CN114410551B

CN114410551B - 一株农药中间体降解菌株、培养方法及其菌剂和应用

Info

Publication number: CN114410551B
Application number: CN202210288234.5A
Authority: CN
Inventors: 董晓梦; 邱沪生; 吴康莉; 杨倩
Original assignee: Jiangsu Puhou Environmental Engineering Co ltd
Current assignee: Jiangsu Puhou Environmental Engineering Co ltd
Priority date: 2022-03-23
Filing date: 2022-03-23
Publication date: 2022-06-03
Anticipated expiration: 2042-03-23
Also published as: CN114410551A

Abstract

本发明公开了一种农药中间体降解菌株，降解菌株为反硝化无色杆菌（Achromobacter denitrificans）PH‑1，于2021年12月6日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号为：CGMCC NO.24038。本发明的农药中间体降解菌株PH‑1可以耐受高浓度的氯化钠，并且对农药废水中的有机污染物2‑氯‑5‑氯甲基吡啶及其吡虫啉、氟啶胺、精吡氟禾草灵等下游产品具有高效降解能力。

Description

一株农药中间体降解菌株、培养方法及其菌剂和应用

技术领域

本发明涉及农药生物降解技术领域，具体涉及一株农药中间体降解菌株、培养方法及其菌剂和应用。

背景技术

在农药生产过程中，农药废水产生量大，主要来源为农药生产过程中产生的废水及清洗生产设备产生的废水。废水中有机物污染物浓度高，含有很多副产物和中间产物，盐度高，并且农药废水毒性很大，除含有农药和中间体外，还含有苯、酚、汞等有毒物质以及许多生物难以降解的物质，再加上农药废水水质、水量不稳定性等问题，给其处理增加了难度，如不进行有效处理，将会严重破坏生态环境。

生物降解法是处理农药废水的有效方法之一，与传统的理化处理方法相比，具有节能减排、针对性强、处理工艺成本低、不产生二次污染、环保、适应大批量水处理等优点。生物降解法的原理是利用微生物的代谢将农药废水中的有机物同化或分解，该法处理农药废水的关键是筛选出降解相应污染物的高效降解菌种，常用的污泥驯化是获得适宜菌种的有效途径。为了提高生物法的处理效果，需要驯化培养出既能在具有生物毒性的废水中生存，又能耐受高盐的高效降解菌株。

2-氯-5-氯甲基吡啶(CCMP)是一种重要的医药中间体和合成吡啶类农药原药如吡虫啉、啶虫脒、噻虫啉、烯啶虫胺、氟啶胺、氟啶脲和精吡氟禾草灵等的重要中间体，2-氯-5-氯甲基吡啶还可以衍生为2-氯-5-三氟甲基吡啶、2-氯-3-三氯甲基吡啶、2，3-二氯-三氟甲基吡啶等重要的医药中间体。这些农药及其中间体易在生物体内累积且难以生物降解，对环境和人类健康的危害不能忽视。因此，有必要继续筛选能高效降解农药且降解性状稳定的菌株实现菌剂的大规模工业化生产，为农药废水中对氯苯甲酸的降解提供高效的微生物种质资源。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一株农药中间体降解菌株、培养方法及其菌剂和应用，耐受高浓度的氯化钠，具有高效降解能力。

为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

一株农药中间体降解菌株，降解菌株为反硝化无色杆菌（Achromobacterdenitrificans）PH-1，于2021年12月6日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号为：CGMCC NO.24038。

一种上述降解菌株PH-1在高盐条件下降解农药中间体及下游产品中的应用。

一种利用上述降解菌株PH-1生产的菌剂。

一种上述菌剂在高盐条件下降解农药中间体及下游产品中的应用。

优选地，高盐条件为氯化钠浓度为10~80 g/L。

再优选地，农药中间体为2-氯-5-氯甲基吡啶，下游产品为吡虫啉、氟啶胺和精吡氟禾草灵中的一种或多种。

一种上述菌剂的制备方法，包括以下具体步骤：

S1、将斜面保存的菌株PH-1，接种至LB固体培养基中进行活化培养；

S2、将活化后的菌株PH-1挑取单菌落接种至LB液体培养基，培养至对数生长期，然后离心收集菌体细胞，菌体细胞用磷酸盐缓冲液洗涤，将收集的细菌细胞悬浮在磷酸盐缓冲液中，作为种子液；

S3、将种子液以10％的接种量接种到发酵培养基中进行发酵培养，培养至对数生长期，发酵结束后所得发酵液即为降解菌剂。

优选地，前述步骤S1中，培养条件为：温度25~35℃，时间12~24h；LB固体培养基的组份如下：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L和琼脂2%。

