CN110846254A - 用于脱氮的复合微生物菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于脱氮的复合微生物菌剂及其制备方法和应用，该用于脱氮的复合微生物菌剂，包括不动杆菌MZ5、不动杆菌MZ16和假单胞菌MZ17，所述不动杆菌MZ5（Acinetobactersp.MZ5）、保藏编号为CCTCC No:M2019796；不动杆菌MZ16（Acinetobactersp.MZ16）、保藏编号为CCTCC No:M2019797；假单胞菌MZ17（Pseudomonas sp.MZ17）、保藏编号为CCTCC No:M2019798，复合微生物菌剂可以直接投加到水体中，相对于单个菌种的适应能力更强，且微生物组合的每个菌种联合发挥作用，能够增强复合微生物菌剂的稳定性，且可以在有氧环境下发挥作用，极大提高了脱氮效率。

Description

用于脱氮的复合微生物菌剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及微生物的环保生物工程和水处理领域，尤其涉及一种用于脱氮的复合微生物菌剂及其制备方法和应用。

背景技术

城市“逐水而生，逐水而兴”，随着城市化的进程，城市地表水和沉积物的化学和生物特性发生了显著变化。据相关数据统计，全国2015年138个城市河段中，超过Ⅴ类水质占到38％，已成为中国水环境污染中的重灾区。2016年，深圳市河流常规性监测断面黑臭水体比例总数在32-65％之间。黑臭水体是指因过量纳污、超出其水环境容量而导致变黑、发臭的水体。一般具有透明度低于25cm，溶解氧(DO)浓度小于2.0mg/L，氨氮浓度高于8.0mg/L的特点。因此，氨氮的去除是黑臭水处理的一项关键指标。高浓度的氨氮不仅能够引起水体中的藻类快速增长，消耗鱼类生存所需的氧气，同时也会对水生生物有毒害作用，赤潮水华也因此而爆发。

目前，城市河流黑臭处理技术包括：控源截污、内源控制、生态修复、河流纯氧曝气、生态清淤这五种。物理和化学处理规模大，能耗大，稳定性差；生态修复技术包括人工湿地处理技术，投加微生物，种植水生植物等，具有经济高效、无二次污染等优点，因此而备受人们关注。近年来，国内外采用微生物制剂进行水体处理已有诸多报告：有美国CBS水体修复技术，日本EM菌剂，美国利蒙系列产品等。但由于不同的河流表现出不同的化学环境，其微生物群落结构与活力也随着环境不同而呈现不同的分布特征。所以，盲目地投加市售微生物菌剂对河流生态系统治理并非有利，从污染河流分离土著微生物菌剂对降解河流氮污染物具有良好发展前景。

发明内容

针对上述技术中存在的不足之处，本发明提供一种用于脱氮的复合微生物菌剂及其制备方法和应用，该用于脱氮的复合微生物菌剂具有良好的稳定性，且可以在有氧环境下发挥作用，起到良好的水体脱氮作用。

为实现上述目的，本发明提供一种用于脱氮的复合微生物菌剂，包括不动杆菌MZ5、不动杆菌MZ16和假单胞菌MZ17。

其中，还包括代尔夫特菌B7；且其中不动杆菌MZ5、不动杆菌MZ16、假单胞菌MZ17和代尔夫特菌B7之间的活菌数比例为1:1:1:1。

其中，所述不动杆菌MZ5(Acinetobacter sp.MZ5)、保藏编号为CCTCC No:M2019796；不动杆菌MZ16(Acinetobacter sp.MZ16)、保藏编号为CCTCC No:M2019797；假单胞菌MZ17(Pseudomonas sp.MZ17)、保藏编号为CCTCC No:M2019798；代尔夫特菌B7(Delftia sp.B7)、保藏编号为CCTCC No:M2019799。

上述不动杆菌MZ5CCTCC No:M2019796已于2019年10月10日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国武汉，武汉大学)，保藏地址为中国，武汉，武汉大学，分类学命名为不动杆菌MZ5(Acinetobacter sp.MZ5)，保藏编号为：CCTCC No:M2019796。

