CN110283741B - 一株具有高效降解多环芳烃功能的玫瑰变色菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株具有高效降解多环芳烃功能的玫瑰变色菌及其应用，其保藏编号为：CCTCC NO:M 2019037。该菌能以多环芳烃为唯一碳源进行生长，其对萘的降解率为100％，菲的降解率为96％，并从该菌中扩增出一个双加氧酶基因(NidA like基因)，在遗传学上证实其具有多环芳烃降解特性；该菌具有较强的环境适应能力，最适生长温度为30℃，在中性偏碱(7.0‑8.5)的pH环境中表现出比pH偏酸(5.5‑6.5)更高的降解能力，并且具有较广范的盐度适应范围10‰～150‰，比较偏爱偏碱性的海洋环境，具有应用于海洋环境污染的生物修复治理中巨大潜力。

Description

一株具有高效降解多环芳烃功能的玫瑰变色菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株具有高效降解多环芳烃功能的玫瑰变色菌及其应用。
背景技术
由于全球沿海地区经济的迅速发展，人类活动和城市化进程的推进，越来越多的有机污染物等通过各种途径进入到海洋环境，给海洋环境和生态安全带来了巨大的压力。多环芳烃(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，PAHs)是一类在环境中具有广泛分布的含有两个或者两个苯环以上的有度污染，由于其具有高毒性、高致癌性和高致畸诱变作用，并且具有较强的疏水性所以在环境中能够被吸附并且富集、生物累积和通过食物链传递等，造成环境的二次污染，给整个海洋环境、生态环境和人类健康都造成了极大的危害；美国国家环境保护局EPA早就在80年代就将16种未带分支的PAHs确定为了环境中的优先污染物，我国也把其列于海洋环境有机污染黑名单之首。
环境中多环芳烃的修复方法主要包括物理法、化学法、焚烧法和生物法，相关研究表明生物法中的微生物降解法能够有效地将该污染物从环境中去除，并且其由于环境影响小，处理的污染物阈值低、残留小和高效环保等特点，所以是多环芳烃修复的一个最主要的途径，并且相关研究结果证实开展海洋环境中以微生物为主体的多环芳烃污染的生物修复研究是十分必要的。由于海洋环境中蕴含着丰富的微生物资源，其在环境中物质循环、能量流动、生态平衡和环境净化方面都发挥着重要的作用。因此，本专利旨在通过分离获得原位高效多环芳烃降解菌株，为海洋环境中多环芳烃污染的微生物修复提供菌株资源。
发明内容
本发明的目的是提供一株具有高效降解多环芳烃功能的玫瑰变色菌Roseovariussp.SCSIO 43702，以及一种包括所述玫瑰变色菌SCSIO 43702的微生物制剂，该菌株于2019年1月11日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号：CCTCC NO:M 2019037。
所述的玫瑰变色菌SCSIO 43702具有以多环芳烃为唯一碳源进行生长的能力，因此可以以多环芳烃为唯一碳源的培养基进行培养。
本发明的玫瑰变色菌SCSIO 43702或包括所述玫瑰变色菌SCSIO 43702的微生物制剂对多环芳烃具有高效的降解作用。
通过分子生物学方法，利用功能基因nidA的引物从玫瑰变色菌SCSIO 43702扩增获得双加氧酶基因(NidA like基因)，从而在遗传学水平上证实玫瑰变色菌SCSIO 43702具有多环芳烃降解的潜能。
通过高效液相色谱(HPLC)方法对玫瑰变色菌SCSIO 43702的多环芳烃降解效率进行测定，其结果显示其对萘的降解效率为100％，对菲的降解效率为96％。
因此，本发明的另外一个目的是提供所述的玫瑰变色菌SCSIO 43702以及相应的微生物制剂在降解多环芳烃中的应用。例如在多环芳烃污染环境的生物修复中的应用，特别是在海洋环境多环芳烃污染的生物修复中的应用。
优选，所述的多环芳烃为萘、荧蒽或菲。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明的玫瑰变色菌SCSIO 43702是通过以多环芳烃为唯一碳源而富集获得的，来源于海洋环境，其能够高效地降解多种多环芳烃，并且具有较强的环境适应能力，其生长温度范围为20℃～40℃，盐度范围为10‰～150‰和pH范围55.5～8.5，并且对萘的降解效率为100％，对菲的降解效率为96％，具有高效的多环芳烃降解效果，因此将本发明的玫瑰变色菌SCSIO 43702应用于多环芳烃污染的海洋生态环境修复的潜力巨大。