优选地，前述步骤S2中，培养条件为：温度30~35℃，转速160~180rpm时间12~24h；LB液体培养基的组份如下：2-氯-5-氯甲基吡啶0.5g/L、蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L和NaCl 10g/L。

优选地，前述步骤S3中，发酵培养基的组份如下：葡萄糖8g/L、酵母提取物5g/L、K₂HPO₄ 1g/L、NaCl 5g/L、CaCO₃ 2g/L、MgSO₄ 0.2 g/L和2-氯-5-氯甲基吡啶0.5g/L，pH值7.2~7.5；发酵培养条件为：无菌空气的通气量与发酵培养基的体积比为1：0.6~1.2，搅拌速度为180~240rpm，培养温度为30~35℃，全流程培养时间为96~108h。

农药中间体降解菌株的筛选方法，包括以下具体步骤：

（1）将污水处理厂生化池中的活性污泥，加入无机盐培养基中驯化培养；

（2）取驯化后的污泥，加入无机盐培养基中培养；

（3）按步骤（2）的培养条件连续富集培养4~5次，取第五次富集培养液稀释后涂布于R2A固体培养基中，培养至菌落长出；

（4）将步骤（3）中所得菌落在无机盐固体培养基上划线纯化后，获得降解菌株PH-1。

优选地，前述步骤（1）中，培养为振荡培养，振荡培养的条件为：温度25~35℃、转速160~180 rpm、时间4~5d；无机盐培养基包括以下成分：2-氯-5-氯甲基吡啶0.5g/L、NaCl1.0g/L、（NH₄）₂SO₄ 1.0g/L、K₂HPO₄ 1.5 g/L、KH₂PO₄0.5g/L、MgSO₄•7H₂O 0.2g/L和水1L，pH为 7.0，固体培养基中加入 2% 的琼脂。

再优选地，前述步骤（2）中，驯化后的污泥为5g，无机盐培养基的容积为100 mL，培养条件为：温度25~35℃、转速160~180 rpm、时间3d。

更优选地，前述步骤（3）中，培养至菌落长出的培养温度为25~35℃；R2A固体培养基包括以下成分：葡萄糖0.5g/L、可溶性淀粉0.5g/L、酪蛋白0.5g/L、酵母提取物0.5g/L、胰蛋白胨0.5g/L、MgSO₄•7H₂O 0.05g/L、KH₂PO₄ 0.3g/L、丙酮酸钠 0.3 g/L和水1L，pH为 7.2，R2A固体培养基中加入 2% 的琼脂。

菌株PH-1在LB平板上的菌落形态呈圆形，轻微隆起，淡黄色，湿润，半透明，边缘整齐，光滑（见图1）；主要生物学特征为无芽孢、短杆状细菌，革兰氏染色阴性（见图2）。

本发明的有益之处在于：

（1）本发明的农药中间体降解菌株PH-1可以耐受高浓度的氯化钠，并且对农药废水中的有机污染物2-氯-5-氯甲基吡啶及其吡虫啉、氟啶胺、精吡氟禾草灵等下游产品具有高效降解能力；

（2）本发明的处理工艺操作简单，处理成本低，为农药生产过程中产生的农药废水中有机物的降解，提供了高效的微生物种质资源，具有较强的实用价值，可以在此基础上进行工程应用。

附图说明

图1 是本发明菌株PH-1的菌落形态照片；

图2是本发明菌株PH-1的革兰氏染色照片；

图3是本发明菌株PH-1对CCMP的降解及生长曲线；

图4是本发明菌株PH-1对不同CCMP下游产品的降解效果；

图5是本发明温度对菌株PH-1降解效果的影响；

图6是本发明NaCl浓度对菌株PH-1降解效果的影响。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。

实施例1

降解菌株PH-1的分离筛选与鉴定：

1. 降解菌株PH-1的分离筛选

本发明提供一种高效降解农药的降解菌株PH-1，分离自某污水处理厂的活性污泥。具体的菌株培养方法为：取污水处理厂生化池中活性污泥，加入含有CCMP的无机盐培养基中驯化培养；取驯化后的污泥5g，加入100mL的无机盐培养基中，30℃，160rpm条件下恒温振荡培养；培养5天后，以5%（V/V）的接种量接入到新鲜无机盐培养基中，连续富集转接4次；取1mL富集液用无菌水稀释至不同浓度梯度（10-2-10-6），取不同浓度梯度的稀释液0.2mL，涂布在含100mg/L CCMP的R2A琼脂培养基平板上，置于30℃恒温培养箱中培养，待长出菌落后，挑取单菌落进行划线分离纯化。在无机盐培养基中转接分离纯化后的菌株，在摇床中30℃，160rpm恒温培养3天，通过高效液相色谱验证菌株的降解效果，将有降解效果的菌株经进一步纯化后保存于-80℃冰箱中备用。

