CN115725455B - 一株α-萘酚降解细菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于环境微生物学工程与技术领域，应用于环境中残留α‑萘酚的生物消除与阻控，具体的本发明涉及一株α‑萘酚降解细菌及其应用。本发明从海水分离到的Micrococcus sp.2A，已经保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2022年8月1号，保藏编号为CCTCC NO:M20221210，在温度为16‑37℃，pH为7‑11，NaCl浓度为0.05‑0.4 mol/L范围时，对α‑萘酚均有降解能力，降解效果显著高于现有已经报道的菌株，有较强的环境适应能力，在碱性和高盐条件下依然能够正常降解，为环境中残留α‑萘酚的消除和阻控提供了高效降解菌株资源，具有重要的理论和应用价值。

Description

一株α-萘酚降解细菌及其应用

技术领域

本发明属于环境微生物学工程与技术领域，应用于环境中残留α-萘酚的生物消除与阻控，具体的本发明涉及一株α-萘酚降解细菌及其应用。

背景技术

α-萘酚（α-naphthol，又名1-萘酚、甲萘酚）是一种与人们生产生活联系较为紧密的有机化合物，主要应用于化工合成和染料工业，是农药、医药和染料等物质合成的基本原料，也是胶片成色剂、橡胶防老剂及植物油的有效抗氧化剂等，同时还是杀虫剂西维因、抗抑郁药盐酸度洛西汀等在环境中的主要代谢产物。据统计全球每年α-萘酚的生产量约为15000吨，且还在逐年增加。由于使用量大且难降解，导致α-萘酚在土壤和大气中的残留问题越来越突出，而残留环境中的α-萘酚易经雨水淋洗和地表径流等方式进入水体中，是一种潜在的水体污染物，对水源安全和人体健康构成了潜在风险。因此，强化去除环境中残留α-萘酚是近年来研究的热点，也是环境生物技术领域的难点。

目前关于α-萘酚的修复方法主要有物理方法、化学方法和生物方法，其中物理和化学方法存在成本高、难操作，可能存在二次污染等缺点，而通过微生物代谢消除污染物具有高效、经济和环保等优势，在残留污染物的消除和解毒中占据重要地位。

目前，已分离出多株具有α-萘酚降解能力的细菌，包括Pseudomonase、Arthrobacter和Rhodococcus等细菌菌属，但普遍存在降解效率不高或环境适应能力差等问题。因此，筛选高效、稳定且环境适应能力强的α-萘酚降解菌株，完全去除α-萘酚，将为其污染环境的生物修复提供微生物技术支持。

发明内容

本发明的目的是提供一种α-萘酚降解细菌及其应用，该菌株不仅具有较强的底物降解能力，还具有较强的环境适应能力，在碱性和高盐条件下依然能够正常降解，为环境中残留α-萘酚的消除和阻控提供了高效降解菌株资源，具有重要的理论和应用价值。

本发明的一个方面，本发明提供了一株降解α-萘酚的菌株Micrococcus sp. 2A，分离自海水样品中，现保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2022年8月1号，保藏编号为CCTCC NO: M20221210。

本发明所述菌株经鉴定为微球菌属（Micrococcus sp.），革兰氏染色为阳性，严格好氧，在LB固体培养基表面培养2-3天，菌落呈黄色、圆形、表面光滑、边缘齐整，16S rRNA基因序列如SEQ ID N0.1所示。

本发明的一个方面，本发明所述菌株Micrococcus sp. 2A在最适温度为30℃，最适初始pH为7.0的好氧无机盐培养基中补充蛋白胨作为碳源供给，菌株2A能够在48 h内完全降解0.1 mM α-萘酚。

本发明菌株Micrococcus sp. 2A接种至以蛋白胨为补充碳源的无机盐培养基中，考察其对的α-萘酚降解情况，可以发现α-萘酚在初始浓度为0.04、0.09、0.18和0.30 mM时，分别能够于48 h、48 h、120 h和120 h达到100%、100%、81%和70%的α-萘酚去除率，该结果说明Micrococcus sp. 2A能够将中低浓度、高浓度α-萘酚高效去除，为α-萘酚的生物修复提供了新降解菌种资源，具有优良的降解能力和良好的应用前景。

