CN116688418B - 一种采用链霉菌降解3,6-二溴咔唑的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种采用链霉菌（Streptomyces globosus.FW‑32）降解3,6‑二溴咔唑的方法及其应用，属于环境有机污染物生物处理技术领域。该方法包括以下步骤：将链霉菌（Streptomyces globosus.FW‑32）接种到含3,6‑二溴咔唑的降解培养基中，33℃恒温摇床降解5 d后，采用高效液相色谱法（HPLC）测定培养基中3,6‑二溴咔唑的剩余浓度，以此分析链霉菌（Streptomyces globosus.FW‑32）对3,6‑二溴咔唑的降解效果。该方法对环境适应性强，成本较低，降解5 d后，初始浓度为1 mg/L的3,6‑二溴咔唑的降解率可达86.97%，为解决环境中3,6‑二溴咔唑的降解提供了一种更有效的方法。
Description
技术领域
本发明属于环境有机污染物生物处理技术领域，特别涉及一种采用链霉菌(Streptomyces globosus.FW-32)降解3,6-二溴咔唑的方法。
背景技术
卤代咔唑是咔唑环上的氢原子被卤素原子取代后的一种化合物。近年来，随着卤代咔唑在各种环境介质中广泛检出，特别是在河流湖泊的沉积物、土壤以及一些生物样品中均能检测出较高浓度的卤代咔唑，且卤代咔唑具有生物累积性、持久性和类二噁英毒性等多方面的毒害效应。作为一类新型的有机污染物，卤代咔唑在环境中的生态风险和健康安全效应引起了环境研究者的广泛关注。其中，3,6-二溴咔唑是目前检出率较高较为常见的一种卤代咔唑化合物。
目前，卤代咔唑的降解方法主要包括光降解及化学氧化分解，这些降解方法因为运行成本高、易造成二次污染等问题，不能成为卤代咔唑污染治理的最佳选择。微生物降解法具有环境友好和低成本的优点，因而成为最安全、经济、有效的有机污染物修复方法之一，但3,6-二溴咔唑微生物降解由于缺乏有效降解菌种而受到限制，因此3,6-二溴咔唑降解菌的筛选及应用具有一定的研究意义。从目前专利申请情况来看，尚未有3,6-二溴咔唑降解菌种的相关专利。
发明内容
本发明的首要目的在于提供一种采用链霉菌(Streptomyces globosus.FW-32)降解3,6-二溴咔唑的方法，该方法是通过从土壤中筛选降解菌，并将其投放到含有3,6-二溴咔唑的环境介质中，为3,6-二溴咔唑的降解提供有效方法。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种采用链霉菌(Streptomyces globosus.FW-32)降解3,6-二溴咔唑的方法，该降解方法包括以下步骤：
(1)取永州市某制药厂附近受污染土壤混合均匀，加入到已添加3,6-二溴咔唑的无机盐培养基中，驯化、筛选出能够降解转化3,6-二溴咔唑的菌株；
(2)将步骤(1)中筛选的菌株在LB固体培养基上活化，挑取菌株至已灭菌的LB液体培养基中富集培养，收集富集培养后的菌体，用已灭菌的无机盐培养基清洗3次并重悬，将最后一次重悬的菌体接种至灭菌的无机盐培养基中进行培养；
(3)对步骤(2)中培养后的无机盐培养基进行菌体破碎，萃取并检测无机盐培养基中残留的3,6-二溴咔唑含量，计算各菌株降解率，直至筛选出3,6-二溴咔唑高效降解菌株,将该菌保藏备用。
霉菌(Streptomyces globosus.FW-32)降解3,6-二溴咔唑的方法，包括以下步骤：
(1)将链霉菌(Streptomyces globosus.FW-32)接种到已灭菌的富集培养基中，恒温摇床振荡培养。
(2)收集菌种，然后接种于已灭菌的3,6-二溴咔唑降解培养基中，恒温摇床振荡培养。
(3)使用高效液相色谱仪测定降解培养基中的3,6-二溴咔唑，分析链霉菌(Streptomyces globosus.FW-32)对3,6-二溴咔唑的降解效果。
优选的，步骤(1)所述的富集培养基组成为：10g/L蛋白胨，10g/L NaCl，5g/L酵母粉，pH 7.0。
步骤(1)所述的培养条件为：温度为20-40℃，恒温振荡培养时间为20-30h；优选的培养条件为：温度为30℃，培养时间为24h。
步骤(2)所述的3,6-二溴咔唑降解培养基组成为：2g/L(NH4)2SO4，1.5g/LNa2HPO4·12H2O，1.5g/L K2HPO4，0.2g/L MgSO4·7H2O，0.01g/L CaCl2，1mg/L 3,6-二溴咔唑，0.1mL/L微量元素溶液，1000mL超纯水，pH为7.4。其中微量元素溶液组成：50g/LFeSO4·7H2O，2.2g/L ZnSO4·7H2O，0.3g/L CuSO4·5H2O，14.3g/L MnSO4·H2O，1.2g/LCoSO4·7H2O，0.2g/L NaMoO4，1000mL超纯水。
步骤(2)所述的培养条件为：接种量OD600＝0.5-1.0，温度20-40℃，培养时间为3-5d。优选的培养条件为：接种量为OD600＝0.9，温度为33℃，培养时间为5d。
