CN113800652B - 一种耐盐好氧反硝化菌及其耦合活性炭在强化水体污染治理中的应用 - Google Patents

一种耐盐好氧反硝化菌及其耦合活性炭在强化水体污染治理中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种耐盐好氧反硝化菌及其耦合活性炭在强化水体污染治理中的应用。卓贝儿氏菌(Zobellella sp.)Y61，保藏编号为：GDMCC NO:61848。本发明的卓贝儿氏菌Y61具有耐盐好氧反硝化的功能，其耦合果壳活性炭(10‑24目)可以提高水体中总氮和有机物的去除速率，为污染水体净化提供了一种新方法。

Description

一种耐盐好氧反硝化菌及其耦合活性炭在强化水体污染治理 中的应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种耐盐好氧反硝化功能的卓贝儿氏菌(Zobellella sp.)Y61及其耦合活性炭在强化水体污染治理中的应用。
背景技术
受污染水体的有效净化是保护水生态安全与健康的重要前提。由于氮循环与多种物质循环过程紧密耦联，也是决定水体富营养化程度的重要因素，因此氮素的去除效果倍受关注。传统生物脱氮过程是通过好氧条件下的硝化反应先将氨氮氧化为硝酸盐，再通过缺氧条件下的反硝化反应将硝酸盐还原为气态氮从水中去除。微生物的反硝化效率是决定水体脱氮效果的关键。
然而，受污染水体中除了含有较高浓度的有机物和氮素外，往往还含有一定的盐度，溶解氧浓度也有较大波动。已发现的反硝化细菌大部分为严格厌氧菌或兼性厌氧菌，只能在厌氧或缺氧条件下才能发挥反硝化作用，水体中的溶解氧及盐度都能在一定程度上抑制这些反硝化细菌的功能活性。近年来，越来越多的研究发现，自然界中存在着可以在一定盐浓度和溶解氧条件下完成反硝化功能的好氧反硝化菌，而且活性炭材料可以在一定程度上促进微生物的功能，使水体污染治理效率显著提高。但目前已分离获取的耐盐好氧反硝化菌种资源极少，尚不清楚耐盐好氧反硝化菌耦合活性炭强化水体污染治理的效果。
卓贝儿氏菌(Zobellella sp.)为革兰氏阴性菌，已发现这类微生物具有耐盐好氧反硝化功能，但目前尚未见有关这类微生物耦合活性炭强化水体污染治理的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种耐盐好氧反硝化功能的卓贝儿氏菌(Zobellellasp.)Y61及其在水体污染治理中的应用，能同时去除污染水体中的硝酸盐和有机物，该细菌于2021年7月30日保存于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所，邮编：510070，保藏编号为：GDMCC NO:61848。
本发明的卓贝儿氏菌(Zobellella sp.)Y61是通过对阳江海洋渔业养殖水体进行富集培养、分离和纯化得到的Zobellella属的一个物种。卓贝儿氏菌(Zobellella sp.)Y61在固体平板上菌落为圆形，白色，凸起，表面光滑，边缘齐整，直径为0.2-0.5mm。该菌在好氧和厌氧条件下都能生长，生长温度为10～42℃，最适合生长温度为30-35℃，生长pH为6.0～9.0，最适生长pH为7.0～8.0，盐度耐受范围为0-8％，最适生长盐度范围为1-3％。通过单一碳源利用鉴定，发现能利用多种碳源，包括葡萄糖、果糖、蔗糖、乙酸钠、丙酮酸钠和麦芽糖等。该菌经16S rDNA基因序列测序，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，测序结果在GenBank数据库中使用BLAST进行比对，菌株与Zobellella endophytica 59N8T序列相似度最高(98.4％)，与Zobellella taiwanensis ZT1T次之(98.3％)。
卓贝儿氏菌(Zobellella sp.)Y61的好氧反硝化功能特征：在溶解氧浓度为0-8mg/l条件下，Y61能将硝酸盐还原，且总氮浓度下降，有机物减少，说明卓贝儿氏菌Y61具有好氧反硝化的功能。
卓贝儿氏菌(Zobellella sp.)Y61耦合果壳活性炭(10-24目)功能的作用特征：在溶解氧浓度为0-8mg/l、盐浓度为0-8％的条件下，Y61与果壳活性炭共培养能提高总氮和有机物的去除率，说明卓贝儿氏菌Y61具有耐盐好氧反硝化的功能。
