株CSC-6的原油浓度为150 mg/L无机盐培养基为空白，置于30℃，120 r/min的摇床上振荡培养1，3天后，用正己烷萃取剩余石油烃。通过GC-MS分别分析实验组和空白组，在降解1 d后，对原油中C10-C16的降解率为55.44%，C17-C28的降解率为45.86%，总石油烃的降解率为48.27%；在降解3 d后，对原油中C10-C16的降解率为100%，C17-C28的降解率为51.48%，总石油烃的降解率为63.7%。
实施例3：
用LB培养基扩大培养菌株CSC-6，48 h后离心分离出菌体，并用PBS配制成悬浊液并调节OD值为1.0，按体积比2%的比例将该菌液接种至原油浓度为300 mg/L的无机盐培养基中，以不含有菌株CSC-6的原油浓度为300 mg/L无机盐培养基为空白，置于30℃，120 r/min的摇床上振荡培养1，3天后，用正己烷萃取剩余石油烃。通过GC-MS分别分析实验组和空白组，在降解1 d后，对原油中C10-C16的降解率为23.95%，C17-C28的降解率为70.47%，C29-C36的降解率为100%，总石油烃的降解率为69.58%；在降解3 d后，对原油中C10-C16的降解率为100%，C17-C28的降解率为73.35%，C29-C36的降解率为100%，总石油烃的降解率为78.45%。
实施例4：
用LB培养基扩大培养菌株CSC-6，48 h后离心分离出菌体，并用PBS配制成悬浊液并调节OD值为1.0，按体积比2%的比例将该菌液接种至原油浓度为1500 mg/L的无机盐培养基中，以不含有菌株CSC-6的原油浓度为1500 mg/L无机盐培养基为空白，置于30℃，120 r/min的摇床上振荡培养1，3天后，用正己烷萃取剩余石油烃。通过GC-MS分别分析实验组和空白组，在降解1 d后，对原油中C10-C16的降解率为87.62%，C17-C28的降解率为61.75%，C29-C36的降解率为30.8%，总石油烃的降解率为63.19%；在降解3 d后，对原油中C10-C16的降解率为95.03%，C17-C28的降解率为75.01%，C29-C36的降解率为73.43%，总石油烃的降解率为77.51%，如图1所示。
实施例5：
用LB培养基扩大培养菌株CSC-6，48 h后离心分离出菌体，并用PBS配制成悬浊液并调节OD值为1.0，按体积比2%的比例将该菌液接种至原油浓度为10，50，80，100 g/L的无机盐培养基中，以不含有菌株CSC-6的原油浓度分别为10，50，80，100 g/L无机盐培养基为空白，置于30℃，120 r/min的摇床上振荡培养7天后，用正己烷萃取剩余石油烃。通过重量法分别分析实验组和空白组，结果如图3所示，在降解7 d后，原油浓度分别为10，50，80，100g/L的培养基，降解率分别为50.10，29.85，25.34，18.25%。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 永清环保股份有限公司
<120> 一种石油降解菌及其获得方法和在降解原油中的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 548
<212> DNA
<213> 分支杆菌(Mycobacterium sp.)
<400> 1
aataccgcgc acgaactcgg ccataagaag gactcgctgg agcgctggct gtccaagatc 60
actttggccc agacctgcta cggccacttc tacatcgagc acaaccgggg gcatcacgtc 120
cgcgtcgcga ccccggagga tcccgcctcg gcgcggttcg gcgagacgtt ctgggagttc 180
ctgccgcgca gcgtgtgggg cagcctgaag tcgtcctggg agctggaagc caagcggctc 240
gaacgcgccg gaaagtcgaa gtggcacccc accaacgacg tgctgaatgc ctgggcgatg 300
tcggtggtgt tctacggcgc cctgatcgcg atcttcggtc tgggtctgat cccgtacatc 360
ctgatctcgg cgatctacgg tttcgccctg ctggagaccg tcaactacct ggagcattac 420
gggctgttgc ggcagaaact ggagtccggc cggtacgagc ggtgtgcgcc ggtgcacagc 480
tggaactccg accacatcgt caccaacttg ttcctctacc acctgcaacg ccactcagat 540
caccatgc 548
<210> 2
<211> 182
<212> PRT
<213> 分支杆菌(Mycobacterium sp.)
<400> 2
Asn Thr Ala His Glu Leu Gly His Lys Lys Asp Ser Leu Glu Arg Trp
1 5 10 15
Leu Ser Lys Ile Thr Leu Ala Gln Thr Cys Tyr Gly His Phe Tyr Ile
20 25 30
Glu His Asn Arg Gly His His Val Arg Val Ala Thr Pro Glu Asp Pro
35 40 45
Ala Ser Ala Arg Phe Gly Glu Thr Phe Trp Glu Phe Leu Pro Arg Ser
50 55 60
Val Trp Gly Ser Leu Lys Ser Ser Trp Glu Leu Glu Ala Lys Arg Leu
65 70 75 80
Glu Arg Ala Gly Lys Ser Lys Trp His Pro Thr Asn Asp Val Leu Asn
85 90 95
Ala Trp Ala Met Ser Val Val Phe Tyr Gly Ala Leu Ile Ala Ile Phe
100 105 110
Gly Leu Gly Leu Ile Pro Tyr Ile Leu Ile Ser Ala Ile Tyr Gly Phe
115 120 125
Ala Leu Leu Glu Thr Val Asn Tyr Leu Glu His Tyr Gly Leu Leu Arg
130 135 140
Gln Lys Leu Glu Ser Gly Arg Tyr Glu Arg Cys Ala Pro Val His Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Asp His Ile Val Thr Asn Leu Phe Leu Tyr His Leu Gln
165 170 175
Arg His Ser Asp His His
180

Claims (4)

1.一种石油降解菌，其特征在于，命名为Mycobacterium sp.CSC-6，属于革兰氏阴性菌，该菌株在2017年11月27日在中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏编号是：CCTCC No.M2017726；该菌不仅能够降解C10-C16的短链烃和C17-C28的中长链烃，同时也能够降解C29-C36的长链烷烃。
2.根据权利要求1所述的一种石油降解菌，其特征在于，该菌株呈杆状，颜色为浅黄色，不透明，培养48h后菌落直径为9.0-11.0mm。
3.根据权利要求1所述的一种石油降解菌，其特征在于，该菌株16Sr DNA的GeneBank登录号为MG490974.1。
4.权利要求1所述石油降解菌在降解原油中的应用，其特征在于，将该石油降解菌接种到含原油的待处理对象中，扩大培养，即实现对原油的降解；所述原油浓度为10-100g/L。
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