上述不动杆菌MZ16CCTCC No:M2019797已于2019年10月10日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国武汉，武汉大学)，保藏地址为中国，武汉，武汉大学，分类学命名为不动杆菌MZ16(Acinetobacter sp.MZ16)，保藏编号为：CCTCC No:M2019797。

上述假单胞菌MZ17CCTCC No:M2019798已于2019年10月10日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国武汉，武汉大学)，保藏地址为中国，武汉，武汉大学，分类学命名为MZ17(Pseudomonas sp.MZ17)，保藏编号为：CCTCC No:M2019798。

上述代尔夫特菌B7CCTCC No:M2019799已于2019年10月10日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国武汉，武汉大学)，保藏地址为中国，武汉，武汉大学，分类学命名为代尔夫特菌B7(Delftia sp.B7)，保藏编号为：CCTCC No:M2019799。

本发明还提供一种用于脱氮的复合微生物菌剂的制备方法，包括：

(1)将不动杆菌MZ5接种到配置好的富集培养基中进行培养，得到活化的不动杆菌MZ5菌液；

(2)将步骤(1)得到的活化的不动杆菌MZ5菌液加入无菌离心管中进行离心，弃去上清液，接着向离心管中滴入无机溶剂进行重新悬浮得到不动杆菌MZ5重悬菌液；

(3)按步骤(1)和(2)的方法分别得到不动杆菌MZ16重悬菌液、假单胞菌MZ17重悬菌液；

(4)取相同体积的步骤(2)和步骤(3)的不动杆菌MZ5、不动杆菌MZ16和假单胞菌MZ17的重悬菌液，进行混合得到复合微生物菌剂。

本发明还提供另一种用于脱氮的复合微生物菌剂的制备方法，包括：

(1)将不动杆菌MZ5接种到配置好的富集培养基中进行培养，得到活化的不动杆菌MZ5菌液；

(2)将步骤(1)得到的活化的不动杆菌MZ5菌液加入无菌离心管中进行离心，弃去上清液，接着向离心管中滴入无机溶剂进行重新悬浮得到不动杆菌MZ5重悬菌液；

(3)按步骤(1)和(2)的方法分别得到不动杆菌MZ16重悬菌液、假单胞菌MZ17重悬菌液和代尔夫特菌B7；

(4)取相同体积的步骤(2)和步骤(3)的不动杆菌MZ5、不动杆菌MZ16、假单胞菌MZ17的重悬菌液和代尔夫特菌B7重悬菌液，进行混合得到复合微生物菌剂。

其中，所述步骤(1)的培养条件为：接种到配制好的100mL富集培养基中，在30℃、180r·min^-1的摇床中培养24h。

其中，所述步骤(2)中的无机溶剂为灭菌生理盐水。

其中，所述步骤(2)中包括：将脱氮微生物的活化菌液加入无菌离心管中进行离心，弃去上清液，接着向离心管中滴入无机溶剂进行重新悬浮。重复三次后，得到脱氮微生物的重悬菌液。

其中，所述用于脱氮的复合微生物菌剂在河流水质净化的应用。

其中，所述水体脱氮的微生物菌剂在水体碳氮比为1-20的情况下按水体的2％投加到水体中。

其中，所述碳氮比为8-16。

本发明的有益效果是：与现有技术相比，本发明提供的用于脱氮的复合微生物菌剂，按脱氮特性相同将不动杆菌MZ5、不动杆菌MZ16和假单胞菌MZ17结合在一起，相对于单个菌种适应能力强，且复合微生物菌剂的每个菌种联合发挥作用，能够增强整个复合微生物菌剂的稳定性，且可以在有氧环境下发挥作用，无需考虑好氧和厌氧两个反应器，大大提高了脱氮的效率；还包括代尔夫特菌B7，使得整体稳定性更强和脱氮效果更好。

附图说明

图1为本发明实施例中不同菌株(不动杆菌MZ5、不动杆菌MZ16和假单胞菌MZ17和代尔夫特菌B7)在异养硝化富集培养基固体平板上的菌落形状图，图中：a为不动杆菌MZ5；b为不动杆菌MZ16；c为假单胞菌MZ17；d为代尔夫特菌B7；