卓贝儿氏菌(Zobellella sp.)Y61具有好氧反硝化的功能，在含有120mg/L硝酸盐和有机物的液体培养基中好氧培养，总氮去除率在72h前后达到最大值53.5％，同时有机物浓度也降低。卓贝儿氏菌(Zobellella sp.)Y61耦合果壳活性炭(10-24目)在含有120mg/L硝酸盐和有机物的液体培养基中好氧培养，最快在36h内就可以把总氮降到0，同时有机物去除率也达到84.8％。并且，卓贝儿氏菌Y61耦合果壳活性炭的共培养颗粒可以持续重复使用、且保持高的降解率。
因此，本发明的第二个目的是提供卓贝儿氏菌Y61在水体污染治理中的应用或者一种水体污染治理的方法，其是将卓贝儿氏菌Y61投加到污染水体中。
优选，是卓贝儿氏菌Y61结合多孔活性炭在水体污染治理中的应用。
优选，是去除污染水体中的硝酸盐和/或有机物。
优选，是在溶解氧浓度为0-8mg/l、盐浓度为0-8％的条件下，卓贝儿氏菌Y61结合多孔活性炭利用有机物和/或硝酸盐进行反硝化作用，去除污染水体中的硝酸盐和/或有机物。
优选，所述的卓贝儿氏菌Y61结合多孔活性炭是将卓贝儿氏菌Y61培养物和多孔活性炭一起投加到污染水体中。
所述的污染水体是渔业养殖水体，如海洋渔业养殖水体。
优选，所述的多孔活性炭是10-24目的果壳活性炭。
本发明的第三个目的是提供一种去除污染水体中的硝酸盐和/或有机物的菌剂，其含有卓贝儿氏菌Y61作为活性成分。
优选，还含有多孔活性炭。
本发明的卓贝儿氏菌Y61具有耐盐好氧反硝化的功能，其耦合果壳活性炭(10-24目)可以提高水体中总氮和有机物的去除速率，为污染水体净化提供了一种新方法。
Zobellella sp.Y61于2021年7月30日保存于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，邮编：510070，保藏编号为：GDMCC NO:61848。
附图说明
图1是卓贝儿氏菌(Zobellella sp.)Y61的透射电镜图。
图2是卓贝儿氏菌(Zobellella sp.)Y61进行好氧反硝化作用时的TN浓度随时间变化曲线，其中CK代表对照，Y61代表实验组。
图3是卓贝儿氏菌(Zobellella sp.)Y61进行好氧反硝化作用时的TC和TOC浓度随时间变化曲线，其中CK代表对照，Y61代表实验组。
图4是卓贝儿氏菌(Zobellella sp.)Y61耦合果壳活性炭在不同溶解氧浓度条件下对TN的去除效果，其中CK代表对照，0、60、120、180r/min-TN代表实验组，在不同转速下。
图5是卓贝儿氏菌(Zobellella sp.)Y61耦合果壳活性炭在不同溶解氧浓度条件下对TC和TOC的去除效果，其中CK代表对照，0、60、120、180r/min代表实验组，在不同转速下。
图6是卓贝儿氏菌(Zobellella sp.)Y61耦合果壳活性炭颗粒传代培养TN的去除效果。
图7是卓贝儿氏菌(Zobellella sp.)Y61耦合果壳活性炭在不同盐度下对TN的去除效果，其中CK代表对照，0％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％NaCl-TN代表实验组，在不同盐度条件下。
图8是卓贝儿氏菌(Zobellella sp.)Y61耦合果壳活性炭在不同盐度下对TC的去除效果，其中CK代表对照，0％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％NaCl-TC代表实验组，在不同盐度条件下。
图9是卓贝儿氏菌(Zobellella sp.)Y61耦合果壳活性炭在不同盐度下对TOC的去除效果，其中CK代表对照，0％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％NaCl-TOC代表实验组，在不同盐度条件下。
图10是卓贝儿氏菌(Zobellella sp.)Y61耦合果壳活性炭对海洋渔业养殖废水中TN、TC和TOC的去除效果，其中CK代表对照，EG代表实验组。
具体实施方式
下面结合实施案例对本发明进行进一步的阐述，但不是对本发明的限制。