玫瑰变色菌Roseovarius sp.SCSIO 43702于2019年1月11日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号：CCTCC NO:M 2019037。
附图说明
图1是玫瑰变色菌SCSIO 43702的16S rDNA的系统进化发育树。
图2是玫瑰变色菌SCSIO 43702的nidA系统进化发育树。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1玫瑰变色菌Roseovarius sp.SCSIO 43702的分离、纯化和鉴定
1、玫瑰变色菌SCSIO 43702的分离、纯化
采集于中国广东省深圳大亚湾的喜盐草Halophila ovalis生长区的沉积物，首先用无机盐培养基对沉积物进行富集培养，10g沉积物在含有100mL无机盐培养基的250mL的摇瓶中培养，180rpm，28℃，35天。无机盐培养基的成分为：NH4NO3 1g，KH2PO4 0.5g，FeSO42.8mg，1000mL过滤海水，pH值为7.5。以菲(终浓度100mg/L)为唯一碳源培养30天，然后取出200μL分别在M2培养基和216L培养基上进行富集培养，待长出菌落后进行进一步的分离与纯化获得玫瑰变色菌SCSIO 43702。其中，M2培养基和216L培养基的成分分别如下：
M2培养基的组成：CH3COONa 5.0g，NH4NO3 1g，蛋白胨0.5g，酵母提取物0.5g，葡萄糖0.5g，NH4Cl 0.2g，KH2PO4 0.5g，柠檬酸钠0.5g，苹果酸0.05g，KH2PO4 0.5g，琼脂15g，1000mL过滤海水；将上述培养基的成分混合，灭菌，即得。
216L培养基的组成：蛋白胨10g，酵母提取物2g，柠檬酸钠0.5g，NH4NO3 0.2g，琼脂15g，1000mL过滤海水，pH值为7.5；将上述培养基的成分混合，灭菌，即得。
2、玫瑰变色菌SCSIO 43702的形态学和分子生物学鉴定
从深圳大亚湾喜盐草沉积物中分离出能降解多环芳烃菲的玫瑰变色菌SCSIO43702，对该菌株进行了初步的形态学观察，结果显示该菌株为革兰氏阴性菌，小杆状，无鞭毛，长1.69μm，在海洋琼脂培养基中呈黄色。并进行了生理生化实验，该菌株能够以葡萄糖、甘露醇、鼠李糖为碳源，并且可以进行硝酸盐还原和明胶降解，其与Ezbiocloud数据库中最相近序列Roseovarius confluentis SAG6(T)在生理生化水平上有一定的差异，如在麦芽糖利用和明胶分解等方面(表1)。
表1玫瑰变色菌Roseovarius confluentis SAG6 T与SCSIO 43702的生物化学特征
Figure GDA0002415266530000041
Figure GDA0002415266530000051
本发明人还进一步提取了玫瑰变色菌SCSIO 43702的基因组DNA，以通用引物27F和1492R进行扩增(Weisenburg et al.,1991，16S ribosomal DNA amplification forphylogenetic study.,Journal of bacteriology,1991,173(2):697-703)，PCR反应体系见表2。将16S rRNA测序的结果(见SEQ ID NO.1)与Ezbiocloud数据库中检索，其与该数据库中最相近的序列玫瑰变色菌属Roseovarius confluentis SAG6(T)(KX268605)的相似度为95.58％，所以证明本发明的玫瑰变色菌SCSIO 43702为该属中的一株新菌。所述的玫瑰变色菌SCSIO 43702的16S rDNA的系统进化发育树见图1。将玫瑰变色菌SCSIO 43702命名为玫瑰变色菌Roseovarius sp.SCSIO43702，该菌株于2019年1月11日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号：CCTCC NO:M 2019037。
表2基因组DNA的PCR反应体系
Figure GDA0002415266530000052