图2为本发明使用不动杆菌MZ5的16S rRNA序列所作的系统发育树；

图3为本发明使用不动杆菌MZ16的16S rRNA序列所作的系统发育树；

图4为本发明使用假单胞菌MZ17的16S rRNA序列所作的系统发育树；

图5为本发明使用代尔夫特菌B7的16S rRNA序列所作的系统发育树；

图6为本发明测试例1中的复合微生物菌剂F1的脱氮特征折线图；

图7为本发明测试例2中的复合微生物菌剂F2的脱氮特征折线图；

图8为本发明测试例3-8、对照例1的脱氮特征图；

图9为本发明的测试9的脱氮特征折线图；

图10为本发明的测试10的脱氮特征折线图；

具体实施方式

为了更清楚地表述本发明，下面结合附图对本发明作进一步地描述。

实施例1

不动杆菌MZ5、不动杆菌MZ16和假单胞菌MZ17和代尔夫特菌B7的分离和鉴定

(1)样品采集：

2019年6月19日于深圳茅洲河中采集得到水样，并于4℃保藏；

(2)培养基

LB富集培养基(g·L^-1)：NaCl 5.0，蛋白胨10.0，酵母膏提取物5.0，pH7.2。

异养硝化富集培养基(g·L^-1)：(NH₄)₂SO₄ 0.47，丁二酸钠4.052，K₂HPO₄ 0.25，NaCl 0.125，MgSO₄·7H₂O 2.5，MnSO₄·4H₂O 0.01，FeSO₄·7H₂O 0.01，pH 7.0。

异养硝化分离培养基(g·L^-1)：(NH₄)₂SO₄ 0.24，其余成分及浓度同异养硝化富集培养基。

溴百里酚蓝(BTB)初筛培养基(g·L^-1)：KNO₃ 1.0，KH₂PO₄1.0，用酒精稀释1％的溴百里酚蓝(BTB)1mL，丁二酸钠8.5，MgSO₄·7H₂O 1.0，CaCl₂·6H₂O 0.2，FeCl₂·6H₂O 0.5，pH7.0-7.5.

所有培养基使用蒸馏水配置，固体培养基加入1.5％～2％琼脂粉，培养基中的金属盐过滤灭菌，其他成分均在121℃条件下灭菌20min后备用.硫酸铵和丁二酸钠的浓度可根据实验需要调整不同TC/TN(w/w).

(3)样品富集分离

超净台中用移液枪吸取10mL上述水样，接至90mL无菌生理盐水中，放入摇床振荡培养8h后取出来，静置10min，取10mL悬浮液接种到90mL无菌LB富集培养基，于30℃、120r·min^-1的条件下培养7d；取1mL富集液接种至99mL异养富集硝化培养基中，30℃、120r·min^-1培养3d，富集三次后进行平板分离。

取100μL富集液到无菌水中，逐步稀释到10^-4、10^-5、10^-6、10^-7四个梯度，取200μL稀释液涂布于异养硝化分离培养基平板上，每个梯度做3个平行，30℃下倒置培养48～72h.待平板表面形成菌落后，挑取不同特征的单菌落进行平板划线分离，多次划线直到所有菌落表面特征相同，将以上单菌落在(-)80℃下保存于25％的甘油中。

挑取平板单菌落至异养硝化富集培养基中活化培养，待培养基变浑浊后，取100μL菌悬液用无菌水进行梯度稀释，选取合适的梯度涂布于BTB培养基平板上，倒置于30℃的恒温培养箱中，培养24h后观察BTB培养基的颜色，能使平板变蓝的即是异养硝化-好氧反硝化菌株，分离得到菌株不动杆菌MZ5、不动杆菌MZ16、假单胞菌MZ17和代尔夫特菌B7，并分别进行冷冻保存。