无机盐培养基成分：2-氯-5-氯甲基吡啶0.5g/L、NaCl 1.0g/L、（NH₄）₂SO₄ 1.0g/L、K₂HPO₄ 1.5 g/L、KH₂PO₄0.5g/L、MgSO₄•7H₂O 0.2g/L和水1L，pH 7.0，固体培养基中加入 2%的琼脂，培养基121℃灭菌30min。

R2A培养基成分：葡萄糖0.5g/L、可溶性淀粉0.5g/L、酪蛋白0.5g/L、酵母提取物0.5g/L、胰蛋白胨0.5g/L、MgSO₄•7H₂O 0.05g/L、KH₂PO₄ 0.3g/L、丙酮酸钠 0.3 g/L和水1L，pH 7.2，培养基中加入 2% 的琼脂，培养基121℃灭菌30min。

2. 降解菌株PH-1的鉴定

经分离培养，筛选到一株可以高效降解CCMP的菌株，命名为PH-1。该菌株经鉴定属于Achromobacter denitrificans，并于2021年12月6日保存于保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号为：CGMCC NO.24038，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。菌株PH-1在LB平板上的菌落形态呈圆形，轻微隆起，淡黄色，湿润，半透明，边缘整齐，光滑（见图1）；主要生物学特征为无芽孢、短杆状细菌，革兰氏染色阴性（见图2）。菌株PH-1的16S rRNA基因序列经构建系统进化树比对分析，结果表明该菌株与模式菌株Achromobacter denitrificans strain NBRC 15125进化关系最近。根据以上形态和16S rRNA基因序列分析结果，将菌株PH-1鉴定为Achromobacter denitrificans。

实施例2

降解菌株PH-1的降解效果：

挑取实施例1中筛选获得的降解菌株PH-1单菌落接种于50mL LB培养基中，于30℃、160rpm条件下富集培养至OD600=1.0，所得培养液于4℃、10000g离心10min，收集菌体，用无菌磷酸盐缓冲液洗涤三次后重悬于磷酸盐缓冲液中作为菌悬液。将所得菌悬液以5％体积比接种至以CCMP为唯一碳源的无机盐培养基中，培养液中CCMP浓度为500mg/L，于30℃、160rpm条件下恒温振荡培养84h，定时取样，测定相应的OD600值及培养液中CCMP浓度，实验重复三次。绘制菌株PH-1对CCMP的降解及生长曲线，见图3。

根据图3可知，菌株PH-1能以CCMP作为唯一碳源生长，降解36h可达44％，60 h可达88％，72 h可达90％，这一结果表明菌株PH-1可以快速、高效的降解CCMP，为CCMP污染的修复提供了一种新的优良的微生物种质资源。

实施例3

降解菌株PH-1对CCMP下游产品的降解效果：

分别配置终浓度为200mg/L的吡虫啉、氟啶胺和精吡氟禾草灵的无机盐培养基，调至培养基pH为7。挑取实施例1中筛选获得的降解菌株PH-1单菌落接种于50mL LB培养基中，于30℃、160rpm条件下富集培养至OD600＝1.0，所得菌液按体积5%（V/V）的接种量接种到含不同农药的培养基中，30℃、160 rpm 的恒温震荡箱中培养，72 h 后检测降解情况，降解效果如图4所示。

根据图4可知，菌株PH-1可有效降解2-氯-5-氯甲基吡啶的下游产品，对吡虫啉、氟啶脲和精吡氟禾草灵的降解率均在70%以上。

实施例4

温度和NaCl浓度对菌株PH-1降解效果的影响：

1.温度对菌株PH-1降解效果的影响：

将降解菌株PH-1菌悬液以5％体积比接种至浓度为200mg/L 的CCMP、吡虫啉、氟啶胺和精吡氟禾草灵的无机盐培养基中，在160rpm条件下振荡培养72 h，温度分别设定为15℃、20℃、35℃、30℃、35℃和40℃，HPLC检测培养基中的CCMP、吡虫啉、氟啶胺和精吡氟禾草灵浓度并计算降解率。

根据图5可知，菌株PH-1在20~35℃的温度范围内可有效降解污染物，在温度30~35℃时降解率最高。

2.NaCl浓度对菌株PH-1降解效果的影响：

调节无机盐培养基中NaCl浓度分别为 1.0 g/L、10 g/L、20 g/L、40 g/L、60 g/L、80 g/L，将菌悬液以5％体积比接种至含200mg/LCCMP、吡虫啉、氟啶胺和精吡氟禾草灵的无机盐培养基中，30℃、160rpm条件下振荡培养24h，HPLC检测培养基中的CCMP、吡虫啉、氟啶胺和精吡氟禾草灵浓度并计算降解率，验证菌株PH-1在不同盐浓度环境中的降解效果。