为了在分子水平上进一步确认玫瑰变色菌SCSIO 43702具有多环芳烃的降解功能，本发明人以玫瑰变色菌SCSIO 43702的基因组DNA为模板，利用基因nidA的引物(Zhouet al.,2006；H.W.Zhou,C.L.Guo,Y.S.Wong,N.F.Y.Tam,Genetic diversity ofdioxygenase genes in polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading bacteriaisolated from mangrove sediments,FEMS Microbiol.Lett.,262(2006),148-157)进行扩增获得双加氧酶基因(NidA like基因，序列见SEQ ID NO.2)，将其测序结果进行BLAST分析，其结果显示：该菌株与微黄分支杆菌Mycobacterium gilvum的相似性为93％，已有研究报道称该微黄分支杆菌Mycobacterium gilvum能够降解多环芳烃，并且降解性能稳定，降解底物范围较广。所述的玫瑰变色菌SCSIO43702的nidA系统进化发育树见图2。
实施例2玫瑰变色菌SCSIO 43702降解多环芳烃的效率测定
由于自然环境中都是以多种多环芳烃混合形式的状态存在的，所以我们通过将两种多环芳烃双苯环的萘和三苯环的菲混合(终浓度100mg/L，比例为1:1)，然后与玫瑰变色菌Roseovarius sp.SCSIO 43702进行培养，并且设置实验组和对照组，对照组和实验组均以萘和菲混合物作为唯一碳源的液体培养基中培养，区别是对照组中无菌加入，而实验组中接入菌SCSIO 43702，将两者放在同样的环境下进行培养，28℃、180rpm、培养35天，分析该菌对PAHs的去除率，其对萘的去除率为100％，对菲的去除率为96％。
然后进一步分析温度、pH和盐度对玫瑰变色菌SCSIO 43702降解菲速率的影响，通过设置不同的梯度(温度梯度：20℃、25℃、30℃、35℃和40℃；pH梯度：5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5；盐度梯度(质量分数)：10‰、30‰、60‰、90‰、120‰和150‰分别在培养的第2天、5天和10天，用乙酸乙酯提取菲，进行HPLC分析。
结果显示：温度对菲的降解影响比较大，前5天在35℃长势最好而在10天培养结束，在30℃下的降解率最高，可生长的温度区间范围较广；pH对菲的降解影响不大，在中性偏碱(7.0-8.5)的pH环境中比pH偏酸(5.5-6.5)具有更高的降解能力，菌株在10‰-150‰都可以生长，但是当盐度超过60‰，会显著影响菲的降解效率。在实验盐度为30‰时，培养10天后，菲的降解率可达86％，而当盐度为150‰时，降解率仅7.7％，与对照组几乎相同。
综上所述，本发明的玫瑰变色菌SCSIO 43702具有较强的环境适应能力，其生长温度为30℃～40℃，其中最适温度为30℃，其pH范围55.5-8.5，其在中性偏碱(7.0-8.5)的pH环境中表现出比pH偏酸(5.5-6.5)更高的降解能力，并且具有较广范的盐度适应范围10‰～150‰，在盐度为30‰的时候，降解效率最高，并比较偏爱偏碱性环境的海洋环境，具有应用于海洋环境污染的生物修复治理中巨大潜力。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国科学院南海海洋研究所
<120> 一株具有高效降解多环芳烃功能的玫瑰变色菌及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1364
<212> DNA
<213> 玫瑰杆菌 SCSIO 43702(Roseovarius SCSIO 43702)
<400> 1
cggaactccg tggtcgctgc cccctgtaac aggttggcgc acggccttcg ggtgaaccca 60
actcccatgg tgtgacgggc ggtgtgtaca aggcccggga acgtattcac cgcggcatgc 120
tgttccgcga ttactagcga ttccgacttc atggggtcga gttgcagacc ccaatccgaa 180
ctgagatgcc ttttggggat taacccactg taggcaccat tgtagcacgt gtgtagccca 240
acccgtaagg gccatgagga cttgacgtca tccacacctt cctcccgctt atcacgggca 300
gtttccatag agtgcccagc ttgacctgct ggcaactagg gatgtgggtt gcgctcgttg 360
ccggacttaa ccgaacatct cacgacacga gctgacgaca gccatgcagc acctgtcact 420