(4)菌种鉴定

a)形态观察：

取冻存的不动杆菌MZ5、不动杆菌MZ16、假单胞菌MZ17和代尔夫特菌B7分别平板划线至异养硝化固体培养基，30℃倒置培养至分别长出不动杆菌MZ5单菌落、不动杆菌MZ16单菌落、假单胞菌MZ17单菌落和代尔夫特菌B7单菌落，使用LEICA DMi1倒置显微镜观察菌落的颜色、形态、含水状态、高度、透明度、边缘、与培养基的结合程度、正反面颜色的差别等形态特征，具体参见附图1，其中不动杆菌MZ5菌株呈圆形淡黄色半透明，表面不规则丘状凸起，正反面无颜色差；不动杆菌MZ16菌株呈圆形淡黄色不透明，表面粗糙不规则，有隆起和褶皱，正反面无颜色差；假单胞菌MZ17菌株呈圆形淡黄色不透明，表面光滑平坦，边缘呈锯齿状，正反面无颜色差；代尔夫特菌B7菌株呈圆形淡黄色半透明，有粘性，表面光滑凸起，边缘呈锯齿状，正反面无颜色差。

b)分子生物学鉴定：

1)采用Bacterial DNA Kit(OMEGA)提取含有不动杆菌MZ5、不动杆菌MZ16、假单胞菌MZ17和代尔夫特菌B7的基因组，取1μL样品于nanodrop 2000检测DNA浓度后保存于(-)20℃冰箱中；

2)使用通用引物27F(5＇-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3＇)和1492R(5＇-TTGGYTACCTTGTTACGACT-3＇)扩增16S rRNA序列的PCR扩增，使用TaKaRa 16S rRNABacterial Identification PCR Kit(Code No.RR176)扩增目的片段进行扩增得到PCR产物；

3)PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，测序后获得菌株的16S rRNA序列，其中不动杆菌MZ5菌株的序列如SEQ ID No.1所示；不动杆菌MZ16菌株的序列如SEQ ID No.2所示；假单胞菌MZ17菌株的序列如SEQ ID No.3所示；代尔夫特菌B7菌株的序列如SEQ ID No.4所示；将测得基因序列利用Blast与Genbank比对鉴定。选取与目的基因序列同源性相近的菌种，用MEGA 7.0软件，采用Neighbor-Joining法构建系统发育树，不动杆菌MZ5菌株、不动杆菌MZ16菌株、假单胞菌MZ17菌株和代尔夫特菌B7菌株对应的发育树依次为附图2-附图5，随后用Bootstrap方法评价发育树的可信度发现：不动杆菌MZ5菌株与Acinetobacter属的同源性高达100％，结合形态初步鉴定不动杆菌MZ5菌株为不动杆菌属；不动杆菌MZ16与Acinetobacter属的同源性高达100％，结合形态初步鉴定不动杆菌MZ16菌株为不动杆菌属；假单胞菌MZ17菌株与Pseudomonas属的同源性高达100％，结合形态初步鉴定假单胞菌MZ17为假单胞菌属。代尔夫特菌B7与Delftia属的同源性高达99％以上，结合形态初步鉴定代尔夫特菌B7为代尔夫特菌属。

因此，本发明所提供的不动杆菌MZ5、不动杆菌MZ16、假单胞菌MZ17和代尔夫特菌B7分别属于不动杆菌、假单胞菌和代尔夫特菌，均是新发现的菌株，上述四种菌株于2019年10月10日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址为：中国，武汉，武汉大学，其中不动杆菌MZ5、不动杆菌MZ16和假单胞菌MZ17和代尔夫特菌B7可分别以硫酸铵、亚硝酸钠、硝酸钾作为唯一氮源进行脱氮，所有菌株在氨氮去除的过程中没有亚硝态氮和硝态氮的积累，本发明将不动杆菌MZ5、不动杆菌MZ16和假单胞菌MZ17复配形成复合微生物菌剂，避免了单一的菌种的环境适应性难以保证且脱氮效率低的不足，尤其还包括代尔夫特菌B7，每个菌种联合发挥作用，增强整个复合微生物菌剂的稳定性和达到良好的脱氮效率。

实施例2

(1)将实施例1得到的不动杆菌MZ5、不动杆菌MZ16和假单胞菌MZ17和代尔夫特菌B7从(-)80℃冰箱中取出，室温解冻后在超净台内划线到提前配制好的固体平板中，在30℃下倒置培养48-72h，得到前培养的单菌落；