根据图6可知，在10~80 g/L的NaCl浓度范围内，菌株PH-1具有较高的降解效率，表明菌株PH-1具有良好的耐盐性，为高盐度农药废水处理提供了有利条件。

实施例5

降解菌剂的制备：

将本发明斜面保存的菌株PH-1，接种至LB固体培养基于30℃活化培养；活化后挑取单菌落接种至LB液体培养基（LB液体培养基组分：2-氯-5-氯甲基吡啶0.5g/L、蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L和NaCl 10g/L），30℃、160rpm振荡培养至对数生长期，然后离心收集菌体细胞；将收集的菌体细胞用磷酸盐缓冲液洗涤3次后，悬浮在磷酸盐缓冲液（pH7.2）中，作为种子液；将所得种子液以10％的接种量接种到发酵培养基中，发酵培养基组成为：葡萄糖8 g/L、酵母提取物5 g/L、K₂HPO₄ 1 g/L、NaCl 5 g/L、CaCO₃ 2g/L、MgSO₄ 0.2 g/L、2-氯-5-氯甲基吡啶0.5g/L，pH值7.2~7.5，然后通入无菌空气，无菌空气的通气量与发酵培养基的体积比为1：0.8，于发酵温度30℃，搅拌速度为220rpm的条件下发酵培养96h，使发酵液中活菌数CFU/mL为10⁸~10⁹个，发酵结束后所得发酵液即为微生物降解菌剂。发酵液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。

实施例6

降解菌剂在降解农药中间体及下游产品中的应用：

将上述生产的微生物降解菌剂按一定的用量比直接投加到含2-氯-5-氯甲基吡啶或下游产品的高盐工业废水中，其中下游产品为吡虫啉、氟啶胺和精吡氟禾草灵中的一种或多种，高盐条件为氯化钠浓度为80g/L，微生物菌剂与2-氯-5-氯甲基吡啶或吡虫啉、氟啶胺或精吡氟禾草灵的用量比为0.2mL/mg。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

序列表

<110> 江苏朴厚环境工程有限公司

<120> 一株农药中间体降解菌株、培养方法及其菌剂和应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1431

<212> DNA

<213> 反硝化无色杆菌(Achromobacter denitrificans)

<400> 1

ggttcgggag cttacacatg cagtcgaacg gcagcacgga cttcggtctg gtggcgagtg 60

gcgaacgggt gagtaatgta tcggaacgtg cccagtagcg ggggataact acgcgaaagc 120

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cagtctgcaa ctcgactgcg tgaagtcgga atcgctagta atcgcggatc agcatgtcgc 1320

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cagaagtagt tagcctaacc gtaaggaggg cgataccacg tagattcctg g 1431

Claims

1.一株农药中间体降解菌株，其特征在于，所述降解菌株为反硝化无色杆菌（Achromobacter denitrificans）PH-1，于2021年12月6日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号为：CGMCC NO.24038。

2.一种权利要求1所述的降解菌株PH-1在高盐条件下降解农药中间体及下游产品中的应用，所述高盐条件为氯化钠浓度为10~80 g/L，所述农药中间体为2-氯-5-氯甲基吡啶，所述下游产品为吡虫啉、氟啶胺和精吡氟禾草灵中的一种或多种。

3.一种利用权利要求1所述的降解菌株PH-1生产的菌剂。

4.一种权利要求3所述的菌剂在高盐条件下降解农药中间体及下游产品中的应用，所述高盐条件为氯化钠浓度为10~80 g/L，所述农药中间体为2-氯-5-氯甲基吡啶，所述下游产品为吡虫啉、氟啶胺和精吡氟禾草灵中的一种或多种。

5.一种权利要求3所述的菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下具体步骤：

S3、将种子液接种到发酵培养基中进行发酵培养，培养至对数生长期，发酵结束后所得发酵液即为降解菌剂。

6.根据权利要求5所述菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，培养条件为：温度25~35℃，时间12~24h；LB固体培养基的组份如下：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl10g/L和琼脂2%。

7.根据权利要求5所述菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，培养条件为：温度30~35℃，转速160~180rpm时间12~24h；LB液体培养基的组份如下：2-氯-5-氯甲基吡啶0.5g/L、蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L和NaCl 10g/L。

8.根据权利要求5所述菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中，发酵培养基的组份如下：葡萄糖8g/L、酵母提取物5g/L、K₂HPO₄ 1g/L、NaCl 5g/L、CaCO₃ 2g/L、MgSO₄ 0.2 g/L和2-氯-5-氯甲基吡啶0.5g/L，pH值7.2~7.5；发酵培养条件为：无菌空气的通气量与发酵培养基的体积比为1：0.6~1.2，搅拌速度为180~240rpm，培养温度为30~35℃，全流程培养时间为96~108h。