所述的链霉菌(Streptomyces globosus.FW-32)筛选于永州市某制药厂附近受污染地区的混合土壤。在无机盐培养基中加入3,6-二溴咔唑，配置3,6-二溴咔唑浓度梯度为5、10、20、30、50、70、100、150和200mg/L的驯化培养基，采用梯度增加污染物浓度的驯化方法进行驯化。该菌外部形态呈现灰浅色，表面光滑，中心菌丝凸起呈淡粉色、边缘整齐，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏时间：2023年3月，保藏号为GDMCC No：63218。
在此条件下降解5d，初始浓度为1mg/L的3,6-二溴咔唑降解率达到86.97％。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和效果：
1、本发明提供了一种采用链霉菌(Streptomyces globosus.FW-32)降解3,6-二溴咔唑的方法，通过链霉菌(Streptomyces globosus.FW-32)对3,6-二溴咔唑的快速高效降解，能够为3,6-二溴咔唑污染治理和生物修复提供技术方法。
2、本发明中的链霉菌(Streptomyces globosus.FW-32)对环境适应性强，对3,6-二溴咔唑的降解效果较好，使用此链霉菌(Streptomyces globosus.FW-32)降解3,6-二溴咔唑的成本较低。
附图说明
图1是3,6-二溴咔唑-峰面积标准曲线图；
图2是接种链霉菌(Streptomyces globosus.FW-32)后3,6-二溴咔唑的降解情况图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
1、降解菌株的筛选
(1)采集永州市某制药厂附近受污染地区的土壤，混合均匀后取5g土壤加入到100mL含5mg/L 3,6-二溴咔唑的无机盐培养基中，于30℃、160rpm恒温摇床中培养。无机盐培养基的主要成为：2g/L(NH4)2SO4，1.5g/L Na2HPO4·12H2O，1.5g/L K2HPO4，0.2g/LMgSO4·7H2O，0.01g/L CaCl2，0.1mL/L微量元素溶液，1000mL超纯水，pH为7.0。其中微量元素溶液组成：50g/L FeSO4·7H2O，2.2g/L ZnSO4·7H2O，0.3g/L CuSO4·5H2O，14.3g/L MnSO4·H2O，1.2g/L CoSO4·7H2O，0.2g/L NaMoO4，1000mL超纯水。
(2)每7天转接1次，每次转接的同时提高3,6-二溴咔唑的浓度(按照1、2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100mg/L的浓度梯度提高)，直到3,6-二溴咔唑的浓度达到200mg/L后，采用稀释梯度法、平板涂布法对菌株进行分离纯化，挑选生长较快、形态不同的菌落，确保是纯的单一菌株后，将其接种到表面含0.5mg 3,6-二溴咔唑的无机盐固体培养基上，保存于4℃冰箱，待后续进行降解实验。无机盐固体培养基成分为：2g/L(NH4)2SO4，1.5g/LNa2HPO4·12H2O，1.5g/L K2HPO4，0.2g/L MgSO4·7H2O，0.01g/LCaCl2，0.1mL/L微量元素溶液，1000mL超纯水，pH为7.0。其中微量元素溶液组成：50g/L FeSO4·7H2O，2.2g/L ZnSO4·7H2O，0.3g/LCuSO4·5H2O，14.3g/L MnSO4·H2O，1.2g/L CoSO4·7H2O，0.2g/LNaMoO4，1000mL超纯水。
2、降解菌株的鉴定
(1)形态特征
该菌外部形态呈现灰浅色，表面光滑，中心菌丝凸起呈淡粉色、边缘整齐。
(2)16S rRNA序列
将该菌送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行菌株16SrRNA测序，鉴定菌株种属。经测定该菌株鉴定为链霉菌(Streptomyces globosus.)，16S rRNA序列如序列表所示，将菌株命名为Streptomyces globosus.FW-32，其中16S rRNA序列(共985bp)已提交到Gene bank，登录号为OQ421821。该菌可以从广东省微生物菌种保藏中心获取，保藏号为GDMCC No：63218。
实施例2链霉菌(Streptomyces globosus.FW-32)对3,6-二溴咔唑的降解分析
将链霉菌(Streptomyces globosus.FW-32)接种到已灭菌的富集培养基中，30℃，160rpm，恒温振荡培养24h。富集培养基的主要成分为：10g/L蛋白胨，10g/L NaCl，5g/L酵母粉，pH 7.0。
将富集培养后的菌液以4000rpm离心1min，收集菌体并用无菌生理盐水反复洗涤3次，然后加入已灭菌的降解培养基进行降解实验，接种量为OD600＝0.9，培养条件为33℃，160rpm，恒温振荡5d，进行菌体破碎和萃取，所得样品经过高效液相色谱仪测定，分析菌体对3,6-二溴咔唑的降解效果。降解培养基组成为：2g/L(NH4)2SO4，1.5g/L Na2HPO4·12H2O，1.5g/L K2HPO4，0.2g/L MgSO4·7H2O，0.01g/L CaCl2，1mg/L 3,6-二溴咔唑，0.1mL/L微量元素溶液，1000mL超纯水，pH为7.4。其中微量元素溶液组成：50g/L FeSO4·7H2O，2.2g/LZnSO4·7H2O，0.3g/L CuSO4·5H2O，14.3g/L MnSO4·H2O，1.2g/L CoSO4·7H2O，0.2g/LNaMoO4，1000mL超纯水。