(2)将前培养的单菌落分别用灭菌枪头挑取至4瓶100mL LB培养基中，在30℃、180r·min^-1的摇床中培养24h，并分别编号为5、16、17、B7；

(3)将主培养的菌液分两次装入50mL的离心管中，在10000g的条件下离心10min，弃上清液，接着滴入20mL生理盐水进行重新悬浮，重复三次得到重悬菌液5、16、17、B7。

(4)在装有重悬菌液5、16、17的离心管中用灭菌枪头吸取200μL到96孔板中检测OD₆₀₀，计算并使用无菌生理盐水将重悬菌液的OD₆₀₀调节至0.7，各吸取1mL上述菌悬液5、16、17混合至新的灭菌离心管中，使之混合均匀，得到复合微生物菌剂F1。

实施例3

在实施例2中装有重悬菌液5、16、17、B7的离心管中用灭菌枪头吸取200μL到96孔板中检测OD₆₀₀，计算并使用无菌生理盐水将重悬菌液的OD₆₀₀调节至0.7，各吸取1mL上述菌悬液5、16、17、B7混合至新的灭菌离心管中，使之混合均匀，得到复合微生物菌剂F2。

下面对复合微生物菌剂F1和F2进行脱氮效果测定

测试例1

(1)模拟污水培养基R1(g·L^-1)配置：(NH₄)₂SO₄ 0.1，NaNO₂ 0.1，KNO₃ 0.15，丁二酸钠2.5，K₂HPO₄ 0.25，NaCl 0.125，MgSO₄·7H₂O 0.125，MnSO₄·4H₂O 0.0025，FeSO₄·7H₂O0.0025。培养基使用蒸馏水配置，固体培养基加入1.5％～2％琼脂粉，培养基中的金属盐过滤灭菌，其他成分均在121℃的条件下灭菌20min后备用；

(2)使用灭菌枪头吸取2mL实施例2得到的复合微生物菌剂F1到98mL步骤(1)中的无菌模拟污水培养基R1上；

(3)脱氮测定：将添加了混合菌液F1的锥形瓶置于30℃、150r·min^-1的摇床中培养；定时取样测定OD₆₀₀、氨氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮、总氮浓度，重复3次取平均值，测定指标按国标方法进行，其中OD₆₀₀采用浊度法进行测定，氨氮采用水杨酸钠分光光度法进行测定，亚硝酸盐氮采用N-(1-萘基)乙二胺光度法进行测定，硝酸盐氮采用紫外分光光度法进行测定，总氮浓度采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法进行测定，总磷采用钼酸铵分光光度法进行测定，得到脱氮的结果如附图6所示：复合微生物菌剂F1在模拟污水培养基中培养8h后进入生长最大期，OD₆₀₀从0.04增长到0.39，无机氮随着细菌的生长而去除。0-4h，复合微生物菌剂F1首先利用氨氮进行氨氧化作用，4h后亚硝态氮和硝态氮也开始降低，12h后OD₆₀₀开始降低，无机氮的含量保持稳定，整个过程中总氮随着三氮(指氨氮、亚硝态氮和硝态氮)的减少而降低。复合微生物菌剂F1培养12h，氨氮从初始19.54mg·L^-1降至2.38mg·L^-1，亚硝态氮从初始20.70mg·L^-1降至11.57mg·L^-1，硝态氮从初始22.56mg·L^-1降至11.08mg·L^-1，总氮从初始62.80mg·L^-1降至23.82mg·L^-1。总氮降低说明，复合微生物菌剂F1的好氧反硝化作用将培养基的无机氮转化为氮气进入到大气中，总氮降解速率3.25mg·L^-1·h^-1。

