CN110656066B - 一株短程硝化反硝化变异不动杆菌菌株及其应用 - Google Patents

一株短程硝化反硝化变异不动杆菌菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一株短程硝化反硝化变异不动杆菌及其应用，属于功能微生物技术领域。短程好氧反硝化细菌为变异不动杆菌(Acinetobacter variabilis)DW‑10，保藏编号为CCTCC NO：M2019167。一种快速脱氮微生物菌剂，所述菌剂的有效成分包括所述短程硝化反硝化变异不动杆菌菌株DW‑10。短程硝化反硝化变异不动杆菌在好氧条件下能够以有机碳为碳源，以氨氮、硝态氮或亚硝态氮为唯一氮源进行生长，同时进行异养硝化好氧反硝化。本发明的短程硝化反硝化变异不动杆菌对总氮、氨氮、硝态氮和亚硝氮具有高效去除能力，为淡水水产养殖水质改良提供了绿色、安全、无污染的生物途径。

Description

一株短程硝化反硝化变异不动杆菌菌株及其应用
技术领域
本发明属于功能微生物技术领域，具体涉及一株短程硝化反硝化变异不动杆菌菌株及其应用。
背景技术
目前，生物法脱氮是国内外应用最为广泛的污水脱氮技术之一，短程硝化反硝化生物脱氮工艺是一种新型生物脱氮技术，该技术通过改变脱氮条件，控制氮素转化途径，将硝化过程停留在亚硝化阶段，形成NO2-N大量积累，然后通过反硝化直接将亚硝氮还原为N2。
近年来，由于淡水养殖水体富营养化问题的日益严重，传统的精养方式本身也不可避免地对周围环境产生污染。随着养殖水平的不断提高，单位水体的鱼载力也随着增加，但是大量的饲料投入、肥料施入和鱼类代谢物的积累，使养殖水体中氨氮、亚硝酸盐和硝态氮超标，导致养殖鱼、虾生长缓慢，品质下降，已经是水产养殖面临和必须解决的重大问题。
公开号CN 108529747 A的专利公开了硝化反硝化同步脱氮方法，该方法利用餐厨垃圾、植物秸秆和贝壳制备得到生物膜载体，将功能微生物接种到生物膜载体上培养得到凝胶状生物膜，对含氮污水进行净化。但该方法处理污水氨氮浓度仅为15～25mg/L；公开号CN 109824148 A的专利公开了一种同步实现硝化、反硝化的脱氮系统及其应用方法，该脱氮系统包括好氧硝化反应装置、过滤装置和厌氧反硝化装置，采用单一铵态氮作为氮源，甲烷为碳源，同步实现硝化、反硝化厌氧甲烷氧化和厌氧氨氧化，实现了高效脱氮，但该发明方法属于污水脱氮处理技术领域；公开号CN 102465106 A的专利公开了一种短程反硝化脱氮菌株及其应用，以水氏黄杆菌(Flavobacterium mizutaii)FDN-2为脱氮菌株，利用亚硝态氮作为底物，完成短程反硝化过程；胡君杰(工业水处理，2016，36(5):51-54)采用A/O-MBR工艺对填埋场垃圾渗滤液进行了短程硝化反硝化脱氮研究。
关于不动杆菌属细菌的研究，公开号CN105647838 A的专利公开了皮特不动杆菌用于石油废水、石油污染土壤等的治理技术；公开号CN105385621A的专利公开了琼氏不动杆菌zjutfet-1及其在拆分2-氯丁酸甲酯中的应用；公开号CN 104388366 A的专利公开了鲍曼不动杆菌在偶氮染料脱色中的应用；公开号CN 105969706 A的专利公开了单不动杆菌在防治青枯病中的应用；公开号CN 105331552 A的专利公开了一株高效脱氮不动杆菌新种在去除水体氨氮及亚硝酸盐氮中的应用，但该菌株的主要功能是异养硝化作用，仅去除养殖水体中的亚硝酸盐氮。对于不动杆菌属的变异不动杆菌，通过短程硝化反硝化降低养殖水体中的氮素，国内外未见报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一株具有短程硝化反硝化能力的变异不动杆菌菌株，对于解决水产养殖水体氨氮、亚硝酸盐和硝态氮超标等富营养化问题，具有良好的应用前景。
本发明提供了一株短程硝化反硝化变异不动杆菌(Acinetobacter variabilis)菌株DW-10，保藏编号为CCTCC NO：M2019167。
本发明提供了一种快速脱氮微生物菌剂，所述菌剂的有效成分包括所述短程硝化反硝化变异不动杆菌(Acinetobacter variabilis)菌株DW-10。
优选的，所述短程硝化反硝化变异不动杆菌(Acinetobacter variabilis)菌株DW-10的活菌浓度为1010～1012CFU/mL。
本发明提供了所述变异不动杆菌(Acinetobacter variabilis)菌株DW-10或所述微生物菌剂在淡水养殖水体除氮处理中应用。
优选的，所述淡水养殖水体除氮处理的方法，包括以下步骤：
在好氧条件下，所述变异不动杆菌(Acinetobacter variabilis)菌株DW-10或所述微生物菌剂以有机碳为碳源，将氨氮、硝态氮和/或亚硝态氮转化为气态氮。
优选的，所述有机碳包括葡萄糖、蔗糖、乙酸钠和/或甘露醇。
优选的，所述气态氮包括N2、NO和/或N2O。