实施例1：卓贝儿氏菌(Zobellella sp.)Y61的分离和鉴定
将取样于广东省阳江市海洋渔业养殖系统的水样5mL，加入50mL富集培养基(KNO31.0g，MgSO4 3.0g，MgCl2 2.0g，CaCl2 1.0g，K2HPO4 0.1g，FeSO4·7H2O 0.1g，NaHCO3 0.2g，KCl 0.7g，NaCl 15.0g，丁二酸钠1.0g，去离子水1L，pH7.5，固体培养基加入20g/L琼脂，灭菌消毒后备用)，在30℃摇床160rpm/min条件下培养。培养5天后，按照10％的接种量转接到新的富集培养基中，然后放入摇床中继续培养，相同的转接操作重复4次。将富集培养物通过稀释涂平板的方法在固体培养基上涂布，将涂布好的平板置于培养箱30℃倒置培养2-3天后，挑取生长出来的单菌落划线，多次重复划线直至纯化为纯菌。
将分离获得的菌株接种到富集培养基中，在摇床30℃条件下160r/min培养2天、4天后，吸取200μL的培养液，滴加2滴格里斯试剂A液和B液的等量混合物，立即出现红色，表明有亚硝酸盐存在，硝酸盐还原为阳性。如果不呈红色，再滴加2滴二苯胺试剂，观察有无蓝色出现，如果有蓝色出现，说明培养液中的硝酸钾仍然存在并没有被利用，硝酸盐还原试验为阴性，如果不呈蓝色，说明培养液中的硝酸钾已经由亚硝酸盐还原为氨或者氮气，试验也为阳性。将分离获得的好氧反硝化功能菌株接种到富集培养基试管中，试管里放置杜氏小管收集气体，并做不添加硝酸盐的空白对照用以验证菌株的产气，培养至杜氏小管产生气体，气体量不再增加作为反应的终点，并测初始培养基和反应终点培养基的总氮浓度变化。筛选得到硝酸盐降解最快的菌株Y61，尽快送样测序，鉴定菌种。
菌株Y61送到北京擎科生物科技有限公司进行16S rRNA基因测序，使用细菌通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′)对菌落的16S rRNA基因进行扩增，所得两条正反序列用Contig Express软件进行拼接，其序列如SEQ ID NO.1所示，拼接序列在GenBank数据库中使用BLAST进行比对分析，菌株Y61(本实验中对硝酸盐降解最快的菌株)与Zobellella endophytica 59N8T序列相似度最高(98.4％)，与Zobellella taiwanensis ZT1T次之(98.3％)。
将菌株Y61进行形态学和生理生化鉴定。卓贝儿氏菌(Zobellella sp.)Y61在固体平板上菌落为圆形，白色，凸起，表面光滑，边缘齐整，直径为0.2-0.5mm(图1)。该菌在好氧和厌氧条件下都能生长，生长温度为10～42℃，最适合生长温度为30-35℃，生长pH为6.0～9.0，最适生长pH为7.0～8.0，盐度耐受范围为0-8％，最适生长盐度范围为1-3％。通过单一碳源利用鉴定，发现能利用多种碳源，包括葡萄糖、果糖、蔗糖、乙酸钠、丙酮酸钠和麦芽糖等。
结合形态、生理生化结果和16S rDNA基因序列分析，初步鉴定菌株Y61为Zobellella sp.。命名为卓贝儿氏菌(Zobellella sp.)Y61，该细菌于2021年7月30日保存于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，邮编：510070，保藏编号为：GDMCC NO：61848。
实施例2：卓贝儿氏菌(Zobellella sp.)Y61在好氧条件下的反硝化功能
配置液体培养基(蔗糖2.0g，丙酮酸钠2.0g，KNO3 1.0g，KCl 1.0g，MgSO4·7H2O1.0g，K2HPO4 0.5g，NaCl 15.0g，去离子水1L，pH7.5)，灭菌后冷却至室温，无菌条件下分装200mL培养基至300mL锥形瓶中，实验分为两组：(1)有菌实验组，将卓贝儿氏菌Y61提前培养至对数期，取100μL接种到已灭菌处理的液体培养基中，混合均匀；(2)无菌对照组，不接种卓贝儿氏菌Y61菌株的已灭菌处理的液体培养基。所有锥形瓶置于摇床30℃条件下60r/min培养，实验组和对照组均设置3个平行，分别在0天、0.5天、1天、1.5天、2天、3天和4天取样测定TN、TC和TOC浓度变化，分析卓贝儿氏菌Y61的好氧反硝化能力。结果如图2和图3所示，由图可知，卓贝儿氏菌Y61在72h前后TN去除率达到最大值53.5％，同时TC和TOC的浓度也下降了。然而，未添加卓贝儿氏菌Y61的对照组中TN、TC和TOC浓度基本没有变化。