测试例2

(1)使用灭菌枪头吸取2mL实施例3得到的复合微生物菌剂F2到98mL测试例1中的无菌模拟污水培养基R1；

(2)将添加了混合菌液F2的锥形瓶置于30℃、150r·min^-1的摇床中培养。定时取样测定OD₆₀₀、氨氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮、总氮浓度，重复3次取平均值，其中OD₆₀₀、氨氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮和总氮浓度的测试方法与测试例1的相同，得到的脱氮结果见附图7：复合微生物菌剂F2在模拟污水培养基中培养8h后进入生长最大期，OD₆₀₀从0.04增长到0.41，无机氮随着细菌的生长而去除。0-4h，复合微生物菌剂F2首先利用氨氮进行氨氧化作用，4h后亚硝态氮和硝态氮也开始降低，8h后OD₆₀₀开始降低，无机氮的含量保持稳定，整个过程中总氮随着三氮(指氨氮、亚硝态氮和硝态氮)的减少而降低。复合微生物菌剂F2培养12h，氨氮从初始19.54mg·L^-1降至1.52mg·L^-1，亚硝态氮从初始20.70mg·L^-1降至11.50mg·L^-1，硝态氮从初始22.56mg·L^-1降至9.58mg·L^-1，总氮从初始62.80mg·L^-1降至22.94mg·L^-1。总氮降低说明复合微生物菌剂F2的好氧反硝化作用将培养基的无机氮转化为氮气进入到大气中，总氮降解速率3.32mg·L^-1·h^-1。

下面对本发明的用于脱氮的复合微生物菌剂在不同的碳氮比的情况下的脱氮效果进行分析：

测试例3

(1)模拟污水培养基R2(g·L^-1)配置：(NH₄)₂SO₄ 0.1，NaNO₂ 0.1，KNO₃ 0.15，丁二酸钠0.21，K₂HPO₄ 0.25，NaCl 0.125，MgSO₄·7H₂O 0.125，MnSO₄·4H₂O 0.0025，FeSO₄·7H₂O0.0025。培养基使用蒸馏水配置，固体培养基加入1.5％～2％琼脂粉，培养基中的金属盐过滤灭菌，其他成分均在121℃条件下灭菌20min后备用；

(2)使用灭菌枪头吸取2mL实施例(3)得到的复合微生物菌剂F2到98mL步骤(1)中的无菌模拟污水培养基R2上并将该无菌模拟污水培养基R2置于锥形瓶中。

(3)脱氮测定：将步骤(2)添加了混合菌液F2的锥形瓶置于于30℃、150r·min^-1的摇床中培养48h；取样测定OD₆₀₀、氨氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮、总氮浓度，重复3次取平均值，测定指标按测试例1的方法进行，其中，得到的脱氮测试结果对应于附图8中的C/N1。

测试例4

将测试例3中的模拟污水培养基中的丁二酸钠的质量换成0.84，得到的模拟污水培养基为R3，其他步骤和条件与测试例3相同，得到的脱氮测试结果对应于附图8中的C/N4。

测试例5

将测试例3中的模拟污水培养基中的丁二酸钠的质量换成1.68，得到的模拟污水培养基为R5，其他步骤和条件与试例3相同，得到的脱氮测试结果对应于附图8中的C/N8。

测试例6

将测试例3中的模拟污水培养基中的丁二酸钠的质量换成2.52，得到的模拟污水培养基为R6，其他步骤和条件与试例3相同。得到的脱氮测试结果对应于附图8中的C/N12。

测试例7

将测试例3中的模拟污水培养基中的丁二酸钠的质量换成3.36，得到的模拟污水培养基为R7，其他步骤和条件与测试例3相同。得到的脱氮测试结果对应于附图8中的C/N16。

测试例8

将测试例3中的模拟污水培养基中的丁二酸钠的质量换成4.20，得到的模拟污水培养基为R8，其他步骤和条件与测试例3相同。得到的脱氮测试结果对应于附图8中的C/N20。

对照例1

将不添加菌液的模拟污水空白培养基置于30℃、150r·min^-1的摇床中培养。定时取样测定OD₆₀₀、氨氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮、总氮浓度，重复3次取平均值，测定与测试例3相同，得到的脱氮测试结果对应于附图8中的Control。

分析：测试例3-8、对照例1，从附图的相应位置看出，测试例3-7，OD₆₀₀的曲线变化表示复合微生物菌剂的生长随着碳氮比的增加而增加，与此同时，培养基中氨氮、硝态氮、亚硝态氮和总氮的浓度呈逐步降低趋势，测试例7-8，随着碳氮比增加，复合微生物菌剂的生长受抑，氨氮、硝态氮、亚硝态氮和总氮的去除也随之受到抑制。对照例1，结果说明未添加菌液的培养基中的无机氮含量没有变化。因此，有机碳对细胞生长和好氧反硝化速率起着至关重要的作用，极低或高碳浓度下反硝化效率都会降低，结合测试例1和2来看，实施例2的复合微生物菌剂具有最佳最快的脱氮效果，且碳氮比16是复合微生物菌剂F2的最适选择。