优选的，在淡水养殖水体中，所述变异不动杆菌(Acinetobacter variabilis)菌株DW-10或所述微生物菌剂中变异不动杆菌(Acinetobacter variabilis)DW-10的工作活菌数活菌浓度为1010～1012CFU/mL。
优选的，所述好氧条件指养殖水体中溶氧量为1.5～3mg/L；
氨氮、硝态氮和亚硝态氮浓度依次为0～550mg/L、0～450mg/L和0～230mg/L。
优选的，所述淡水水产养殖水体除氮的条件为：pH值7～8，温度25～40℃，C/N比为5～20。
本发明提供的短程硝化反硝化变异不动杆菌(Acinetobacter variabilis)菌株DW-10，保藏编号为CCTCC NO：M2019167，具有较好的脱氮能力，能够有效去除养殖水体中氨氮、硝态氮和亚硝态氮彻底转化为气态氮，且不积累硝态氮，从而保护和改善淡水养殖生态环境，对于解决水产养殖水体氨氮、亚硝酸盐和硝态氮超标等富营养化问题，具有良好的应用前景。实验证明，菌株DW-10对淡水养殖废水中的总氮、氨氮、硝态氮和亚硝氮24h内的去除率分别达到81.26％、99.71％、92.14％和87.05％，为淡水水产养殖水质改良提供了绿色、安全、无污染的生物途径。
附图说明
图1为本发明提供的变异不动杆菌菌株DW-10的菌落形态图；
图2为本发明提供的变异不动杆菌菌株DW-10的菌体形态图；
图3为本发明提供的变异不动杆菌菌株DW-10构建的系统发育树；
图4为本发明提供的变异不动杆菌菌株DW-10对氮的去除率结果图。
生物材料保藏信息
变异不动杆菌(Acinetobacter variabilis)，于2019年4月2日保藏于中国典型培养物保藏中心(单位简称CCTCC)，保藏单位的地址为中国，武汉市，武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2019167，菌株编号为DW-10。
具体实施方式
本发明提供了一株短程硝化反硝化变异不动杆菌(Acinetobacter variabilis)菌株DW-10，保藏编号为CCTCC NO：M2019167。所述菌株DW-10的形态特征和分子鉴定结果如下：
1、形态特征：菌落形态为黄白色，圆形，隆起，边缘整齐，表面湿润，不透明；细胞显微形态呈近球形(见附图1)。
2、菌株的分子鉴定：测序所得菌株DW-10的16S rDNA基因序列如序列表所示，利用美国国家生物技术信息中心(NCBI)的BLAST检索程序系统进行序列同源性分析，发现与模式菌株Acinetobacter variabilis(NR134685.1)对应序列在覆盖率为100％的情况下相似度为100％。根据形态和分子鉴定结果将菌株DW-10分类为变异不动杆菌(Acinetobactervariabilis)。
在本发明中，所述变异不动杆菌菌株DW-10的培养方法，优选包括以下步骤：
将变异不动杆菌菌株DW-10接种于种子培养基中，于30℃、170r/min培养24h后，得到种子液。
在本发明中，实验证明，所述菌株DW-10对淡水养殖废水中耐受氨氮、硝态氮和亚硝态氮的浓度分别为550mg/L、450mg/L和230mg/L，对总氮、氨氮、硝态氮和亚硝氮24h内的去除率分别达到81.26％、99.71％、92.14％和87.05％，为淡水水产养殖水质改良提供了绿色、安全、无污染的生物途径。
基于所述所述菌株DW-10高效脱氮能力，本发明提供了一种快速脱氮微生物菌剂，所述菌剂的有效成分包括所述短程硝化反硝化变异不动杆菌(Acinetobactervariabilis)菌株DW-10。所述短程硝化反硝化变异不动杆菌(Acinetobacter variabilis)菌株DW-10的活菌浓度优选为1010～1012CFU/mL，更优选为1011CFU/mL。本发明对所述微生物菌剂的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的微生物菌剂的制备方法即可。
本发明提供了所述变异不动杆菌菌株DW-10或所述微生物菌剂在淡水养殖水体除氮处理中应用。
在本发明中，所述淡水养殖水体除氮处理的方法，优选包括以下步骤：在好氧条件下，所述变异不动杆菌菌株DW-10或所述微生物菌剂以有机碳为碳源，将氨氮、硝态氮和/或亚硝态氮转化为气态氮。所述有机碳优选包括葡萄糖、蔗糖、乙酸钠和/或甘露醇。所述气态氮优选包括N2、NO和/或N2O。在淡水养殖水体中，所述变异不动杆菌(Acinetobactervariabilis)菌株DW-10或所述微生物菌剂中变异不动杆菌(Acinetobacter variabilis)DW-10的工作活菌数活菌浓度优选为1010～1012CFU/mL。所述好氧条件指养殖水体中溶氧量优选为1.5～3mg/L；更优选为2～2.5mg/L。所述氨氮、硝态氮和亚硝态氮的浓度依次为0～550mg/L、0～450mg/L和0～230mg/L。所述淡水水产养殖水体除氮的条件优选为：pH值7～8，温度25～40℃，C/N比为5～20，更优选为pH值7.5，温度30～35℃，C/N比为10～15。