3,6-二溴咔唑的浓度采用高效液相色谱仪测定，分析条件如下：
(1)高效液相色谱条件：
色谱柱：ZORBAX Rx-C18(4.6mm×250mm，5μm)。流速0.8mL/min，检测波长为239nm，温度30℃，水：乙腈为20％：80％，进样量为10μL。
配置3,6-二溴咔唑浓度分别为0.1、0.3、0.4、0.5、1.0mg/L的标准溶液，绘制3,6-二溴咔唑—峰面积标准曲线，标准曲线如图1所示。以没有投加链霉菌(Streptomycesglobosus.FW-32)的样品为对照组(对照组除了没有投加菌种以外，其余操作和参数均与实验组相同)，降解5d后，测得对照组的降解培养基中3,6-二溴咔唑的最终剩余浓度为0.999mg/L，而实验组的降解培养基中3,6-二溴咔唑最终剩余浓度为0.1303mg/L，通过比较计算可以得到，实验组的降解效率为86.97％，结果如图2所示。
施例3
实施例3同实施例2，只是降解过程中，降解培养基中OD600＝0.5，最终链霉菌(Streptomyces globosus.FW-32)对3,6-二溴咔唑的降解率为70.05％。
实施例4
实施例4同实施例2，只是降解过程中，温度分别为20℃和40℃，最终链霉菌(Streptomyces globosus.FW-32)对3,6-二溴咔唑的降解率分别为58.59％和65.76％。
实施例5
实施例5同实施例2，只是降解过程中，培养时间为3d，最终链霉菌(Streptomycesglobosus.FW-32)对3,6-二溴咔唑的降解率为71.40％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种采用链霉菌（Streptomyces globosus）FW-32降解3,6-二溴咔唑的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将链霉菌（Streptomyces globosus）FW-32接种到已灭菌的富集培养基中，摇床中振荡培养；
（2）收集菌种，然后接种于已灭菌的3,6-二溴咔唑降解培养基中摇床振荡培养；
（3）使用高效液相色谱仪测定降解培养基中的3,6-二溴咔唑，分析链霉菌（Streptomyces globosus）FW-32对3,6-二溴咔唑的降解效果；
所述链霉菌（Streptomyces globosus）FW-32保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏时间：2023年3月，保藏号为GDMCC No：63218。
2.根据权利要求1所述的一种采用链霉菌（Streptomyces globosus）FW-32降解3,6-二溴咔唑的方法，其特征在于：步骤（1）所述的富集培养基组成为：10 g/L蛋白胨，10 g/LNaCl，5 g/L酵母粉，pH为7.0。
3.根据权利要求1所述的一种采用链霉菌（Streptomyces globosus）FW-32降解3,6-二溴咔唑的方法，其特征在于：步骤（1）所述的培养条件为：温度为30℃，培养时间为24 h。
4.根据权利要求1所述的一种采用链霉菌（Streptomyces globosus）FW-32降解3,6-二溴咔唑的方法，其特征在于：步骤（2）所述的3,6-二溴咔唑降解培养基组成为：2 g/L (NH4)2SO4，1.5 g/L Na2HPO4·12H2O，1.5 g/L K2HPO4，0.2 g/L MgSO4·7H2O，0.01 g/L CaCl2，1mg/L 3,6-二溴咔唑，0.1 mL/L微量元素溶液，1000 mL超纯水，pH为7.4；其中微量元素溶液组成：50 g/L FeSO4·7H2O，2.2 g/L ZnSO4·7H2O，0.3 g/L CuSO4·5H2O，14.3 g/LMnSO4·H2O，1000 mL超纯水。
5.根据权利要求1所述的一种采用链霉菌（Streptomyces globosus）FW-32降解3,6-二溴咔唑的方法，其特征在于：步骤（2）所述的降解培养条件为：接种量OD600 = 0.9，温度33℃，培养时间为5 d。
6.权利要求1-5任一项所述的一种采用链霉菌（Streptomyces globosus）FW-32降解3,6-二溴咔唑的方法在卤代咔唑污染生物修复方面的应用；
所述卤代咔唑为3,6-二溴咔唑。
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-
2023
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|---|
| Occurrence, Biological Activity, and Convergent Organometallic Synthesis of Carbazole Alkaloids;Hans-Joachim Knölker;Top Curr Chem;第244卷;第115-148页 * |
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