下面对本发明的复合微生物菌剂在原水中脱氮效果的测定

测试例9

(1)采集深圳典型黑臭水体上覆水样品，取400mL加入到无菌干燥的1L锥形瓶中；

(2)配置100g·L^-1的丁二酸钠母液，过滤除菌得到丁二酸钠无菌溶液；

(3)取8mL实施例2中得到的复合微生物菌剂F2使用生理盐水洗涤三次并以体积比为2％的添加量加入到步骤(1)的锥形瓶中，设置三个平行，置于30℃、150r·min^-1的摇床中测试。定时取样测定氨氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮、总氮、总磷浓度，重复3次取平均值，测定方法与测试例1的相同，并在氨氮和亚硝态氮全部硝化为硝态氮时，加入1.2mL步骤(2)得到的丁二酸钠无菌溶液，来提高反硝化效率，此时总氮浓度为160mg·L^-1，TC/TN＝16:1，结果如附图9及下表1所示(单位mg·L^-1)，其中，附图9为的虚线表示此时加入丁二酸钠无菌溶液：

表1：

测试10

(1)采集深圳典型黑臭水体上覆水样品，取400mL加入到无菌干燥的1L锥形瓶中，放入高压灭菌锅70℃，30min，然后迅速冷却至4℃。

(2)配置100g·L^-1的丁二酸钠母液，过滤除菌得到丁二酸钠无菌溶液；

(3)取8mL实施例2中得到的复合微生物菌剂F2使用生理盐水洗涤三次并以体积比为2％的添加量加入到步骤(1)的锥形瓶中，设置三个平行，置于30℃、150r·min^-1的摇床中测试。定时取样测定氨氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮、总氮、总磷浓度，重复3次取平均值，测定方法与测试例1的相同，并在氨氮和亚硝态氮全部硝化为硝态氮时，加入1.2mL步骤(2)得到的丁二酸钠无菌溶液，来提高反硝化效率，此时总氮浓度为160mg·L^-1，TC/TN＝16:1，结果如附图10及下表2所示(单位mg·L^-1)，其中，附图10为的虚线表示此时加入丁二酸钠无菌溶液：

表2:

分析：在测试例9中投加复合微生物菌剂后的0-3d，氨氮和总氮浓度略有上升，这是由于原水中土著微生物的固氮作用所导致的。3d后氨氮浓度显著降低，从4.75mg·L^-1降至0.65mg·L^-1，降解率高达86.32％。与此同时，亚硝酸盐的浓度从0.41mg·L^-1增加至5.22mg·L^-1。7-11d原水中亚硝态氮进一步转化为硝态氮，进一步说明在0-11d，原水中的微生物进行了氨氧化和硝化作用。测试例3-8说明有机碳对细胞生长和好氧反硝化速率起着至关重要的作用。因此，在11d时向原水中添加丁二酸钠，发现在12d时，测试例9和测试例10中的总氮浓度随着硝态氮的迅速降低而降低，且没有亚硝态氮的积累。从测试例9中可以看出，复合微生物菌剂F2在培养12d后灭菌原水总氮去除率可达到41.42％，之后无机氮保持稳定。但在原水中，硝态氮浓度持续增加，这是由于碳源的添加导致寡营养生态系统中的异养菌生长，原水微生物的硝化作用将氨氮转化为硝态氮。但硝态氮浓度没有按照理论降低反而持续升高，说明此时在原水中已没有足够的电子流为好氧反硝化细菌的生长提供足够的能量。测试例10中，更确切地说明碳源对复合微生物菌剂属于急速作用物质，适当的碳源对复合微生物菌剂的反硝化效率至关重要；