下面结合实施例对本发明提供的一株短程硝化反硝化变异不动杆菌菌株及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
变异不动杆菌的获得
1.配制如下培养基：
(1)液体种子液培养基：牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 5g/L、H2O1L，121℃、25min灭菌。
(2)硝化培养基(BM)：K2HPO47g、KH2PO43g、MgSO4·7H2O 0.1g、(HN4)2SO40.707g、FeSO4·7H2O 0.05g、CH3COONa 7.68g、H2O 1L。121℃，25min灭菌。
(3)反硝化培养基1(DM-1)：K2HPO47g、KH2PO43g、MgSO4·7H2O0.1g、NaNO20.739g、FeSO4·7H2O 0.05g、CH3COONa 7.68g、H2O 1L。121℃，25min灭菌。
(4)反硝化培养基2(DM-2)：K2HPO47g、KH2PO43g、MgSO4·7H2O0.1g、KNO31.07g、FeSO4·7H2O 0.05g、CH3COONa 7.68g、H2O 1L。121℃，25min灭菌。
2.筛选异养硝化细菌
(1)样品采集：取自湖南农业大学水产养殖基地池塘底泥。
(2)富集培养与分离：
菌株的富集：取10g养殖池塘污泥加入100mL的富集培养基中(加入适量的破玻璃珠)，置于30℃、170r/min摇床中培养72h。
菌株初筛：取10mL富集液加入90mL的无菌水中振荡15min后，采用10倍稀释法稀释成10-1～10-8，分别取0.1mL不同梯度的菌悬液涂布于硝化培养基和反硝化固体培养基(在反硝化培养基1或2中添加2％的琼脂粉)平板上，倒置于37℃恒温培养箱中培养，待固体平板上长出单菌落后，挑取不同的单菌落进行分离纯化并编号。即获得纯化的菌株DW-10。
菌株复筛：将分离纯化的菌种分别接种于种子培养基中，于30℃、170r/min培养24h后，将种子液按1％(V/V)接种于硝化培养基和反硝化液体培养基1以及反硝化培养基2中，置于30℃、170r/min的摇床中振荡培养48h，测定NH4 +-N、NO2 --N以及NO3 --N的含量。结果表明，氨氮降解率为98.77％、亚硝氮降解率为69.24％、硝氮降解率为57.74％。
实施例2
菌株的鉴定
1.菌株形态学特征鉴定
其在牛肉膏蛋白胨固体培养基上的菌落形态特征为：菌落形态为黄白色，圆形，隆起，边缘整齐，表面湿润，不透明。
2.菌株DW-10生理生化特征
按照《微生物学实验》(第四版)(沈萍，陈向东主编，111-117)提供的方法测定菌株DW-10的生理生化指标。表1为菌株DW-10生理生化特征。
表1菌株DW-1生理生化特征
Figure BDA0002255453080000061
注：“+”代表阳性，“-”代表阴性；“+”stands for positive and“-”stands fornegative
3.菌株的分子生物学鉴定
1)利用上海生工细菌基因组提取试剂盒(SK8255)提取菌株DW-10的基因组DNA，步骤按厂家说明书要求所述。利用细菌通用引物27F，1492R扩增菌株DW-10的16S rDNA片段。
正向引物序列27F：5'-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3'(SEQ ID No.1)；
反向引物序列1492R:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'(SEQ ID No.2)。
PCR产物分别经1.5％琼脂糖凝胶电泳，利用凝胶回收试剂盒回收目的条带后送交公司测序。将所测得序列整理后提交到到NCBI数据库中，比对得到与模式菌株Acinetobacter variabilis(NR134685.1)相似性为99％。
2)菌株DW-10的16S rDNA基因测序的结果如下：
tggctcagattgaacgctggcggcaggcttaacacatgcaagtcgagcggggatagggtgcttgcacctgattcctagcggcggacgggtgagtaatgcttaggaatctgcctattagtgggggacaacgttccgaaagggacgctaataccgcatacgtcctacgggagaaagcaggggatcttcggaccttgcgctaatagatgagcctaagtcggattagctagttggtggggtaaaggcctaccaaggcgacgatctgtagcgggtctgagaggatgatccgccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattggacaatggggggaaccctgatccagccatgccgcgtgtgtgaagaaggccttttggttgtaaagcactttaagcgaggaggaggcttacctggttaatacctgggataagtggacgttactcgcagaataagcaccggctaactctgtgccagcagccgcggtaatacagagggtgcaagcgttaatcggatttactgggcgtaaagcgcgcgtaggtggctaattaagtcaaatgtgaaatccccgagcttaacttgggaattgcattcgatactggttagctagagtatgggagaggatggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccgatggcgaaggcagccatctggcctaatactgacactgaggtgcgaaagcatggggagcaaacaggattagataccctggtagtccatgccgtaaacgatgtctactagccgttggggcccttgaggctttagtggcgcagctaacgcgataagtagaccgcctggggagtacggtcgcaagactaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctggccttgacatacagagaactttccagagatggattggtgccttcgggaactctgatacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttttccttatttgccagcacttcgggtgggaactttaaggatactgccagtgacaaactggaggaaggcggggacgacgtcaagtcatcatggcccttacggccagggctacacacgtgctacaatggtcggtacaaagggttgctactgcgcgagcagatgctaatctcaaaaagccgatcgtagtccggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagtcggaatcgctagtaatcgcggatcagaatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtttgttgcaccagaagtagctagcctaactgcaaagagggcggttaccacggtgtggccgatgactggggtgaagtcgtaaca(SEQ ID No.3)。
如上所述的16S rDNA序列采用软件BLAST进行比对，使用软件MEGAversion5.05software绘制进化关系树。采用neighbor-joining计算，并以maximum-parsimony和maximum-likelihood进行验证计算，bootstrap设置为1000个循环，以基因序列构建的系统发育树如图3。从图3可看出，通过对16S rDNA基因的系统发育树分析，菌株DW-10与模式菌株Acinetobactervariabilis(NR134685.1)相似性为100％。结合菌株DW-10有关生理生化指标结果和分子生物学鉴定结果和形态学特征，将其鉴定为变异不动杆菌(Acinetobactervariabilis)DW-10。
实施例3
菌株DW-10在淡水养殖废水除氮中的应用
本实施例采用的是精养池塘养殖废水，养殖模式为混养，其中草鱼为25％，鲢鳙鱼60％，其余为鲫鱼和鳊鱼，该养殖废水水质情况为：总氮2.94mg/L，氨氮1.27mg/L，亚硝氮0.25mg/L，硝态氮0.23mg/L，pH值在7.3左右。将上述菌株DW-10的发酵液(含菌数为1012CFU/mL)按2％的接种量接种已调节到pH7.2的精养池塘养殖废水，在温度25℃，C/N比为10，摇床转速100～130r/min，培养24h，测定处理前后养殖废水中总氮、氨氮、硝态氮和亚硝氮的含量变化。
经过24h的培养，养殖废水中总氮去除率为76.81％，氨氮去除率为99.42％，亚硝氮去除率为85.69％，硝态氮去除率为93.02％，且在以氨氮为唯一氮源时，无亚硝氮的积累(见图4)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 湖南农业大学
<120> 一株短程硝化反硝化变异不动杆菌菌株及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agtttgatcm tggctcag 18
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggttaccttg ttacgactt 19
<210> 3
<211> 1479
<212> DNA
<213> Acinetobacter variabilis
<400> 3
tggctcagat tgaacgctgg cggcaggctt aacacatgca agtcgagcgg ggatagggtg 60