若将Micrococcus sp. 2A接种至以蛋白胨为补充碳源的无机盐培养基中，通过改变培养基的初始pH、盐浓度以及菌株2A的培养温度，考察其对α-萘酚的降解情况，可以发现菌株最适降解温度、pH和NaCl浓度分别为30℃、10.0和0.1 mol/L。在温度为16-37℃，pH为7-11，NaCl浓度为0.05-0.4 mol/L范围时，菌株2A对α-萘酚均有降解能力，该结果说明菌株2A具有优良的环境适应能力和良好的应用潜力。

本发明所述无机盐培养基（MSM）配方为：NaCl 1 g，NH₄Cl 1 g，K₂HPO₄ 1.5 g，KH₂PO₄ 0.5 g，MgSO₄•7H₂O 0.2 g，加超纯水定容至1 L，pH调节至7.0。

本发明的一个方面，本发明提供了所述菌株Micrococcus sp. 2A制备的菌剂产品。优选的，本发明所述菌剂为液体制剂、冻干粉制剂、颗粒制剂。优选的液体制剂可以是悬浮剂。

本发明的一个方面，本发明提供了所述菌株Micrococcus sp. 2A及其菌剂在高盐或碱性土壤和水体中残留α-萘酚的应用。

本发明的一个方面，本发明提供了本发明所述菌株Micrococcus sp. 2A及其菌剂在降解生活污水、工业废水、海水和土壤中残留α-萘酚的应用。

有益效果

第一，本发明从海水样品中分离到一株能高效降解α-萘酚的细菌Micrococcussp. 2A。在最适条件下，该菌株能够在48 h内将0.1 mM α-萘酚完全去除，降解效率显著高于已报道菌株（Soheil Rahmatabadi，et al，Isolation and identification α-Naphthol-degrading bacteria from oil-contaminated soils of Masjed-e-Soleyman，biological journal of microorganism , 10.22108/BJM.2018.21707）。该菌是微球菌属（Micrococcus sp.）首个公开的能降解α-萘酚的菌株，与现有技术报道的α-萘酚降解菌株的系统分类地位、降解底物谱以及降解效率均不同，为环境中残留α-萘酚的有效消减提供了重要的降解菌株资源。

第二，本发明公开的Micrococcus sp. 2A在温度为16-37℃，pH为7-11，NaCl浓度为0.05-0.4 mol/L范围时，菌株2A对α-萘酚均有降解能力，该结果说明本发明菌株具有优良的环境适应能力和良好的应用潜力。

第三，本发明公开的菌株Micrococcus sp. 2A分离于海水样品，可以较好的适应高盐、强碱等极端的自然环境条件，与物化方法相比，成本大幅度降低，且无有毒副产物生成，对污废水、海水和土壤等环境中α-萘酚的生物强化修复具有重要意义。

附图说明

图1，本发明菌株Micrococcus sp. 2A的菌落形态图。

图2，本发明菌株Micrococcus sp. 2A的系统进化发育树。

图3，本发明菌株Micrococcus sp. 2A对不同浓度α-萘酚的降解特性。

图4，本发明菌株Micrococcus sp. 2A在不同温度条件下的降解特性。

图5，本发明菌株Micrococcus sp. 2A在不同pH条件下的的降解特性。

图6，本发明菌株Micrococcus sp. 2A在不同NaCl浓度条件下的降解特性。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。本发明所述技术方案，如未特别说明均为本领域的常规方式，所述试剂或材料，如未特别说明，均为常规试剂，来源于商业渠道。