从表2和附图9、10可以看出复配后的复合微生物菌剂F2，可以很好地适应于原水中的土著微生物，在投加约15天后仍具有很好的降解氨氮效果，氨氮降解率达到89.56％，并在添加碳源后，总氮和硝态氮有显著降低；灭菌原水实验组说明有机碳可提高复合微生物菌剂的好氧反硝化效率。总的来说，复合微生物菌剂F2适应性强，脱氮效率高，稳定性较好，且测试例9和测试例10的氨氮指标处理，达到地表水Ⅳ类标准，故本发明可作为一种土著复合微生物菌剂的制备方法提供于市场。

以上公开的仅为本发明的一个或者几个具体实施例，但是本发明并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种用于脱氮的复合微生物菌剂，其特征在于，包括不动杆菌MZ5、不动杆菌 MZ16和假单胞菌MZ17，所述不动杆菌MZ5（Acinetobactersp.MZ5）、保藏编号为CCTCC No:M2019796；不动杆菌MZ16（Acinetobactersp.MZ16）、保藏编号为CCTCC No:M2019797；假单胞菌MZ17（Pseudomonas sp.MZ17）、保藏编号为CCTCC No:M2019798。

2.根据权利要求1所述的用于脱氮的复合微生物菌剂，其特征在于，还包括代尔夫特菌B7，所述代尔夫特菌B7（Delftiasp B7）、保藏编号为CCTCC No:M2019799。

3.根据权利要求2所述的用于脱氮的复合微生物菌剂，其特征在于，所述不动杆菌MZ5、不动杆菌 MZ16、假单胞菌MZ17和代尔夫特菌B7之间的活菌数比例为1:1:1:1。

4.一种用于脱氮的复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括：

（1）将不动杆菌MZ5接种到配置好的富集培养基中进行培养，得到活化的不动杆菌MZ5菌液；

（2）将步骤（1）得到的活化的不动杆菌MZ5菌液加入无菌离心管中进行离心，弃去上清液，接着向离心管中滴入无机溶剂进行重新悬浮得到不动杆菌MZ5重悬菌液；

（3）按步骤（1）和（2）的方法分别得到不动杆菌 MZ16重悬菌液和假单胞菌MZ17重悬菌液；

（4）取相同体积的步骤（2）和步骤（3）的不动杆菌MZ5、不动杆菌 MZ16和假单胞菌MZ17的重悬菌液，进行混合得到复合微生物菌剂。

5.一种用于脱氮的复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括：

（1）将不动杆菌MZ5接种到配置好的富集培养基中进行培养，得到活化的不动杆菌MZ5菌液；

（2）将步骤（1）得到的活化的不动杆菌MZ5菌液加入无菌离心管中进行离心，弃去上清液，接着向离心管中滴入无机溶剂进行重新悬浮得到不动杆菌MZ5重悬菌液；

（3）按步骤（1）和（2）的方法分别得到不动杆菌 MZ16重悬菌液、假单胞菌MZ17重悬菌液和代尔夫特菌B7重悬菌液；

（4）取相同体积的步骤（2）和步骤（3）的不动杆菌MZ5、不动杆菌 MZ16、假单胞菌MZ17和代尔夫特菌B7的重悬菌液，进行混合得到复合微生物菌剂。

6.根据权利要求5所述的用于脱氮的复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）的培养条件为：接种到配制好的100 mL富集培养基中，在30℃、180 r·min^-1的摇床中培养24 h；

根据权利要求4所述的用于脱氮的复合微生物菌剂的制备方法。

7.其特征在于，所述步骤（2）中包括：将脱氮微生物的活化菌液加入无菌离心管中进行离心，弃去上清液，接着向离心管中滴入无机溶剂进行重新悬浮，重复三次后，得到脱氮微生物的重悬菌液。

8.一种用于脱氮的复合微生物菌剂的应用，其特征在于，所述权利要求5-7得到的用于脱氮的复合微生物菌剂在河流水质净化的应用。

9.一种用于水体脱氮的微生物菌剂的应用，其特征在于，所述水体脱氮的微生物菌剂在水体碳氮比为1-20的情况下按水体体积的2%投加到水体中。

10.根据权利要求9所述的水体脱氮的方法，其特征在于，所述碳氮比为8-16。

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