cttgcacctg attcctagcg gcggacgggt gagtaatgct taggaatctg cctattagtg 120
ggggacaacg ttccgaaagg gacgctaata ccgcatacgt cctacgggag aaagcagggg 180
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cggctaactc tgtgccagca gccgcggtaa tacagagggt gcaagcgtta atcggattta 540
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tccatgccgt aaacgatgtc tactagccgt tggggccctt gaggctttag tggcgcagct 840
aacgcgataa gtagaccgcc tggggagtac ggtcgcaaga ctaaaactca aatgaattga 900
cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg atgcaacgcg aagaacctta 960
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gagcgcaacc cttttcctta tttgccagca cttcgggtgg gaactttaag gatactgcca 1140
gtgacaaact ggaggaaggc ggggacgacg tcaagtcatc atggccctta cggccagggc 1200
tacacacgtg ctacaatggt cggtacaaag ggttgctact gcgcgagcag atgctaatct 1260
caaaaagccg atcgtagtcc ggatcgcagt ctgcaactcg actgcgtgaa gtcggaatcg 1320
ctagtaatcg cggatcagaa tgccgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc 1380
cgtcacacca tgggagtttg ttgcaccaga agtagctagc ctaactgcaa agagggcggt 1440
taccacggtg tggccgatga ctggggtgaa gtcgtaaca 1479

Claims (10)

1.一株短程硝化反硝化变异不动杆菌(Acinetobacter variabilis)菌株DW-10，其特征在于，保藏编号为CCTCC NO：M2019167。
2.一种快速脱氮微生物菌剂，其特征在于，所述菌剂的有效成分包括权利要求1所述短程硝化反硝化变异不动杆菌(Acinetobacter variabilis)菌株DW-10。
3.根据权利要求2所述微生物菌剂，其特征在于，所述短程硝化反硝化变异不动杆菌(Acinetobacter variabilis)菌株DW-10的活菌浓度为1010～1013CFU/mL。
4.权利要求1所述变异不动杆菌(Acinetobacter variabilis)菌株DW-10或权利要求2或3所述微生物菌剂在淡水养殖水体除氮处理中应用。
5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述淡水养殖水体除氮处理的方法，包括以下步骤：
在好氧条件下，所述变异不动杆菌(Acinetobacter variabilis)菌株DW-10或所述微生物菌剂以有机碳为碳源，将氨氮、硝态氮和/或亚硝态氮转化为气态氮。
6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述有机碳包括葡萄糖、蔗糖、乙酸钠和/或甘露醇。
7.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述气态氮包括N2、NO和/或N2O。
8.根据权利要求5所述应用，其特征在于，在淡水养殖水体中，所述变异不动杆菌(Acinetobacter variabilis)菌株DW-10或所述微生物菌剂中变异不动杆菌(Acinetobacter variabilis)DW-10的工作活菌数活菌浓度为1010～1013CFU/mL。
9.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述好氧条件指养殖水体中溶氧量为1.5～3mg/L；
氨氮、硝态氮和亚硝态氮浓度依次为0～550mg/L、0～450mg/L和0～230mg/L。
10.根据权利要求5～9任意一项所述应用，其特征在于，所述淡水水产养殖水体除氮的条件为：pH值7～8，温度25～40℃，C/N比为5～20。
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