实施例1

1.1 α-萘酚降解菌株2A的分离筛选

取3 mL海水样品加至100 mL基础盐培养基（MSM）中，添加2 mL无菌LB液体培养基和终浓度为0.1 mM α-萘酚，于30℃，180 rpm培养5天，以4%（v/v）的接种量转接至含2 mLLB和终浓度为0.1 mM α-萘酚的新鲜无菌MSM中，如此反复，连续转接三次，利用高效液相色谱仪（HPLC）检测第四代富集液中α-萘酚的浓度。将有降解效果的富集液稀释涂布至LB固体培养基表面，于30℃培养3-5 d，挑取单菌落至LB试管，培养至指数期，再将获得的菌液接种至含有0.1 mM α-萘酚和0.5%（g/v）蛋白胨的MSM中，于30℃，180 rpm培养4天，取500 μL培养液样品，加入等量甲醇，充分振荡混匀后，样品过0.22 μm有机滤膜，HPLC检测样品中α-萘酚的浓度，若α-萘酚浓度降低，则推测该菌株具有降解能力。

本发明中1 L LB 液体培养基配方为：NaCl 5 g，酵母粉 5 g，蛋白胨10 g，加入超纯水定容至1 L，pH调节至7.0。LB固体培养基为LB液体培养基基础上添加1.8%（g/v）的琼脂粉。

本发明中HPLC检测α-萘酚浓度的色谱条件：色谱柱为Syncronis C18 (ThermoFisher Scientific)反相柱（规格为：250 mm × 4.6 mm × 5 μm）；流动相为甲醇：0.5%乙酸水(75:25 (v:v))；流速为1.0 mL·min^-1；检测波长为210 nm；柱温为30°C；进样量为20 μL。

通过富集培养和稀释涂布分离法，成功筛选到一株α-萘酚降解菌株，命名为2A。该菌株在48 h内能将0.1 mM α-萘酚完全降解。

α-萘酚降解菌株2A的鉴定和生物学特性

将菌株2A在固体LB培养基表面培养2-3 d，显微镜观察菌落呈圆形、黄色、不透明、边缘齐整、表面光滑。以菌株2A的新鲜菌液为模板，利用16S rRNA基因序列通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）进行扩增，扩增产物经纯化后酶连至载体pMD19-T，经测序获得长度约为1536 bp的基因序列，将该序列于EzBioCloud数据库（https://www.ezbiocloud.net）中进行比对分析，结果显示菌株2A与Micrococcus antarcticus T2^T的相似性最高，为99.45%，结合菌株2A的菌落形态（参见图1）、生理生化特征和16S rRNA基因系统发育进化树（参见图2）将其鉴定为微球菌属（Micrococcus sp.），将其命名为Micrococcus sp. 2A。

实施例2

2.1 菌株2A（Micrococcus sp.2A）种子液的制备

挑取菌株2A单菌落至LB试管培养至指数期，取2 mL菌株2A菌液转接至100 mL LB液体培养基，再将培养液于30℃，150 rpm培养至指数期，8000 rpm离心收集菌体，接着用MSM液体培养基洗涤菌体3次，重悬于10 mL MSM中即为菌株2A种子液。

菌株2A对不同浓度α-萘酚的降解特性

将菌株2A种子液接种至含0.5%（g/v）蛋白胨的20 mL MSM中，调节OD₆₀₀为0.2，于每个处理分别添加终浓度为0.04 mM、0.09 mM、0.18 mM和0.30 mM α-萘酚，30℃，150 rpm摇床振荡培养。每隔12 h取500 μL培养液样品，加入等量甲醇，充分混匀后，样品过0.22 μm有机滤膜，HPLC检测样品中α-萘酚的浓度。以时间为横坐标，绘制α-萘酚浓度随时间的变化曲线，即为菌株2A对α-萘酚的降解曲线。结果如图3所示，在所测试浓度范围内（0.05-0.40mM），菌株2A对α-萘酚均具有降解能力，在48 h内菌株2A能够将0.09 mM α-萘酚完全降解，在120 h内对0.18 mM α-萘酚去除率达81%以上。

菌株2A在不同温度条件下的降解特性

将菌株2A种子液接种至含0.5%（g/v）蛋白胨和终浓度为0.10 mM α-萘酚的20 mLMSM（pH 7.0）中，调节OD₆₀₀为0.2，每个处理分别于不同的温度下（16、25、30、37和42°C），150rpm摇床振荡培养。每隔12 h取500 μL培养液样品，加入等量甲醇，充分混匀后，样品过0.22μm有机滤膜，HPLC检测样品中α-萘酚的浓度。以时间为横坐标，绘制α-萘酚浓度随时间的变化曲线，即为菌株2A在不同温度条件下的降解特性。结果如图4所示，在温度为16-37℃时，菌株2A对α-萘酚均有降解能力，其最适降解温度为30℃，在48 h能够将0.1 mM α-萘酚完全去除。