gatccagccg aactgaagga aacgatctct cgtaaccgcg atcaggatgt caagggttgg 480
taaggttctg cgcgttgctt cgaattaaac cacatgctcc accgcttgtg cgggcccccg 540
tcaattcctt tgagttttaa tcttgcgacc gtactcccca ggcggaatgc ttaatccgtt 600
aggtgtgtca ccgaacagta tactgcccga cgactggcat tcatcgttta cggtgtggac 660
taccagggta tctaatcctg tttgctcccc acactttcgc acctcagcgt cagtatcgag 720
ccagtgagcc gccttcgcca ctggtgttct tccgaatatc tacgaatttc acctctacac 780
tcggagttcc actcacctct ctcgaactca agactaacag ttttggaggc agttccaggg 840
ttgagccctg ggatttcacc cccaacttgc taatccgcct acgcgcgctt tacgcccagt 900
aattccgaac aacgctaacc ccctccgtat taccgcggct gctggcacgg agttagccgg 960
ggtttcttta ccaggtactg tcattatcat ccctggcgaa agagctttac gatcctaaga 1020
ccttcttcac tcacgcggca tggctagatc aggcttgcgc ccattgtcta agattcccca 1080
ctgctgcctc ccgtaggagt ctgggccgtg tctcagtccc agtgtggctg atcatcctct 1140
aaaaccagct atagatcgta gacttggtag gccattaccc caccaactat ctaatctaac 1200
gcgggccgat ccttcaccga taaatctttc ccccgaaggg cgtatgcggt attaccccca 1260
gtttcccagg actattccgc agtgaagggc acgttcccac gcgttactca cccgtccgcc 1320
gctaggtccg aagacctcgc tcgactgcat ggtaagctgc cgcc 1364
<210> 2
<211> 281
<212> DNA
<213> 玫瑰杆菌 SCSIO 43702(Roseovarius SCSIO 43702)
<400> 2
gggaataact gaacggtaag ctcgtcggcg tgccggcgat gacggagggc tatcccggcg 60
gcttcgacag tcgcagtggg gattacgtcc cctccccctt gtcgactcgt acgccggatt 120
catcttcggc agcgtgtatc cgaaggcgcc gagcctgacc gactacctcg gcgacccgac 180
gttctacctc cacctcgttg cgaaaaaaaa agcgggcggg ctggagggga tggggggacc 240
gcatcgatgg gtgatgtcag cgaactggaa gaaaggcgca a 281

Claims (6)

1.玫瑰变色菌Roseovarius sp.SCSIO 43702，其保藏编号为：CCTCC NO:M 2019037。
2.一种玫瑰变色菌微生物制剂，其特征在于，所述的微生物制剂包含权利要求1所述的玫瑰变色菌SCSIO 43702。
3.权利要求1所述的玫瑰变色菌SCSIO 43702在以萘和菲混合物作为唯一碳源的培养基中进行培养的应用。
4.权利要求1所述的玫瑰变色菌SCSIO 43702或权利要求2所述的玫瑰变色菌微生物制剂在降解萘和菲中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，是在萘和菲污染环境的生物修复中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，是在萘和菲污染的海洋环境的生物修复中的应用。
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