本案例说明卓贝儿氏菌Y61在好氧条件下对硝酸盐和有机物具有良好的去除效果，具备好氧反硝化功能。
实施例3：卓贝儿氏菌(Zobellella sp.)Y61耦合果壳活性炭在好氧条件下的反硝化功能
配置液体培养基(蔗糖1.0g，KNO3 1.0g，KCl 1.0g，MgSO4·7H2O 1.0g，K2HPO40.5g，NaCl 15.0g，去离子水1L，pH7.5)，充分搅拌溶解后分装200mL培养基至300mL锥形瓶中，加入培养基质量0.5％果壳活性炭(10-24目)到培养基中，灭菌后使用，无菌条件下实验分为两组：(1)有菌实验组，将卓贝儿氏菌Y61提前培养至对数期，取100μL接种到已灭菌处理的液体培养基中，混合均匀；(2)无菌对照组，不接种卓贝儿氏菌Y61菌株的已灭菌处理并加入果壳活性炭的液体培养基。所有锥形瓶置于摇床30℃条件下0、60、120和180r/min培养，每个实验组和对照组均设置3个平行，分别在0天、0.5天、1天、1.5天、2天和3天取样测定TN、TC和TOC浓度变化。结果如图4、5所示，由图可知，卓贝儿氏菌Y61与果壳活性炭共培养在60r/min条件下培养基中TN去除速率最快，1-1.5天就可以全部去除，在静置条件下培养基在2-2.5天时TN降为0，而在120r/min和180r/min条件下培养培养基在1天后TN浓度只是缓慢降低，在四种不同转速培养下TC和TOC的浓度都下降了，培养时间越长的培养基TC和TOC降解率更高，而转速更高的培养基TC和TOC降解速度更快。然而，未添加卓贝儿氏菌Y61的对照组中TN、TC和TOC浓度基本没有变化。
从四个不同转速培养条件中，选取总氮去除速度最快的转速(60r/min)培养基的菌体与果壳活性炭共培养颗粒进行传代培养实验，在培养基总氮浓度降到0后倒掉上层液体培养基，加入已灭菌的新培养基，一共换四次培养基，传到第五代，验证共培养颗粒持续重复使用对降解率的影响。结果如图6所示，由图可知，卓贝儿氏菌Y61耦合果壳活性炭颗粒转接五代期间，培养基的TN浓度都在1-1.5天降到0，卓贝儿氏菌Y61耦合果壳活性炭共培养颗粒传代培养对TN的去除速率影响不大，共培养颗粒可以持续使用。
本案例说明卓贝儿氏菌Y61耦合果壳活性炭(10-24目)在好氧条件下对硝酸盐和有机物具有很好的去除效果，具备好氧条件下的反硝化功能，并且共培养颗粒可以持续重复使用。
实施例4：卓贝儿氏菌(Zobellella sp.)Y61耦合果壳活性炭在低盐/高盐好氧条件下的反硝化功能
配置液体培养基(蔗糖1.0g，KNO3 1.0g，KCl 1.0g，MgSO4·7H2O 1.0g，K2HPO40.5g，NaCl 0.0/1.0/2.0/3.0/4.0/5.0/6.0/7.0/8.0g，去离子水1L，pH7.5)，充分搅拌溶解后分装200mL培养基至300mL锥形瓶中，加入培养基质量的0.5％果壳活性炭(10-24目)到培养基中，灭菌后使用，无菌条件下实验分为两组：(1)有菌实验组，将卓贝儿氏菌Y61提前培养至对数期，取100μL接种到已灭菌处理的液体培养基中，混合均匀；(2)无菌对照组，不接种卓贝儿氏菌Y61菌株的已灭菌处理并加入果壳活性炭的液体培养基。所有锥形瓶置于摇床30℃条件下60r/min培养，每个实验组和对照组均设置3个平行，分别在0天、0.5天、1天、1.5天、2天、2.5天、3天和4天取样测定TN、TC和TOC浓度变化。结果如图7、8、9所示，由图可知，卓贝儿氏菌Y61耦合果壳活性炭共培养在0％-8％氯化钠浓度下的培养基TN浓度均有不同程度的降低，其中在2％氯化钠浓度下的培养基去除TN速率是最快的，1-1.5天就可以全部去除，同时也可以在高盐浓度下去除TN，在8％氯化钠浓度的培养基中TN浓度在2天时降约为0，而在没有加氯化钠的培养基中TN去除效果相对较差，TN去除率为42.8％。TC去除率都在60％左右，而TOC去除率大部分都在90％左右，只有不添加氯化钠的培养基中TOC去除率为62.5％。未添加卓贝儿氏菌Y61的对照组中TN、TC和TOC浓度基本没有变化。