菌株2A在不同pH条件下的降解特性

将菌株2A种子液分别接种至含0.5%（g/v）蛋白胨和终浓度为0.10 mM α-萘酚的20mL不同初始pH（pH为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0）的MSM中，调节OD₆₀₀为0.2，每个处理于30，150 rpm摇床振荡培养。每隔12 h取500 μL培养液样品，加入等量甲醇，充分混匀后，样品过0.22 μm有机滤膜，HPLC检测样品中α-萘酚的浓度。以时间为横坐标，绘制α-萘酚浓度随时间的变化曲线，即为菌株2A在不同pH条件下的降解特性。结果如图5所示，在pH为7-11时，菌株2A对α-萘酚均有降解能力，其最适降解pH为7.0，在24 h能够将0.1 mM α-萘酚完全去除。

菌株2A在不同NaCl浓度条件下的降解特性

将菌株2A种子液分别接种至含0.5%（g/v）蛋白胨和终浓度为0.10 mM α-萘酚的20mL不同初始NaCl浓度（0.1、0.2、0.4、0.6和0.8 mol/L）的MSM中，调节OD₆₀₀为0.2，每个处理于30，150 rpm摇床振荡培养。每隔12 h取500 μL培养液样品，加入等量甲醇，充分混匀后，样品过0.22 μm有机滤膜，HPLC检测样品中α-萘酚的浓度。以时间为横坐标，绘制α-萘酚浓度随时间的变化曲线，即为菌株2A在不同NaCl浓度条件下的降解特性。结果如图6所示，在NaCl浓度为0.1-0.4 mol/L范围时，菌株2A对α-萘酚均有降解能力。当起始NaCl浓度为0.1mol/L，其对α-萘酚的降解速度最快，在48 h时其降解率达到92%以上。

实施例3

3.1 菌株2A对土壤中α-萘酚的降解

选取未受α-萘酚污染的土壤作为供试样品，土样经自然风干、磨碎后过20目筛，然后取一定量的α-萘酚溶于甲醇中，将其均匀拌入1 kg风干土样中，使土壤中α-萘酚终浓度均为20 mg kg^-1，接着将实施例2制备的菌株2A降解菌剂接种于1 kg风干土样中，使其初始接菌量达到1.0 × 10⁶ CFU/kg，于30℃恒温黑暗培养箱中培养，设不接种菌剂2A的相同土壤作为对照，且对照和处理均设置三个平行，期间保持土壤含水量在60％左右，培养5天后，取部分土壤样品，采用二氯甲烷连续萃取三次，合并有机相，待有机相完全挥发后加甲醇溶解，再利用高效液相色谱仪检测萃取样品中α-萘酚的残留量。结果表明本发明的菌株Micrococcus sp.2A在4天内对土壤中α-萘酚的降解率达到95.8%。

以上内容是结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，不能认定本发明具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的构思的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明所提交的权利要求书确定的保护范围。

Claims (8)

1.一种降解α-萘酚的微球菌属（Micrococcus sp.）菌株2A，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2022年8月1号，保藏编号为CCTCC NO: M20221210。

2. 根据权利要求1所述的菌株 2A在降解α-萘酚中的应用, 其特征在于，所述菌株2A在温度为16-37℃，pH为7-11，NaCl浓度为0.05-0.4 mol/L范围内对于α-萘酚具有降解能力。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述菌株用于降解高盐或碱性的土壤或水体中的α-萘酚。

4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述菌株用于降解生活污水、工业废水或海水中残留α-萘酚。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述菌株培养在蛋白胨为补充碳源的无机盐培养基中。

6.根据权利要求5所述的应用，其特在于，所述无机盐培养基为MSM培养基。

7.根据权利要求1所述的菌株 2A在制备降解α-萘酚菌剂中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，所述菌剂为液体菌剂、粉剂或颗粒制剂。