本案例说明卓贝儿氏菌Y61耦合果壳活性炭(10-24目)在低盐/高盐好氧条件下对硝酸盐和有机物都具有很好的去除效果，可以在较宽的盐度范围进行好氧条件下反硝化作用。
实施例5：卓贝儿氏菌(Zobellella sp.)Y61耦合果壳活性炭对海洋渔业养殖废水的净化作用
渔业养殖废水采自广东省潮州市某海洋渔业养殖基地的养殖水体，硝酸盐含量为1g/L。(1)实验组：将卓贝儿氏菌Y61耦合果壳活性炭培养至对数期，倒掉上层培养基，按质量分数0.5％果壳活性炭的含量加入灭菌好的养殖废水，混合均匀；(2)无菌对照组，不接种Y61菌株的已灭菌处理的养殖废水。所有锥形瓶置于摇床30℃条件下60r/min培养，实验组和对照组均设置3个平行，分别在0天、1天、2天和3天取样测定TN、TC和TOC浓度变化。结果如图10所示，由图可知，卓贝儿氏菌Y61耦合果壳活性炭在1天时TN降到接近0，TC和TOC去除速率在1天后变慢，最大去除率分别为64.8％、93.1％。未添加卓贝儿氏菌Y61耦合果壳活性炭的对照组中TN、TC和TOC浓度基本没有变化。
本案例说明卓贝儿氏菌Y61耦合果壳活性炭(10-24目)对海洋渔业养殖废水中高浓度硝酸盐和有机物都具有很好的去除效果。
序列表
<110> 广东省科学院微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）
<120> 一种耐盐好氧反硝化菌及其耦合活性炭在强化水体污染治理中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1552
<212> DNA
<213> 卓贝儿氏菌Y61(Zobellella sp.)
<400> 1
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acgcggcatg gctgcatcag ggtttccccc attgtgcaat attccccact gctgcctccc 1200
gtaggagtct gggccgtgtc tcagtcccag tgtggctggt catcctctca gaccagctag 1260
agatcgtcgc cttggtgagc cattacctca ccaaccagct aatctcactt gggctcatcc 1320
aatcgcgcaa ggcccgaagg tcccctgctt tcccccgtag ggcgtatgcg gtattagccg 1380
tcgtttccaa cggttatccc cctcgaccgg gcagataccc aagccttact cacccgtccg 1440
ccgctcgccg gcaaaagtag caagctactc tcccgctgcc gctcgacttg catgtgttag 1500
gcctgccgcc agcgttcaat ctgagccatg atcaaactct tcaatttaaa gt 1552

Claims (7)

1.卓贝儿氏菌（Zobellellasp.）Y61，保藏编号为：GDMCC NO:61848。
2.权利要求1所述的卓贝儿氏菌Y61的应用，其特征在于，在溶解氧浓度为0-8mg/l、盐浓度为1-8%的条件下，卓贝儿氏菌Y61结合多孔活性炭利用有机物和硝酸盐进行反硝化作用，去除污染水体中的硝酸盐和有机物。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的卓贝儿氏菌Y61结合多孔活性炭是将卓贝儿氏菌Y61培养物和多孔活性炭一起投加到污染水体中。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的污染水体是渔业养殖水体。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的多孔活性炭是10-24目的果壳活性炭。
6.一种去除污染水体中的硝酸盐和有机物的菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述的卓贝儿氏菌Y61作为活性成分。
7.根据权利要求6所述的菌剂，其特征在于，还含有多孔活性炭。
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